共附生微生物抗肿瘤活性菌的筛选与鉴定_马君千.docx

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1、 共附生微生物抗肿瘤活性菌的筛选与鉴定 马君千 1王雪玲 1缪莉 h 2董昆明 1周晓见 1靳翠丽 1封克 1 扬州大学环境科学与工程学院，扬州 225127: 2屮国科学院上海药物研宂所新药研宂国家重点实验室，上海 201203) 摘要： 对分离自海绵和植物组织的一些微生物进行抗肿瘤活性菌株的筛选。采用 SRB法对 252 株微生物菌株的发酵提取 物进行了抗肿瘤活性的筛选。结果显示 . 28%的测试菌株在提取物浓度为 100 ng/faL时对 HeLa 细胞的抑制率在 50%以上 .经复 筛确定有 6 株细菌和 1株真菌具有良好且稳定的抗肿瘤活性 .其提取物在 100 ug/fnL时对 He

2、La 细胞的抑制率均在 80%以上 .其 中活性最高的两株菌 HM J-390 和YX-5 对 HeLa 细胞的 1C5(I分别为 40.56 ng/faL和 5.33 网 /fnL。 经 16S TDM 和 ITS TDM 序列分析， 鉴定 HM J-390 为 Cellulophaga sp. YX-5为 A甲 eTillussp.。 结果表明，作为抗肿瘤药物的潜在来源共附生微生物值得关注。 关 键 词 ： 共附生微生物 SRB 法 抗 肿 瘤 活 性 筛 选 Screening and Identification of the A ntitum or A ctive Strains f

3、rom Som eSym biotic M icrobialIsolates M a Junqia n1 W a ngXueling 1 Mia oLi1 2 DongKunm ing1 Zh ou X ia ojia n1 J in Cuill1 FengKe1 (School of Environm ental Science and Engineering, Yangzhou University， Yangzhou 225127 ； 2KeyLaboiatoiy of Diug Research, Shanghai Institute of M ateria M edica， Chin

4、ese Acad em y of Sciences, Shanghai 201203) Abstract: The antitum or activities of som e sym bbtic m icrobial strains isolated fiom som e sponge and plant tissues were screened. n total, the exttacts of 252 strains have been tested for their antitum or activity by using SRB cytotoxic assay. It showe

5、d the inhibition rates of 28% tested sttains againstH eLa cell were higher than 50% at the concentratbn of 100 p.g/4 L. Six bacterial strains and one fiingal strain were found exhibiting higher antitum or activity. The inhibition rates of their exttacts against H eLa cell were higher then 80% at the

6、 sam e tested concentration. The IC50 of 1wo m ostactive stiains H M J-390 and YX-5 were 40.56 p,g/fnL, and 5.33 p.g/4 L, respectively. These two strains were identified as Cellilophaga sp. and Aspeigillus sp. accoiding to the 16S iDNA and ITS iDNA sequence analysis. Our results indicated that sym b

7、iotic m icrobes could be regaided as im portant resources of natural antitum or diugs* Key w oids: Sym biotic m icrobe SRB cytotoxic assay A ntitum or activity Screening 药物治疗肿瘤已有几千年的历史。从 20 世纪 90 年代至今，人类在抗肿瘤药物的研发上有了长足 的发展，其特点是从天然产物中寻找活性成分进而 将高效的活性成分开发成药物。 动植物体内的共附生微生物因其所处宿主环境 的不同而显示出较为独特的代谢途径与生理活性。

8、很多文献报道指出，许多以前认为是由植物和无脊 椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生的微 生物产生的，共附生微生物亦被认为是天然活性产 物的重要来源。目前，从共附生微生物中己分离到 多种具有较强生物活性的物质，包括毒素、抗生 素、抗肿瘤活性物质、酶类 、色素等，并有许多已 着手工业化生产。 St ier ie 等 1从短叶红豆杉的树皮 中分离出能产紫杉醇的内生真菌； Li 等 2从来自弗 罗里达榧树 Toneya t axifolia 的内生真菌 Pesta lotbp sia n icioqx oa 中分离到的 torr eya nic acid， 可以诱导细 胞 凋 亡 ， 具 有 很

9、强 的 抗 肿 瘤 活 性 。Malnst tdm 等 3 从委内瑞拉 M och im a 海湾加勒比海采集的海绵中分 收稿日期： 2012-05-07 基金项目：国家自然科学基金项目 （ 41076097, 41006097， 41106113)，新药研究国家重点实验室开放基金项目 （ SMM1106KF-09)，江苏省 高校自然科学基金项目 （ 10KJB170013, 11KJB170011) 作者简介：马君千，男，硕士研究生，研究方向：共附生微生物抗肿瘤活性菌株的筛选及其活性物质分离； E-mail:mj3mj528 通讯作者：缪莉，女，博士研究生，研究方向：海洋生物资源开发与利用

10、； E-mail:m iaoli 离得到裸孢壳属真菌 Em ericella variecobr， 并从该菌 产物中分到了酚醚类化合物。该化合物对乳腺癌细 胞有选择性细胞毒活性。目前动植物共附生微生物 活性产物在抗肿瘤药物开发方面己显露出良好的开 发前景。 本研究对实验室保存的分离自银杏的内生真菌 和分离自美国圣磺岛海域的海绵共生细菌共 252 株 菌进行发酵和代谢产物的提取，以 HeLa 细胞为筛 选模型，采用 SRB 法对提取物进行抗肿瘤活性的筛 选。得到了 7 株具有良好且稳定的抗肿瘤活性的菌 株，其中细菌 HM J-390 和真菌 YX-5 的活性产物在 较低的测试浓度下仍有较好的抗

11、肿瘤 活性，因此选 定这两株菌作鉴定并将进一步对其活性物质进行化 学分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源实验室保存的分离自美国盛磺岛 海域的海绵共生细菌和分离自银杏的植物内生真菌 共252 株。 1.1.2 活化及发酵培养基 MB 细菌培养基 （ 1L): 蛋白胨 5.0 g;酵母粉 1.0 g;柠檬酸铁 0.1 g; NaCl 19.45 g； MgCl25.9g； MgS043.24 g； CaCl2 1.8 g ； KC1 0.55g， pH7.4-7.6。 PDA 真菌培养基 （ 1 L) : 土豆 200 g 切小块加 水煮沸 1 h 后过滤，加水至 1 L，

12、加葡萄糖 20 g，pH 天然。 GP Y 真菌培养基 （ 1 L):葡萄糖 20.0 g;蛋白胨 5.0 g ;酵母浸膏 5.0 g， pH 天然。 固体培养基中添加 1.5%琼脂粉。 1.1.3 活性筛选材料人宫颈癌 HeLa 细胞购自上海 复祥生物科技有限公司。 1.1.4 细胞培养基 RPMI-1640 细胞培养基 （ GI- BC0)加入 10%灭活的新生牛血清和 1%的多抗母 液，添加 Na HCO jPHEP ES 并调节 pH7.1-7.3,过 滤除菌后 4 C 保存。 1.2 方法 1.2.1菌株活化 1.2.1.1 海绵共生细菌的活化将冻存管解冻后， 将菌液接试管中的液体

13、M B 培养基培养 2 d 后用接种 环在固体培养基上划线培养，菌落形成后即可接液 体培养基发酵。 1.2.1.2 植物内生真菌的活化冻存菌株解冻后， 用镊子将含有菌丝的菌块夹出，贴放于固体 P DA 培 养基上， 25 C 培养 3-5 d 后即可接液体培养基发酵。 1.2.2 发酵培养 1.2.2.1 海绵共生细菌的发酵将活化的菌株接种 于 100 mL MB 培养基中，锥形瓶摇床 30 C, 130 11 in 振荡培养 3 d。 1.2.2.2 植物内生 真菌的发酵将活化所得菌株挖 块接种于 100 mL PDA 培养基中，锥形瓶摇床25 C, 115 rAii 振荡培养 5 d。 复

14、筛时采用 GPY培养基， 其余发酵条件相同。 1.2.3 测试样品制备细菌发酵菌液加入含 5%丙 酮的等体积乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层旋转蒸发后 浓缩至干，加入 DM S0 配制成 20 m g/fn L 的测试样品 以供测定抗肿瘤活性。真菌发酵液过滤掉菌丝，加 入等体积乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层旋转蒸发后浓 缩至干，加入 D M S0 配制成 20 m g/fn L 的测试样品以 供测定抗肿瘤活性。 1.2.4 抗肿瘤活性筛选 SR B 法以其敏感、准确、 特别适用于大规模药物筛选等优点，美国国立肿瘤 研宄所 （ NCI)已经将其列为标准的抗肿瘤筛选方法 之一 4。本研宄采用 SRB 法对微生物

15、发酵提取的活 性产物进行抗肿瘤活性的初筛和复筛。 将处于对数生长期的 HeLa 细胞消化后稀释成 6X104 个 AL 细胞悬液，接种在 96孔板中，接种量 每孔 80 叫，设接 80 汕纯培养基的孔为空白对照。 孵育 24 h 后，每孔加入含有 500 pgAL 测试样品的 培养基 20叫，测试样品终浓度为 100 pgnL， 设只 添加 20 叫含有 0.5% DM SO 培养基的孔为阴性对照， 每个处理设 3 个重复。继续培养 48 h 后首先在倒置 生物显微镜观察细胞的形态，判断细胞的生长情况 和凋亡情况。 镜检后， 96 孔板每孔添加预冷的 20%三氯乙 酸溶液 100 叫后在 4

16、C 固定 lh,之后用去离子水清 洗 5 遍后吹干，加入 4mgiiLSRB 溶液 100 叫，染 色15 m in 后用 1%乙酸溶液清洗 5 遍以除去未结合 的染料，再加 l mmoll Tris 缓冲溶液 100 叫。待颜 色均匀后酶标仪 492 nm 波长处测定各孔 0D 值，并 计算抑制率。 抑制率 （ )=(阴性对照组 0 D 值 -测试组 0D值 ） /(阴性对照组 0D 值 -空白组 0D 值 ） X 100% 半致死浓度 ICM= g-1 Xm-i ( SP-0.5), Xm : 设计的最大浓度的对数值； i:各浓度倍比浓度的对 数值 ； SP :各组生长抑制率之和； 0.5

17、 :经验常数。 1.2.5抗肿瘤活性菌株的鉴定 1.2.5.1扫描电镜形态观察收集菌体于小离心管 中，加入预冷的戊二醛于 4 C 固定 2 h， 离心后用超 纯水洗净并再次离心。依此加入 30%、 50%、 70%、 80%、 90%和 95%乙醇溶液脱水，每次脱水 20 min, 并离心。再用100%乙醇两次脱水 30min 后离心。 倒去乙醇加入醋酸戊酯置换过夜。取出样品置于观 测台上，待干燥后镀金，在场发射扫描电镜下观察 菌体形态。 1.2.5.2 iDNA 序列的测定与分析采用改良的 CT- AB 5法提取细菌基因组 DNA， 以细菌通用引物 (5 -AGAGTTTGATCCTGGCT

18、CAG-3 ） 和（ 5 -GGTTA- CCTTGTTACGACTT-3 ） 进行 PCR 扩增；采用 SDS- CTAB 6法提取真菌基因组 DNA ， 以 真 菌 通 用 引 物 HS1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ） 和 HS4 (5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ） 进行 P CR 扩增。核 酸序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司进行。 将所得序列与 GenBank 数据库中的序列进行 BLAST 分析，选取相似性较高的菌株序列与所得序列以 (： 11313&进行多重序列比对。通过 16八 5.0 软件， 以邻接法 （ Neigh bor-

19、Joining)构建系统进化树。 2 结果 2.1 抗肿瘤活性筛选 2.1.1 初筛采用镜检和 SR B 法筛选结合的方式， 对252 株菌的发酵液粗提物进行抗肿瘤活性的初筛。 结果显示，在测试浓度为 100 (xg/fnL 时，对 HeLa细 胞的抑制率高于 50%的菌株有 72 株，占总测试菌 株数的 28.97%。其中有 28 株菌对 H eLa 细胞的抑制 率高于 75% ,占总数的 11.1% ,另有 10 株菌的抑制 率高于 85%。 2.1.2 复筛将初筛抑制率高于 75%的 28 株菌株 按1.2.2中所述的发酵方法进行再次发酵后对提取 产物的活性进行复筛，结果显示，在 100

20、 ggAL 的 测试浓度时有 16 株菌对 H eL a 细胞的抑制率仍在 75%以上，显示出较好的稳定性。其中有 6 株海绵 共生 细 菌 HMJ-71 、 HMJ-147 、 HMJ-390 、HMJ-447、 HM J-566、 HM J-657 和 1 株植物内生真菌 YX-5 的初 筛、复筛的抑制率都在 85%以上（表 1)。 表 1 复筛中抗肿瘤活性菌株对 H eLa 细胞的 细胞毒活性 （ n = 3， x 土 s) 菌号 抑制率（ ) 菌号 抑制率（ ) HM J-32 78.41 0.77 H M J-554 78.03 1.46 HM J-65 77.60 0.39 H M

21、 J-566 86.30 0.93 HM J-71 91.712.38 H M J-657 98.23 2.76 HM J-87 78.42 4.69 H M J-704 75.904.56 HM J-106 77.87 5.72 HM J-714 81.90 + 5.78 HM J-147 85.25+1.47 H M J-725 75.80 3.42 HM J-390 90.63 4.92 H M J-748 78.63 + 3.62 HM J-447 90.25+1.53 YX-5 96.87 2.73 2.1.3 梯度测试选取上述抑制率在 85%以上的 6 株海绵共生细菌 HMJ-71

22、、 HMJ-147、 HMJ-390、 HMJ-447、 HMJ-566、 HMJ-657 以及真菌 YX-5 再次 发酵提取活性产物，测试样品按终浓度 100、75、 50 和 25 ggA L 4 个浓度梯度测试抗肿瘤活性。 结果（表 2)显示，在上述 4 个测试浓度下， 6 株海绵共生细菌活性产物的细胞抑制活性与测试浓 度几乎成正相关 ， HM J-390 的抑制活性稍优于其他 5 株，而真菌 YX-5 的活性产物的细胞抑制活性效果 显著，在所有测试浓度下，其对 H eLa 细胞的抑制 率均在 90%以上。 因真菌 YX-5 的活性产物在 100、 75、 50 和25 pg/fnL 4

23、 个浓度下的细胞抑制率无明显差异，因此再 对其进行对半稀释，测试其在 12、 6 和 3卩 gAL 3 个 浓度下的抗肿瘤活性。结果（图 1)显示，当浓度 低于 12ggAL 时，抑制活性急剧下降，计算其 IC5 ( J 为 5.33 (x g/fn L。 由表 2 可以看出，细菌 HM J-390和真菌 YX-5 在 100 ggAL 的测试浓度时都具有超过 90%的抑制 率 。 HM J-390 则在 50 pg/fnL 的测试浓度时有50%以 上的抑制率，而 YX-5 在 12 pgAL 的测试浓度时依 然具有很好的抑制效果，因此选择细菌 H M J-390 和 真菌 YX-5 为目标菌

24、株进行了菌种鉴定。 表 2高活性菌株的发酵提取物在不同浓度下对 HeLa 细胞的抑制活性 （ n = 3, i 土 s) 菌号 抑制率（ ) IC5 (jxg/fnL) 25 jxg/fn L 50 ig/ia L 75 (j.g/fn L 100 (j.g/fn L HM J-71 16.67 5.43 43.37+6.02 63.772.13 96.60 5.29 47.17 HM J-147 13.78 3.74 36.09+2.76 47.30 + 4.68 86.50 3.28 59.28 H M J-390 23.472.16 51.873.79 86.90 2.39 94.90

25、2.83 40.56 H M J-447 15.48 2.69 34.18+2.38 49.97 5.74 82.07+3.91 61.00 H M J-566 3.90 士 1.77 26.162.51 52.89 3.94 83.774.15 66.52 H M J-657 26.36 3.86 38.785.23 63.77 4.83 81.40 土 2.59 51.12 YX-5 92.67 3.04 93.75 2.89 95.46 3.65 97.102.47 25.00 图 1 不同浓度下 YX-5对 HeLa细胞的细胞毒活性 2.2 目标菌株的鉴定 2.2.1 扫描电镜形态观察

26、细菌 HMJ-390 在 MB 固 体培养基表面的菌落呈白色，圆状，表面湿润。场 发射扫描电镜图（图 2)显示，细菌 HM J-390 为杆菌， 无芽孢结构、无鞭毛、长度大约 10，、宽 l|im。 图 2 菌株 HMJ-390扫描电镜图 真菌 YX-5 在 PDA 固体培养表面培养，初始为 白色，后变为黄绿色，孢子呈黄色，培养基背面无色。 真菌 YX-5 的场发射扫描电镜（图 3)显示，分生孢 子梗一端有近球形的顶囊，上面放射状分布着小梗， 孢子近似球形，表面粗糙，直径大约 4 pm。 2.2.2细菌 HMJ-390的鉴定将提取的细菌 HMJ- 390 的基因组进行 16S iDNA 序列的

27、 PCR 扩增，增 图 3 菌株 YX-5 扫描电镜图 大特异片段的含量以满足测序的需要。采用琼脂糖 凝胶电泳检测 DNA,测定结果（图 4)显示，细菌 H M J-390 的 PCR 产物片段大小为 1 163 bp。 图 4 菌株 HMJ-390的 PCR产物电泳图 经测序得到的 16S iDNA 序列结果和 GenBank 数据库中的序列对比，进行 BLAST 分析，选取 9 株相似性较高的菌株与 HM J-390 以 Clistak 进行 多重序列比对，并通过 MEGA5.0 软件，以邻接法 (Neighbor-Joining)构建系统进化树并进行分析。由 构建的系统进化树（图 5)可

28、知，细菌 HMJ-390 的 16SiDNA 序列与 Cellilophaga 属细菌的基因序列相 似性最高，可确定为 Cellibphagasp.,结合其电镜 观察的菌株形态，初步判定 HM J-390为 Cellibphaga 2.2.3 真菌 YX-5 的鉴定将提取的真菌 YX-5 的基 fucicobo因组进行 iDNA ITS 序列的 PCR 扩增，増大特异片 0.5 图 5 细菌 HMJ-390 的 16S rDNA序列系统进化树 段的含量以满足测序的需要。采用琼脂糖凝胶电泳 检测 DNA， 结果（图 6)显示， YX-5 的 PCR 产物 片段大小为 522 bp。 1. YX-

29、5 ; M. DNA Maiter 图 6 菌株 YX-5的 PCR产物电泳图 经测序得到的 ITS 序列结果和 G enBank 数据 库中的序列对比，进行 BLAST 分析，选取 12 株相 似性较高的菌株与 TX-5 以 Ckstak 进行多重序列 比对，并通过 MEG A 5.0 软件，以邻接法 （ Neighborjoining) 构建系统进化树并进行分析。由构建的系 统进化树（图7)可知真菌 YX-5 的 ITS 序列与曲 霉属 (AeigHlis)的黄曲霉 （ AgjeigiUusflavus)以 及米曲霉 （ Agjeig 江lusoiyzae)基因序列的相似性都 很高，可确定

30、为曲霉属菌 （ Aspergillus sp.)， 与菌株 A 印 eigUlis oiyzae isolate C Y 130 的序列相似度最高。 结合电镜观察的真菌形态，初步判定 YX-5 为米曲 霉 （ AieigiUusoiyzae)。 3 讨论 本试验以 HeLa 宫颈癌细胞为筛选模型，采用 镜检形态学观察和 SRB 法相结合的方式对微生物 发酵提取的活性产物进行抗肿瘤活性的筛选，可以 初步确定各菌株抗肿瘤活性的强弱。试验结果表 明，在该筛选模型下，海绵共生细菌和植物内生真 菌中对 HeLa细胞抑制率超过 50%的菌株比例高达 28.97%。筛选结果与本课题组王雪玲 7采用 MTT

31、法 8筛选的结果相比较，发现具有良好的相关性， 与黄银久等 9对 SRB与 M TT 法结果相关性研宄的 结论一致， SRB 法和 M TT 法可互相验证其筛选结果。 焦杰颖等 1 曾对我国南海的海绵共附生微生物分 离筛选过具抗肿瘤活性的真菌，其结果显示该海域 海绵共附生真菌的抗肿瘤活性率达 14% ,稍低于本 试验筛选的海绵细菌的抗肿瘤活性率，可见海绵细 菌同样是寻找抗肿瘤活性物质的重要来源。 本试验通过复筛以及梯度测试，发现海绵细菌 HM J-390 和植物内生真菌 YX-5 具有很好的抗肿瘤活 性，因此选取这两株菌进行了鉴定。目前以基因序 列为基础的分子鉴定和分类己在微生物中得到广泛 应

32、用，鉴定真菌，特别是 ITS 序列具有较高的突变 速率，已经被各国研宄人员公认为是生物类群种间 的比较研宄中较好的指标 11。根据序列测定确定银 杏内生真菌YX-5为曲霉属菌，结合形态观察初步 断定为米曲霉。之后还将对其进行规模发酵提取产 图 7 菌株 YX-5 的 ITS 序列进化树 物，利用硅胶柱层析及 HPLC 等分离方法寻找目标 活性化合物并进行进一步的研究。 我国拥有丰富的海绵资源和植物资源，但是对 其共附生微生物活性产物的研究开发并未充分，银 杏虽然能产一些抗肿瘤活性 物质，但其内生真菌的 抗肿瘤活性研究却也很少有报道。据估计，迄今研 究和鉴定的海洋微生物不到整个海洋微生物总数的

33、5% 12。而且对海洋植物的内生菌研究很少，这些 共附生微生物很有可能产生结构新颖并具有一定价 值的生物活性物质。因此，利用我国这些资源的优势， 研究开发天然药物具有重要的意义。 4 结论 本研究采用细胞毒 SRB 法，对 252株共附生微 生物菌株进行了抗肿瘤活性的筛选。发现 6 株海绵 共生细菌和 1 株植物内生真菌具有良好且稳定的抗 肿瘤活性。经鉴定，活性最高的两株菌 HMJ-390 和 YX-5分别为卩 蜜纤维属菌 （ Cellubphagasp.)和曲霉 属菌（ A)eigilJussp.)， 为进一步研究其抗肿瘤活性 物质提供了依据。 参考文献 1 Stierle A, Strob

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