采用基因芯片筛选肝癌转移相关基因的研究.pdf

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1、中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)405 采用基因芯片筛选肝癌转移相关基因的研究 第二军医大学东方肝胆外科医院综合治疗一科 王 葵 沈 锋 施乐华 阎振林 卫立信 丛文铭 孟超 摘要摘要 目的：用人基因表达谱 cDNA 芯片研究原发性肝癌(HCC)与癌旁正常肝组织的基因表达差异并进行验证。方法：利用含有人 5075 个基因 cDNA 的人表达谱芯片，将 6 例原发性肝癌患者分为伴和不伴门静脉癌栓两组(A 组和 B 组，每组 n=3)，分别取癌组织、癌栓组织和癌旁正常肝组织，分别抽提总 mRNA,反转录为 cDNA 与芯片进行杂交，对比 mRNA 表达的差异。在差异表达的基

2、因中，选取 9 个基因在 41 例肝癌病人癌和癌旁正常肝组织进行 RT-PCR 实验验证其表达情况。结果：癌组织及癌栓组织与癌旁正常肝组织比较，伴门脉癌栓组(A 组)癌组织与不伴门脉癌栓组(B 组)癌组织中上调表达基因分别有 169 和 170 个，两组下调表达基因分别有349 和 364 个，其中两组共同上调表达基因中 135 个，共同下调表达基因 305 个。两组癌组织分别表达上调和下调的基因之中，表达明显上调的基因(ratio3)无癌栓组有 3 个、癌栓组有 5 个，而明显下调的(ratio2).The especially down-regulated genes of group A

3、 and group B were 59 and 46(ratio3).The especially up-regulated genes were 4 and 10(ratio 或=2 为上调基因，ratio2 上调基因有 132 个(Ratio2)，共同表达的下调基因有 306 个(Ratio3)AB 组有 3 个、CD 组有 5 个，而明显下调的(ratio0.4)AB 组有 4 个、CD 组有 10 个(表 2)。CD 组这些不同的基因表达可能涉及了门静脉癌栓的形成、维持、发展各个环节。表 2 肝癌伴和不伴门静脉癌栓患者癌组织共同基因表达谱的变化(部分)Gene Bank Access

4、ion No.Description Ratio of expression AF289489 AL136942 aspartate beta-hydroxylase lysosomal associated protein transmembrane 4 beta(LAPTM4B)12.25-12.78 10.77-11.07 NM_003846 peroxisomal biogenesis factor 11B(PEX11B)6.883-7.408 NM_016175 sequestosome 1(SQSTM1)6.291-6.373 NM_005998 chaperonin contai

5、ning TCP1，subunit 3(gamma)4.381-5.931 NM_001428 enolase 1，(alpha)(ENO1)5.078-5.079 NM_006149 lectin，galactoside-binding，soluble，4(galectin 4)(LGALS4)3.887-4.339 NM_000567 C-reactive protein，pentraxin-related(CRP)4.222-4.596 BC001425 CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B(CKS1B)3.849-4.185 AL3599

6、16 serine/threonine kinase 35(STK35)4.104-4.196 NM_000157 glucosidase，beta；acid(includes glucosylceramidase)(GBA)4.003-4.296 NM_012433 splicing factor 3b，subunit 1，155kDa(SF3B1)3.825-3.992 NM_012458 translocase of inner mitochondrial membrane 13 homolog(yeast)(TIMM13)3.758-3.849 NM_003091 small nucl

7、ear ribonucleoprotein polypeptides B and B1(SNRPB)3.795-3.922 NM_001353 aldo-keto reductase family 1，member C1 (dihydrodiol dehydrogenase 1；20-alpha(3-alpha)-hydroxysteroid dehydrogenase)(AKR1C1)3.732-3.743 NM_003029 SHC(Src homology 2 domain containing)transforming protein 1(SHC1)3.719-3.803 NM_006

8、855 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)endoplasmic reticulum protein retention receptor 3(KDELR3)，transcript variant 1 3.705-3.959 NM_001304 carboxypeptidase D(CPD)3.452-3.687 NM_006837 COP9 constitutive photomorphogenic homolog subunit 5(Arabidopsis)(COPS5)3.175-3.612 NM_000773*cytochrome P450，family 2，subfamily

9、 E，polypeptide 1(CYP2E1)0.0414-0.0439 NM_001875*carbamoyl-phosphate synthetase 1，mitochondrial(CPS1)0.0588-0.0632 M10942*metallothionein 2A(MT2A)0.0644-0.0651 NM_004455*exostoses(multiple)-like 1(EXTL1)0.0653-0.0703 NM_003665*ficolin(collagen/fibrinogen domain containing)3 (Hakata antigen)(FCN3)，tra

10、nscript variant 1 0.0686-0.0733*means down-regulated，the others are up-regulated 410 中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)图一 基因表达 cluster 分析图(By cluster software)(二)RT-PCR 结果 1.ASPH、FACL4、MT-1X、HSF1、MAP4K4、DAP3、RRM1、UCHL1、POSTN 在肝癌和癌旁组织中的表达结果。N T N T N T N T N T N T N T N T ASPH(1-22)FACL4(19-4)-actin -actin

11、 中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)411 N T N T N T N T N T N T N T N T MT-1X(43-75)HSF1(52-87)-actin -actin N T N T N T N T N T P N T P N T P MAP4K4(94-79)DAP3(58-100)-actin -actin N T N T N T N T N T N T N T N T UCHL1(70-91)POSTN(1-22)-actin -actin N T P N T P N T P IARS(58-100)-actin 图 2 ASPH、FACL4、MT-1

12、X、HSF1、MAP4K4、DAP3、RRM1、UCHL1、POSTN 的 RT-PCR 电泳图，括号中编号为标本编号。(N：癌旁正常肝组织；T：癌组织；P：癌栓组织。)2.组织标本 RT-PCR 分析 应用 SPSS11.0 统计软件包。肝细胞癌与近癌肝组织，门静脉主干癌栓和肝内肝癌病灶中 mRNA 表达的比较采用 t 检验。结果见表 3。412 中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)表 3 ASPH 等基因 RT-PCR 分析结果 基因名称基因名称 RT-PCR比值比值 P 值值 癌组织癌组织 癌旁组织癌旁组织 ASPH 2.51.1 1.00.7 P0.01 MT1X

13、0.1350.098 0.9870.311 P0.01 FACL4 0.9290.609 0.5390.430 P0.01 MAP4K4 0.9790.571 0.4860.311 P0.05 HSF1 0.9820.609 0.5160.411 P0.01 DAP3 0.7900.356 0.4160.230 P0.05 POSTN 0.7540.629 0.6300.489 P0.05 IARS 0.7320.520 0.7200.513 P0.05 UCHL1 0.1900.168 0.1130.098 P0.05 三、讨论 基因芯片技术自建立以来在肿瘤研究中得到广泛应用，5在肝癌中筛选

14、相关基因的研究亦有一些重要发现，但是肿瘤本身发生、发展、转移复发是一个多基因、多步骤的过程，具体涉及的基因可能多达几十种甚至上百种，因此利用芯片筛选出的基因往往数量大、种类多，通过分析我们发现肝癌中表达升高的基因涉及代谢酶类、转录翻译蛋白、结构蛋白、细胞信号传导通路相关蛋白等，表达低的基因也大部分是细胞保护性酶和蛋白类如金属硫蛋白等.因此，芯片虽然是很方便、快速筛选的工具，但其结果与芯片基因种类、肿瘤生物学状态有关，故要到有重大差异的基因尚需进一步改进思路。而且众多表达基因异常可能只是细胞恶变的“果”，而并不一定是“因”，即细胞已经成为具有无限增殖能力的肿瘤细胞后，基因芯片捕捉到的仅仅是高度增

15、殖或相对静止期的基因表达状态.现在亦有人称其为“基因标志”(gene signature)，即一种肿瘤会有一系列基因状态异常，这些基因与肿瘤种类和个体遗传背景有关，其中的共性就是该类肿瘤的标志性基因变化.因此，对于个体肿瘤使用基因芯片虽然价格昂贵，但也许是今后肿瘤个体化治疗的基础。我们主要选择芯片筛选的共同表达异常(高表达和低表达)基因作为研究对象，明确针对肝癌中较为广泛的异常基因。ASPH 全名天冬氨酸盐 羟化酶(aspartate-hydroxylase、aspartyl-hydroxylase)基因，也称为 BAH、HAAH。在人类 ASPH 基因区域编码产生的 757 氨基酸产物(is

16、oform a)具有酶活性，即称为 aspartate-hydroxylase(BAH)。该酶在牛、小鼠、大鼠和人类中其具有高度保守特性。6，7人 ASPH 基因位于 8q12，共有 2448 个碱基，区域可编码产生五个同源蛋白：isoform a(757aa，BAH，有酶活性)、isoform b(299aa，junctate/humbug，膜钙离子结合蛋白)、isoform c(313aa，无催化活性)、isoform d(210aa junctin，与钙离子肌浆网内释放有关)、isoform e(225aa，junctin isoform 1，同上)。在不同的组织中各个同源蛋白的表达水平

17、有明显差异，鼠和人类中心肌、骨骼肌、子宫、肾上腺、脑等组织中主要产物(BAHjunctatejunctin)表达水平较高，而肝脏、胰腺、胃肠道、胸腺等组织为低水平表达。8junctatejunctin 主要表达于心肌和骨骼肌的内质网膜和肌浆网膜上，分别作为重要的钙离子结合蛋白和膜结构蛋白存在，与钙离子的瞬时释放密切相关 9。ASPH 的酶活性产物是一种有 prolyl 和 lysyl 羟化酶作用的依赖 酮基的二氧化酶，在胶原生物合成中起关键作用。10在铁离子存在下对含有 EGF(表皮生长因子)样区域中的天门冬氨酸或天门冬酰胺残基起羟化作用(转录后水平)，11而这种含有天门冬氨酸/天门冬酰胺残基

18、羟化的区域广泛存在于一些蛋白质中，例如维生素 K 影响的凝集因子、，12，13与肿瘤、生长发育等有关的 Notch 受体和配体，14中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)413 受体酪氨酸激酶 tyro-3/Axl 家族的配体，15细胞外基质结构蛋白等等。Asph 在肝癌等肿瘤中表达增高，是否和 Notch 信号途径有关尚待研究。Asph 敲除的裸鼠多种组织蛋白表达缺失，尤其在肝组织检测不到其产物酶活性存在、凝集因子无法活化，雌性裸鼠生育能力下降，而且裸鼠出现并指、面部畸形、腭裂等等。这些软组织融合发育缺陷与 Notch 配体 sertate-2(jagged-2)基因突变导

19、致 EGF 样区域天门冬氨酸残基改变有关。另有报道人的 Notch 配体 Jagged-1 有 16 个 EGF 样区域其中 10 个需要由 ASPH 羟化。16Notch 基因家族成员的 EGF 样区域转录后修饰对 Notch 信号途径发挥作用有明显影响，而 Notch 家族蛋白在细胞的增殖、分化及凋亡调控中具有基本作用，最近发现其与 MAPK 激活的肿瘤血管生成有关，17此外在神经胶质瘤中 Notch1 及配体 Delta-like-1、Jagged-1 表达增高。18受体酪氨酸激酶信号传导途径证实在许多肿瘤中有维持、促进恶性增生的能力，而 Asph 在受体酪氨酸激酶 tyro-3/Axl

20、 家族的配体 EGF样区域羟化中起作用，可能是 Asph 在肿瘤中表达增高发挥的作用。另外，Asph 基因编码产生的同源蛋白 junctate 和 junctin，也逐渐发现在肌浆网膜等处是重要的钙离子结合蛋白和相应的膜结构蛋白，协同其他蛋白与钙离子瞬时释放、细胞内外钙离子浓度调解密切相关。19在一些人类肿瘤组织中发现 ASPH 表达水平增高，如神经纤维瘤、肝胆管细胞癌、胰腺癌、大肠癌肝转移、肝细胞癌等。但其与肝细胞癌的发生发展、转移复发究竟关系如何尚无进一步研究。因此，肝癌组织中 ASPH 的表达较近癌肝组织增高是明确的，与临床、病理、预后等有何关系尚待进一步研究。MT-1X 编码金属硫蛋白

21、家族 1x 蛋白(Metallothionein Isoform 1 X)，广泛存在于人体组织中，与重金属的转运有关。近年来发现许多肿瘤包括肝癌中 MT 家族基因表达明显改变，MT-1X 表达下调亦有报道；而在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中 MT 家族基因表达以上调为主。20，21研究亦发现一种肿瘤组织中金属硫蛋白家族基因变化常涉及多个成员，且与肿瘤的发生密切相关 22，23。MAP4K4 编码丝裂原激活的蛋白四激酶 4(mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4)，属于 STE20 蛋白激酶家族，其人和鼠的同源体亦称 HPK/HG

22、K(hepatocyte progenitor kinase-like/germinal center kinase-like kinase)和 germinal center kinase(GCK)-激酶/Nck-相互作用激酶。通过使氨基酸磷酸化参与蛋白激酶的级联反应，与 GTP 酶作用调节其功能。可以调节 c-Jun N-末端激酶(JNK)，机制是通过其 C-末端的反义同源区域与 GTP 结合的 Rap2(Ras 家族的小 GTP 酶结合蛋白)相互作用，Rap2 再加强MAP4K4 活化 JNK 的过程。近来有研究发现其在培养细胞的变形和黏附、侵袭生长中有促进作用，主要是通过其剪接变异体发

23、挥功能。24，25但是其具体在肝癌伴门静脉癌栓中高度表达的形式和作用方式尚不清楚，有待于进一步研究。FACL4 基因定位在人的染色体 Xq23，编码一个 75kDa 酶，是一种花生四烯酸依赖的同功酶，它属于酰基辅酶 A 连接酶家族。通过 FACL4 产生的酰基辅酶 A 产物是哺乳类细胞的一个基本功能。FACL 用辅酶 A 催化长链脂肪酸产生长链酰基辅酶 A。在人类组织中有五种 FACL 同功酶。在这些酶中，FACL4在人的类固醇组织中如胎盘、脑、卵巢、脾和肾上腺皮质中高度表达，而在人类的胃肠系统包括肝脏中几乎不表达。FACL4 与 PHC 肿瘤发生相关，与肝癌中 FACL4 在 cAMP，p3

24、8 MAPK 通道中的调节有关。应用 PCR 及免疫组化染色方法分析 FACL4 mRNA 和蛋白在肝癌中过表达(与癌旁组织中相比较)，FACL4 mRNA 和蛋白分别是 41.7%和 37.5%过表达。正常成人及胎儿肝组织显示弱表达或检测不出，而 10 例肝硬化病中有 3 例(30%)是弱表达。另有报道 FACL4 在结肠腺癌中的表达升高。26-30本研究显示 FACL4 与原发性肝癌的发生密切相关。HSF1 的发现源于 1982 年研究人员在 HSP70 基因中 TATA 5端上游发现有一回文结构，即5-CT-GAA-TTC-AG-3，此结构被称为热休克元件(heat shock elem

25、ent，HSE)。随后分离得到一个特异的转录因子，即热休克因子(heat shock transcription factor，HSF。人 HSF 家族包括三个成员：HSF1、HSF2414 中国临床肿瘤学教育专辑中国临床肿瘤学教育专辑(2007)和 HSF4。其中 HSF1 是最有代表性、最具有完全意义的 HSF，可在环境改变或病理生理性应激条件下迅速激活转录，增加 HSP 表达；而其它 HSF 则不然。热休克因子 1 是最早被发现的热休克转录因子，在热休克反应中调控热休克蛋白的诱导表达在正常状态下，HSF1 以无活性的单体形式存在于胞浆中。在应激态下，HSF1 被激活，迅速转变为三聚体。热

26、休克反应的调控主要发生于转录和转录后水平，一般以转录水平调控为主。近年研究发现，HSF1 作为转录因子能够直接抑制 TNF 及 IL1 等因子的表达，从而在热休克反应调控促炎因子的表达中发挥重要作用。目前关于 HSF1 在肿瘤发生中的作用很少有文献报道。有报道在肝癌细胞系中热休克反应阻断细胞因子诱发的 NO 合成酶基因转录。此外，最近还发现 HSF1的磷酸化过少对于多药耐药基因 1(MDR1)的表达转录后水平调控有影响，激活 MDR1 表达。31-33本研究发现 HSF1 在癌组织中表达较近癌肝组织中增高，提示 HSF1 与原发性肝癌的发生密切相关。而 HSF1表达水平与患者的性别，年龄，肿瘤

27、大小，包膜完整与否，分级，癌栓形成及血清 AFP 水平等未见明显相关性，因此 HSF1 可能与肝癌的转移无关。DAP3 名为死亡相关蛋白(death associated protein 3)，哺乳动物线粒体核糖体蛋白，为核基因编码，在线粒体内帮助蛋白合成。线粒体核糖体 Mammalian 由 28S 小亚基和 39S 大亚基组成。和原核生物相反他们有 75%的蛋白成分。而且原核细胞中有 5S rRNA。不同种属核糖体蛋白的序列 或则是性质差别很大，以防止同源序列的轻易识别。该基因编码 28S 蛋白亚基，并且参与 TNF、Fas 配体、干扰素 起始的凋亡途径。该蛋白有可能结合 ATP/GTP

28、并且是线粒体核蛋白体的功能成分。该基因存在 5 UTR 的剪切变异体且编码同样的蛋白。染色体 1q 2q 上发现有其假基因。DAP3 在细胞分离造成的失巢凋亡和凋亡诱导中发挥作用。在细胞死亡线粒体碎片到达顶点时发挥作用。高 DAP3 表达与人胸腺瘤分期有关。DAP3与 FADD(Fas-associated death domain)的相互作用在细胞崩溃之后。34-36DAP3 在小肝癌一组中高表达可能与肝癌早期有关，但是在肝癌细胞系中表达差异并不明显，41 例肝癌及近癌组织中表达无明显规律，是否在小肝癌在中发挥作用需进一步研究。综上所述，利用基因芯片筛选的结果，对肝癌组织中明显表达异常的基因

29、在更多病例(41 例)中验证其表达，发现部分基因表达并无一致性倾向，如 POSTN 的表达时高时低，可能与肿瘤异质性有关，其在四株肝癌细胞中无表达，说明与肝癌关系并不一定密切；另一部分基因则与芯片发现结果一致，如 ASPH、FACL4、MT-1X 在大多数癌组织中确实有明显高表达或低表达(RNA 水平)，在肝癌细胞系中表达亦增高，说明这些基因可能与肝癌密切相关。因此，上述结果验证了基因芯片的研究结果，提示 ASPH 基因等确实与肝癌密切相关，可进一步研究该基因在肝癌生长中的作用及机制。参考文献 1 Parkin DM.Global cancer statistics in the year 2

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