人结肠上皮双向凝胶电泳参考图谱的建立及衰老相关蛋白质的筛选-朱果.docx

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1、中南大学 硕士学位论文 人结肠上皮双向凝胶电泳参考图谱的建立及衰老相 筛选 姓名：朱果 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：陈主初 20050501 摘要 结肠是人体的重要脏器之一，其上皮在生命活动中承担着吸收、 分泌和防御等重要功能。同时，随着衰老的发生发展，不仅结肠上皮 的各项生理功能逐渐减退 ,而且包括恶性肿瘤在内的多种肠道疾病的 发病率显著升高。因此，分析和鉴定结肠上皮的蛋白质表达情况，建 立结肠上皮的蛋白质表达谱，筛选结肠上皮的衰老相关蛋白质，不仅 有助于从整体的分子水平阐明结肠上皮的生理功能，而且有利于揭示 结肠上皮衰老及衰老相关疾病的发生机制，以便为延缓结肠上

2、皮的衰 老，以及为衰老相关的结肠疾病的预防和治疗提供科学依据。蛋白质 组学的出现及其研究技术的发展和完善为这一研究提供了新的思路 和方法，使我们在蛋白质的整体水平上研究结肠上皮的功能和衰老的 分子机制成为可能。 本研究应用双向凝胶电泳技术 （ two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)分别分离青年人及老年人的正常结肠上皮的 总蛋白质后，经银染显色、图像分析、识别两者共表达及表达差异的 蛋白质点， 应用基 质辅助 激光解 吸电离 飞行时 间质谱 （ Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-f

3、light mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析得到肽 质量指 纹图谱 （ peptide mass fingerprint, PMF),再经 Mascot软件搜索 SWISS-PROT 和 NCBI 蛋白质数据库 鉴定蛋白质 ,并利用生物信息 学资源对所鉴定蛋白质的功能和亚细胞 定位等进行分析。 本研究首次建立了人类正常结肠上皮的双向凝胶电泳参考图谱， 鉴定了 162 种非冗余蛋白质，并对这 162 种蛋白质按功能和亚细胞定位 进行了初步分类；发现了 37 种结肠上皮蛋白质存在翻译后修饰，并分 析预测了蛋白质 peptidyl-prolylcis-transi

4、someraseA(PPIA)可发生 N 端乙酰化修饰 ;通过比较青年组和老年组结肠上皮双向凝胶电泳图谱 的差异，发现并鉴定了 19 个结肠上皮衰老相关的蛋白质，提示线粒体 功能受损、抗氧化能力下降是结肠上皮 衰老的重要原因，其中有 3 个 蛋白质可能与衰老的结肠上皮对结肠癌易感相关。本文结果为研究结 肠上皮的生理功能及揭示结肠上皮的衰老机制提供了有意义的数据 和新线索。 关键 词人结肠上皮，衰老，蛋白质组，双向凝胶电泳，质谱 ABSTRACT Colon is an important human organ and its epithelium plays a central role i

5、n many physiological functions including digestion, secretion and defense. Analyzing and establishing its protein expression profile will help to elucidate the physiological state and functions of colonic epithelium comprehensively and systematically at molecular level and lay a foundation for analy

6、sis of differentially expressed proteins under different physilogical or pathological states. The aging process of human colonic epithelium involves a slow decline in physiological vigor and an increasing susceptibility to age-related diseases, especially, colon cancer. In order to provide scientifi

7、c bases for postponing the aging process of colonic epithelium, diagnosing and treating aging related colon diseases, it is necessary to investigate the aging mechanism of the colonic epithelium. Proteomics offers new tools for aging research and help probe the mechanisms of aging process and aging-

8、related colon diseases. The total proteins of normal colonic epithelial tissue from young and old men were seperated by two-dimensional electrophoresis(2-DE)_ After silver staining, image scanning and PDQuest software analysis, the co-expressed and differentially expressed protein spots were incised

9、 from gels and digested by trypsin in gel. Then matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were used for peptides mass analysis. The acquired peptide mass fingerprints (PMFs) were used to search for matches in SWISS-PROT and NCBI databases with Mascot

10、 software. The functions and subcellular locations of identified proteins were further analysed according to bioinformatic resources. The 2-DE reference map of human colonic epithelium was established for the first time. 209 protein spots representing 162 non-redudent kinds of proteins were identifi

11、ed. The identified proteins were categorized into several protein groups according to their functions or subcellular locations. 37 kinds of proteins of human colonic epithelium were found to have posttranslational modifications (PTM) and peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A (PPIA) was predicted to

12、be acetylated at N-terminus by comparing its different PMFs and by bioinformatic technique. Through comparative proteomic analysis of colonic epithelium between young and old men, 19 aging related proteins were identified by MS. They indicate that injury of mitochondrial function and decline of anti

13、oxidant capability may be important reasons for the aging of human colonic epithelium. 3 of the identified aging related proteins may be involved in aging colonic epitheliums susceptibility to cancer. These data provides useful information for the study of colonic epithelial physiology and its aging

14、 mechanism. KEY WORDS human colonic epithelium, aging, proteomics, 2-DE, mass spectrometry 本课题受如下基金资助： 国家自然科学 基金项目 （ No. 30240056, 30370642); 教育部跨世纪优秀人才培养计划基金 （ 教育部科技函 200248) 英文缩写 2-DE ACN ACTH BCA BSA CHCA CHAPS DTT EDTA ESI-MS HSP IEF IPG MALDI-T OF-MS Mr MS PAGE pi PFF PMF PMSF PPIA PST 缩 写 词 简

15、表 英文名称 two-dimensional gel electrophoresis acetonitrile adrenocorticotropic hormone bicinchoninic acid bovine serum albumin a -cyano-4-hydroxycinnamic acid 3-(3-cho1amidopropyl) dimethyl ammonio-l -propanesulfonate dithiothreitol ethylenediaminetetra-aceticacid electrospray ionization mass spectro-

16、metry heat shock protein isoelectric focusing immobilized pH gradient matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight mass spectrometry molecular weight mass spectrometry polyacrylamide gel electrophoresis isoelectric point peptide fragmentation fingerprinting peptide mass fingerprinting

17、 phenylmethan-sulfonylfluorid peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A peptide sequence tag 中文名称 双向凝胶电泳 乙腈 促肾上腺皮质激素 二喹啉甲酸 牛血清白蛋白 a -氰基 4-羟基肉桂 酸 丙基硫酸盐 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 电喷雾质谱 热休克蛋白 等电聚焦 固相化pH 梯度 基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱 分子量 质谱 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电点 肽碎片指纹图谱 肽质量指纹图谱 苯甲基磺酰氟 肽基脯氨酰顺反异构 酶A 肤序列标签 PTM posttranslational modificat

18、ion 翻译后修饰 ROS reactive oxygen species 活性氧分子 SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 SDS-PAG sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide 十二烷基磺酸钠聚丙 E gel electrophoresis 烯酰胺凝胶电泳 SOD superoxide dismutase 超氧化物歧化酶 TEMEDN,N,Nf,N-tetra methyl ethylene diamine 四甲基乙烯基二胺 TFA trifluoroacetic acid 三氟乙酸 Tris tris(hydroxyme

19、thyl) aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 TrxS2 thioredoxin 硫氧化还原蛋白 Vhrs voltage hours 电压伏小时 原 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定， S 卩：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以

20、公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 关于学位论文使用授权说明 作者签名 : 贵枣 .导师签名 i 前言 结肠是人体的重要脏器之一，其上皮在生命活动中承担着吸收、分泌和防 御等重要功能。同时，随着衰老的发生发展，结肠上皮的各种生理功能不仅会 逐渐减退，而且包括恶性肿瘤在内的多种肠道疾病的发病率显著增高。这些疾 病严重的威胁着人类的健康和生命。 克隆病、溃疡性结肠炎、结肠癌等肠道疾病的发病机制以及衰老在结肠癌 等疾病中的所起作用至今仍然不明，尚待深入研究。探明这些疾病的发病机理 首先需要阐明结肠上皮的正常生理

21、功能。结肠上皮的生理功能以往多从器官和 细胞水平描述，但细胞是由分子构成的，从分子水平阐明结肠上皮的生理功能， 构建结肠上皮的分子网络图谱，将是彻底揭示结肠疾病和结肠上皮衰老发生机 制的基础。蛋白质是生理功能的执行分子，因此构建蛋白质的网络图谱，包括 蛋白质组成、蛋白质的丰度、蛋白质的定位、蛋白质的翻译后修饰、蛋白质间 的相互作用对于阐明结肠疾病和结肠上皮衰老的发生机制尤为重要。而分析结 肠上皮的蛋白质组成，建立其蛋白质表达谱是关键的第一步。 衰老 (aging)通常被定义为机体的正常生理功能随着年龄的增长而缓慢减退 的过程。结肠上皮同样会而随着年龄的增长而出现生理功能逐渐减退，同时恶 性肿瘤

22、等多种肠道疾病的发病率显著升高。流行病学调查和临床资料均显示， 年龄因素在结肠癌的发病中具有重要作用，在 50 岁以后出现结肠癌的发病高峰 |1。因此有必要开展结肠上皮衰老的分子机理研究，为衰老相关的结肠疾病的预 防和治疗提供科学依据。 人类对自身衰老的认识和抗衰老的探索是一个古老而又热门课题。二十世 纪以来，随着生物技术、分子生物学和现代医学的发展，人类对衰老的认识在 细胞和分 子水平取得长足的进步。 突变累积论 ”（ mutation accumulation)、 基因多效论 （ pleiotropy)以及 弃车保帅论 ”（ disposable soma)等衰老理论 从进化的角度解释了衰

23、老现象存在的原因 2;自由基学说 （ free-radical theory) 则阐释了氧自由基与衰老的关系 3;对酵母、线虫、果蝇和大鼠等模式生物的衰 老研究揭示了热量限制 （ caloric restriction)、基因沉默 （ gene silencing)等现 象与衰老的关系，并发现了许多重要的调控 衰老的基因、蛋白及信号传导通路， 如 da2 基因、 Sir2 蛋白，和 insulin/IGF-1 信号通路 4;对 Werner 综合征和 Hutchinson-Gilford 综合征等人类早老综合征的探索为衰老研究提供了许多重要 的线索 5;对肿瘤、心脑血管疾病、Alzheimer

24、 病等衰老相关疾病的研究揭示了 衰老在这些疾病中的重要作用 61。 针对结肠上皮的衰老机制，国内外也已开展了许多相关的研究， Lopes 等人 观察到衰老大鼠的结肠平滑肌细胞线粒体的形态和功能都发生了改变 7】； 11 等 人发现，随着年龄的增加，消化道上皮的 DNA 突变频率增加，而以小肠和结肠 的突变频率最高 Tsurudome 等发现，在老年人的结肠癌组织中 8-羟基脱氧鸟 嘌呤(8-hydroxydeoxyguanosine)的水平升高，提示氧自由基对结肠上皮细胞 DNA 的损伤程度增加 9;我们先前的研究发现衰老结肠上皮细胞通过 G1/S 期限制点 加速，细胞周期加快，细胞增生活跃

25、1同时衰老结肠上皮细胞的凋亡受到抑 制 11;另外，衰老结肠上皮细胞的某些基因的甲基化水平也发生了改变，如部 分抑癌基因和 DNA 修复基因的甲基化水平增高而表达下降 【 12。 以往的这些研究虽然揭示了一些结肠上皮衰老以及衰老结肠上皮对癌症等 肠道疾病易感的机理，但是这些研究多数是从某个或某几个基因出发，而结肠 上皮的衰老是一个渐进的、多基因、多因素参与的复杂过程。另外，这些研究 多集中在 DNA 和RNA 水平，但由于基因转录和翻译水平的复杂性， DNA 和 RNA 水平的变化并不能完全反映蛋白质水平的变化，而且蛋白质的翻译后修饰 状况、蛋白质的相互作用、蛋白质的动态变化等信息仅 通过基因

26、组研究是无法 获知的【 13。为了彻底的揭示结肠上皮衰老的机制，我们必须实时地监测结肠上 皮细胞所有表达蛋白质的丰度、修饰状态、亚细胞定位、与其他蛋白质的相互 作用情况以及蛋白质的这些状态参数在衰老的结肠上皮细胞中是如何发生变化 的。 传统的单个蛋白质的研究方式和研究技术显然已无法满足对结肠上皮细胞 的蛋白质进行大规模、高通量、全方位研究的要求，而蛋白质组学 （ Proteomics) 理论及技术的出现和发展满足了这种需求。蛋白质组 （ Proteome) 词最先由澳 大利亚学者Marc Wilkins 及 Williams 于 1994 年提出，它是指一种生物或一种细 胞、组织在特定时间和空

27、间上表达的所有蛋白质 14。蛋白质组学则以蛋白质组 为研究对象，从一个整体、动态的水平上来研究蛋白质的组成与活动规律，因 此，可望更全面真实地揭示结肠上皮细胞的正常生理活动以及疾病发生发展过 程的本质。蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学是蛋白质组学的三 大基石。 蛋白质的分离是蛋白质组学研究的前提和关键，好的分离技术应尽可能多的 分离和展示全部蛋白质，以满足蛋白质组学研究的高通量的要求。尽管有许多 新的分离技术，如多维色谱、毛细管等电聚焦等均已建立，但双向凝胶电泳 (two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)仍然是目前蛋白质组学研究中的 主要分离方法。 2-DE 技术由0 Farrell 等于 1975 年最早建立 115】，其基本原理