人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究_王卓.docx

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1、 DOI: 10.13313/j .issn. 1673-4890.2013.09.019 人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究 王卓 于慧美 2,刘鼎、高微 2,田义新 (1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130033; 2.吉林大学白求恩医学院，吉林长春 130021) 0商要 目的：从人参中分离获得人参内生真菌，并初步探讨其代谢产物粗提物的抗肿瘤活性。方法：研宄 利用筛选培养基从 6年生人参中分离内生真菌，并利用小琼脂块培养法和分子生物学方法对获得的人参内生真菌进 行鉴定，利用 MTT法检测其体外抗肿瘤活性。结果：从人参中共计分离得到内生真菌 28株，其中 2株活性较好。 结论：从药

2、用植物人参中分离得到的人参内生真菌具有潜在的抗肿瘤活性，为进一步开发抗肿瘤药物提供新的研宄 对象。 关键词 人参；内生真菌；分离；生物活性；抗肿瘤 人参 Pa/iax C. A. Meyer为五加科人参属 植物，以干燥根及根茎入药，始载于神农本草 经，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养 血，安神益智功能，是吉林省的道地药材 &。众所 周知，人参是传统的名贵药材，含有丰富的人参皂 苷、多种氨基酸、多糖及挥发油等成分，对人体的 中枢神经系统、心血管系统、免疫系统及泌尿生殖 系统等具有广泛的作用，能增强机体对有害刺激的 抵抗力3_5。 内生真菌是生活于健康植物的组织细胞间或细 胞内，且不会造成

3、明显疾病症状的真菌 6。目前的 研宄发现，从多种植物中都可以分离获得内生真 菌 7。在自然生态系统中，生活在健康植物内部组 织的内生真菌与宿主表现出复杂的相互作用，两者 建立了一个和谐的共生系统并从中受益。植物内生 真菌可以产生丰富的代谢产物，其中很多与宿主植 物的代谢产物相同或相类似，因此 己成为寻找天然 药物的重要来源。如今，有关植物内生菌的研宄报 道有很多，但是关于人参内生真菌的相关研宄却相 对较少。 作者从药用植物人参中分离获得人参内生真菌， 并进行体外抗肿瘤活性研宄，结果显示，人参内生 真菌代谢产物具有潜在的抗肿瘤活性，这为进一步 开发抗肿瘤药物提供了新的研宄对象。 1材料 1.1植

4、物材料及细胞株 人参于 2012年 10月 18日采自吉林省抚松县二 道河镇人参生产基地， 6年生；人宫颈癌细胞株 (Hela)保存于吉林农业大学中药材学院。 1.2真菌培养基及细胞培养液 真菌分离、鉴定的培养基包括 PDA固体培养 基、DRBC培养基（含氯霉素、链霉素等细菌抗生 素）、PDB液体培养液；细胞培养液采用含 10%小 牛血清的IMDM培养液。 2方法 2.1植物内生真菌的分离 挑取新鲜人参，去掉泥土、芦头、参须等后， 用蒸馏水冲洗干净。在超净工作台中用 75%乙醇 浸泡 1 min，然后用 5 % NaCIO溶液浸泡 5 min, 再用 75%乙醇浸泡 30 s， 最后用无菌水冲

5、洗 4 次；用无菌的滤纸吸干人参表面的水分，用消过 毒的手术刀片将人参切成 5 mm X 5 mm X 5 mm见 方的小块 接种于 DRBC培养基上，每个培养皿中 接种数个小块，每个小块间隔距离大于 3 cm， 置 于 28 T培养箱中培养。待观察到从植物小块内 部长出真菌菌丝时，将其转移到新的PDA培养基 上继续培养。 M讯作者 田义新， Tel: (0431) 84533304， E-mail: y. X. tian2003 163. (.om 2.2植物内生真菌的鉴定 利用小琼脂块培养法和分子生物学方法对分离 的植物内生真菌进行鉴定。小琼脂块接种真菌菌丝 及孢子，于 28 C培养箱中培

6、养，随时观察真菌生长 情况，根据菌丝、孢子生长情况对真菌进行归属鉴 定；提取真菌基因组 DNA， 利用 ITS通用引物，扩 增真菌的 ITS基因序列，扩增产物测序后通过与 NCBI序列数据库进行同源性比对后，对其归属进行 进一步的鉴定 s。 2.3植物内生真菌代谢产物粗体物的提取 于 1 L培养瓶中接种 300 mL PDB液体培养液， 将分离出的人参内生真菌接种于培养液中，置于 28 C摇床中培养 15 d。 采用四层纱布过滤除去菌丝 体，获得的滤液采用乙酸乙酯萃取 3次，合并萃取 液并浓缩，旋转蒸发为干粉， 即为乙酸乙酯粗提物， 称重。 2.4植物内生菌抗肿瘤活性研究 乙酸乙酯粗提物经二甲

7、基亚砜 （ DMS0)溶解 后，用 PBS以倍比稀释法稀释粗提物。采用 MTT法 测定粗提物的抗肿瘤活性。 96孔板中按 1 x 104每孔 接种细胞， 37丈， 5% C02细胞培养箱培养 20 24 h。 待细胞融合率达到 80%，加入不同浓度的乙 酸乙酯粗提物，于细胞培养箱中继续培养 24 h， 每孔 中加入20 |xL 5 mg.mL 1的 MTT作用 4 h， 吸净培养 液，加入 100 JJX DMS0溶解形成的甲臜 （ fomiazan)， 于 570 nm测定吸光度值。 2.5数据统计分析 利用 SPSS17. 0软件对数据结果进行方差分析。 3结果 3.1人参内生真菌分离、鉴

8、定 经过在 DRBC培养基上 4 21 d的培养，共从 人参组织块中分离出人参内生真菌 28株，利用小琼 脂块培养法和分子生物学方法对获得的人参内生真 菌进行鉴定。结果显示，人参中包含的真菌包括镰 刀菌、毛霉、木霉、地霉、青霉等。其中，镰刀菌 为人参内生真菌中的优势种群，占到分离获得的人 参内生真菌总数的 46. 4%，见表 1。 3.2人参内生真菌抗肿瘤活性研宄 将从人参内生真菌组织块中分离出的 28株人 参内生真菌置于 PDB液体 28丈摇床中发酵培养 15 d后，经纱布过滤除去菌丝体，获得的滤液采用 乙酸乙酯萃取，旋转蒸发后浓缩为干粉， DMS0 溶解。 MTT检测结果发现 ， DMS0

9、 终 浓 度 为 1 x 10_5 mmol*L一，对细胞生存率无影响。 28株人参内生真 菌乙酸乙酯粗提物中有两株对人宫颈癌 Hela细胞的 IC5。达到 60 140 fjLg.mL 1 (见图 1)。综合前人的研 究结果，这两株内生真菌粗提物的抗肿瘤活性较理 想，可进行进一步的分离纯化，以分析获得其抗肿 瘤活性。 表 1人参内生真菌的分离鉴定 菌株 种属 同源性 /% GS4 尖孢镰刀菌 98 GS4 镰刀菌 99 GS-3 烟曲霉 97 GS4 半裸镰刀菌 98 GS-5 毛霉 99 GS-6 烟曲霉 98 GSJ 镰刀菌 98 GS-8 烟曲霉 99 GS-9 未知 1 99 GS4

10、0 镰刀菌 97 GS41 茄病镰刀菌 96 GS42 茄病镰刀菌 99 GS43 镰刀菌 97 GS44 茄病镰刀菌 98 GS45 木霉 98 GS46 茄病镰刀菌 99 GS47 未知 2 99 GS48 茄病镰刀菌 97 GS49 地霉 97 GSO 青霉 98 GSl 青霉 98 GS2 附球菌 99 GS3 未知 3 99 GS4 镰刀菌 96 GS名 5 烟曲霉 98 GS6 未知 4 97 GS7 半裸镰刀菌 99 GS8 青霉 98 人 #内生 H菌乙酸乙酯 ffl提物浓度 图 1 MTT法检测人参内生真菌乙酸乙酯粗提物抗肿瘤活性 4讨论 人参作为传统的名贵药用植物，其在医学

11、上的 功效早己为人们所熟知，但是从资源利用的角度来 说，人参同其他名贵珍稀药用植物一样存在资源少、 价格昂贵等弊端，而人参内生菌的深入研宄将缓解 甚至可以解决这一问题。在长期与宿主的协同进化 过程中，内生真菌与宿主植物为了保持一个稳定的 共生关系，可以产生与宿主植物相似或相同的化学 成分，人参内生菌完全可能成为替代人参而获取人 参皂苷成分的新资源。 近年来，研究者逐渐认识到了植物内生细菌及 内生真菌是获得新活性物质的重要来源之一 7。植 物内生真菌研究是人们利用微生物对 人参资源开发 和研究的一种新的思路和方式 69。植物内生真菌由 于其特殊的生存环境，次生代谢产物丰富，可能会 产生一些结构新

12、颖、活性显著的新成分 1 。有专家 认为内生真菌是次级代谢产物的 “ 金库 ” ，且内生 真菌是一片未被完全探索和开发的领域。因此，从 内生真菌发现新的活性化合物己引起研究者极大的 兴趣 1 。许多从内生真菌分离纯化的新化合物被发 现具有抗真菌、抗细菌、抗病毒和抗原虫的作用。 人参内生真菌的次生代谢产物是否丰富，是否 含有结构新颖的活性化合物，是否具有抗肿瘤等生 物活性，是我们关注的焦 点。我们选择人参进行内 生真菌分类学及次生代谢产物研究，为揭示我国人 参内生真菌的种类多样性及其代谢产物的化学结构和 生物活性，以及开发医药新资源提供依据。研宄中 获得的 GS4及 GS42两株内生真菌次生代谢

13、产物具 有良好的体外抗肿瘤活性，提示我们可以对其进行 进一步的代谢产物的分离纯化，寻找具有抗肿瘤活 性的成分。 综上，该研宄利用筛选培养基从 6年生人参中 分离 28株内生真菌，利用小琼脂块培养法和分子生 物学方法对获得的人参内生真菌进行鉴定，并通过 MTT法初步筛选获得了体外抗肿瘤活性较好的 2株 人参内生真 菌，为进一步开发抗肿瘤药物提供了新 的研宄对象。 参考文献 1 吴锦忠，李向高，杨继祥 .红参与鲜人参挥发油成分比较 研宄D.海峡药学， 1996,8 (1) :5名 . 2 Christensen L P. G insenosides Chemistry, Biosynthesis,

14、 Analysis， ami Potential Health Effects j . Advances in Food and Nutrition Research,2009,55 (2) :l-99. 3 Cho K M, Hong S Y, Lee S M, et al. Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens j . Microbial Ecology,2007,54 (2) :341-351. M 窦德强，靳玲，陈英杰 .人参的化学成分及药理

15、活性的研 宄进展与展望 D.沈阳药科大学学报， 1999, 16 (2): 151456. 5 姚新生，徐绥绪，陈英杰 .人参成分的研宄 / M.彭司 勋 .中国药学年鉴 .上海：第二军医大学出版社， 1991: 2345. 6 庞蕾，严铸云，梁俊玉，等 .内生真菌在中药中的应用前 景 D.时珍国医国药， 2005， 16(3) :242443. 7 黎万奎，胡之璧 .内生菌与天然药物 D.中国天然药物， 2005,3(4) : 1934991. 8 陈风毛 .真菌 ITS区序列结构及应用 J.林业科技开 发， 2007,21 (2) :5-7. 9 HuangWY, CaiYZ, Xing

16、J， et al. A potential antioxidant resource ： endophytic fungi from medicinal plants j . Economic Botany,2007,61 :14-30. 10 Hasegawa H, Uchiyama M. Antimetastatic efficacy of orally administered ginsenoside Rbl in dependence on intestinal bacterial hydrolyzing potential and significance of treatment

17、with an active bacterial metabolite j . Planta Med 1998 64:696-700. Isolation and Antitumor Activity Research of Endophytic Fungi from Panax ginseng WANGZhuo1, YUHuinei2, LIU Ding1, GAO Wei2, TIAN Yicin1* (1. College of TCM Materialsy Jilin Agricultural Universityf Changchun 130033? China, 2. Norman

18、 Bethune College of Medicine i Jilin University f Changchun 130021, China) Abstract Objective: To isolate endophytic fungi from Panax ginseng and study their antitumor activity. Methods: Endophytic fungi were isolated from 6ear-old Panax ginseng. Their antitumor activities were analyzed by MTT metho

19、d in vitro. Results: 28 endophytic fungi were isolated from Panax ginsengf and 2 of them showed potential antitumor activity. Conclusion: Endophytic fungi isolated from Panax ginseng has antitumor activities， could be potential antitumor drugs. Key words Panax ginseng, Endophytic fungi; Isolation; Bioactivity； Antitumor activity (收稿日期 20130342)