张慧芹开题报告.docx

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1、广西医科大学科学型争论生学位论文选题报告及论文工作打算课题名称海带多糖对内皮损伤家兔 TF、TFPI 分泌和表达的影响攻读学位及类型 医学硕士学号202320233争论生姓名张慧芹学科专业生理年级2023 级 1 班所在学院根底学院导师姓名谢露开 题 时 间2023年 4月 18日一、摘要课题争论目的、理论意义和实际应用价值1. 争论内皮损伤家兔血栓与TF、TFPI 水平的关系2. 争论海带多糖L01 对内皮损伤家兔TF、TFPI 水平的影响,3. 从保护内皮细胞的角度,探究海带多糖 L01 的抗血栓作用机制. 为海洋药物的开发利用和抗血栓药物的进一步争论供给理论依据.世界上心脑血管疾病的死亡

2、率始终居于其次位,其中血栓性疾病是发病率,致残率和死亡率最高的.血栓形成的病理根底是内皮细胞损伤或功能紊乱. 成人血管内皮细胞外表积可达3000，其重量约720g。内皮细胞在维持凝血、抗凝和纤溶系统之间的动态平衡中具有重要作用。其抗凝功能主要表达在：(1)内皮细胞外表的凝血酶调整蛋白(TM)与凝血酶结合形成的复合物活化血循环中的蛋白C(PC)，生成的活化PC(APC)通过降解凝血因子V a和a发挥其抗凝作用；(2)合成和释放蛋白s，关心PC的活化；(3)内皮细胞血管腔外表类肝素样分子协同抗凝血酶(AT)的抗凝作用；(4)合成和释放组织因子途径抑制、(TFPI)。TFPI是TF唯一的自然抑制蛋白

3、；(5)通过合成和释放前列腺素(PGI2和PGE2)和NO，阻挡血小板聚拢及活化纤溶酶原。其促纤溶功能主要表达在：(1)合成和释放尿激酶(u-PA)和组织型纤溶酶原活化物(t-PA)；(2)表达纤溶酶原及尿激酶受体(u-PAR)；(3)合成和释放纤溶酶原活化抑制物-1(PAI-1)和凝血酶活化的纤溶抑制物(TAFI)，调整纤溶系统。其促凝功能主要表达在：(1)合成的vwF是主要的血小板粘附蛋白； (2)细胞膜外表适于凝血因子复合物的集合；(3)合成和释放的TF是凝血途径的主要启动因子。正常状况下，内皮细胞以抗凝血功能占主导地位，籍此维持血液的流通。当内皮细胞受损或功能障碍时其促凝与抗凝功能之间

4、的平衡发生紊乱表现为抗凝功能减弱或消逝,促凝功能充分表达,最终导致血栓的形成.常用的抗栓溶栓药物如抗血小板药阿司匹林、抗凝药肝素、溶栓药物链激酶和尿激酶等用于心脑血管疾病的预防和治疗，可降低发生率和死亡的危急，但由于这些药物不良反响突出如出血、消化道病症、血小板削减、过敏等和药物抵抗性问题而不能取得满足的疗效。尽管多种型的药物已有开发，在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进展改进和提高，但目前大多处于试验阶段。因此，查找和研制效果好、副作用小、自然的抗栓、溶栓治疗药物，对于更有效地治疗严峻危害人类安康的心血管疾病具有格外重要的意义。本课题从探讨内皮损伤家兔血栓与TF、TFPI 水平的关系以及L01

5、 对内皮损伤家兔 TF、TFPI 水平的影响,从保护内皮细胞的角度,探究海带多糖 L01 的抗血栓作用机制.为海洋药物的开发利用奠定试验根底。二、文献综述国内外争论现状、进展动态；所阅文献的查阅范围及手段近年来，随着科技的进展和医药界的需求，多糖的争论越来越深入，海带多糖的争论也倍受关注。药理和临床争论说明，海带大局部生物活性与其主要成分多糖亲热相关。课题组通过自主争论，从广西海带中分别纯化得到一个的多糖组分L01，前期的争论已证明L01能够抑制血栓形成，减轻大剂量肾上腺素致大鼠内皮细胞的损伤程度， 抑制内皮细胞损伤动物血小板的粘附聚拢，降低血浆vWF、TXB2、GMP-140水平和提高6-K

6、eto-PGF1a水平。血浆组织因子(tissue factor-TF)即凝血因子 ，是凝血过程中重要的启动因子，也是唯一不存在于正常人血浆中的凝血因子。在正常生理状况下，直接与循环血液接触的血细胞和内皮细胞不表达TF，只有血管损伤时，TF才暴露出来。它既是凝血因子 (FVII)的细胞外表受体，又是FVII或激活的FVII(FVII a)的关心因子。它和FVIIa形成复合物，进而激活凝血因子X(FX)或凝血因子(FIX)，同时启动内外两条凝血途径，在生理性止血中起到重要作用。TF的活性受其生理抑制剂TFPI的调控。组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibito

7、r，TFPI)由血管内皮细胞合成，存在于内皮细胞、血小板和血浆中。TFPI是含有3个功能区的糖蛋白，分子中的其次个功能区(K2)能与FX a结合， 抑制FX a活性，抑制凝血酶原转变为凝血酶。另外，TFPIF X a复合物通过第一个功能区(K1)与TFFVI a结合形成四聚体，使TF、FVII a灭活，不能催化FX的活化，削减FX a的形成，进一步抑制了凝血酶的生成。其第三个功能区具有肝素结合部位(Gly212Phe243)，在肝素作用下可促进TFPI与因子X a更快速、更高效结合。大量的争论说明:TF除了在止血方面的作用外，还与炎症有关的败血症、很多心血管疾病如动脉粥样硬化(AS)、急性冠脉

8、综合征以及某些疾病的血栓栓塞性并发症亲热相关。 TFPI与一些血栓性疾病,弥散行血管内凝血(DIC),炎症,休克,恶性肿瘤等有亲热关系.文献报道：TF是动脉粥样硬化斑块形成血栓的关键因素，在AS患者中，TF表达上升起到了显著致病作用。同时在血栓形成过程中，血栓形成部位TFPI的活性明显高于远离血栓形成部位TFPI的活性，而且血栓再形成过程中，血浆TFPI浓度下降，说明血栓形成时有TFPI参与， 并且在血栓形成过程中TFPI进展性消耗，是TFPI在体内作为自然抗凝物的重要证据。本课题就通过海带多糖对内皮损伤家兔TF和TFPI的影响进一步探讨海带多糖对损伤的内皮细胞的药理活性。二、所查阅文献的范围

9、和手段：检索工具名称数据库及期刊 起止年限中文生物医学期刊数据库CMCC1993-2023中文科技期刊篇明数据库1989-2023中国生物医学文献光盘数据库 CBM1979-2023国家科技图书文献中心(NSTL)1978-2023广 西 科 学 技 术 研 究 成 果 公 报 / 广 西 区 科 学 技 术 委 员 会1986-2023清华同方(CNKI)1994-2023PubMed1992-2023三、争论内容1. 主要争论内容及拟解决的问题主要争论内容：(1) 建立内皮损伤性血栓家兔模型,观看L01 对血栓形成的影响.(2) 检测血浆TF,TFPI 浓度和活性.(3) 测定凝血系统活性

10、和纤维蛋白溶解活性及血小板聚拢功能.(4) 电镜观看血管切片内皮损伤和血栓状况.拟解决的关键问题：内皮损伤家兔血栓与TF,TFPI 水平的关系，L01 对内皮损伤家兔血栓 TF,TFPI 水平的影响.从凝血系统活性和纤维蛋白溶解活性及血小板聚拢功能进一步探讨L01 对内皮细胞的保护作用2. 拟实行的争论方法、技术路线、实施方案及可行性分析一、争论方法:建立动脉狭窄-电刺激颈总动脉法制备内皮损伤性血栓家兔模型, 承受 ELISA 法检测. 血栓动物血浆 TF,TFPI 浓度和活性.测定血浆凝血酶原时间(PT),活化局部凝血酶时间(APTT).优球蛋白溶解时间.血小板聚拢率.电镜观看内皮损伤状况和

11、血栓形成状况进一步证明海带多糖对内皮细胞释放TF 和TFPI 的影响。二、技术路线及实施方案： 海带多糖的提取:已有成熟的技术，可以大量获得试验用的海带多糖 动物试验：将西兰家兔按性别、体重随机分为5 组：假手术组, 内皮损伤模型组,内皮损伤+L01 高剂量组,内皮损伤+L01 低剂量组, 内皮损伤+肝素组 .于 9 点，15 点，从耳缘静脉分组给药，连续三天， 制备动脉狭窄-电刺激颈总动脉法内皮损伤性血栓家兔模型。手术后取血经抗凝，离心，取血浆，用ELISA 法测定血浆TF 和TFPI 水平， 从而观看比照海带多糖对内皮细胞的保护作用。具体步骤如下：家兔用2O %氨基甲酸乙酯麻醉(5 mlk

12、g)后，从耳缘静脉赐予高剂量组浓度为100 mgkg、低剂量组浓度为10 mgkg的海带细胞壁多糖。肝素组赐予100 IU/kg肝素，分别家兔的单侧颈总动脉,动脉段外包裹一个紧缩的朔料套管,造成动脉狭窄,在狭窄处经皮穿刺动脉内处置入直流刺激电极,以1.2mA持续电刺激,损伤血管内皮,诱发血栓形成,并于刺激远端置入多普勒流量探测电极,记录拴塞处远端血流量变化,以确定血栓形成埋伏期和拴塞时间.于手术前后分别采血， 因子测定: 用ELISA 法检测血浆中的TF 和TFPI水平。（1） TF 抗原的测定:采集血液标本用318%的枸椽酸三钠按19 (v/v ) 抗凝, 离心(3 000r/in) 15

13、分钟, 取血浆, 用10 倍量缓冲液稀释。取100Ll稀释血浆或TF 标准液至已复被一抗体的酶标孔(均做复 管) , 室温下孵育3 小时, 用缓冲液冲洗4 次, 每孔加检测抗100Ll 后室温孵育1 小时, 加10Ll 酶联, 室温下孵育1 小时, 冲洗4 次, 加100Ll 发色底物, 孵育20 分钟后, 每孔加0.5mol 硫酸50Ll 终止反响, 于450 nm下读取吸光度, 从标准曲线上换算成相应的抗原含量。（2） TFPI 抗原的测定: 采集血液标本用318%的枸缘酸三钠按19 (v/v ) 抗凝, 离心( 6000r/min) 10 分钟, 取血浆冻存。冻存的血浆在37下温育15

14、分钟, 用20 倍缓冲液稀释。以后检测步骤原则上与TF 抗原测定一样。（3） 自动凝血仪测定血浆凝血酶原时(PT),活化局部凝血酶时间(APTT), 方法按试剂盒说明操作.（4） 优球蛋白溶解时间测定: 取血27 ml，参与装有枸椽酸钠03ml的试管中，以3000 rmin离心10 min分别血浆；取血浆05 ml 加蒸馏水9 ml和10 mlL醋酸01ml，置于4冰箱内保存30 min后， 再以3000 rmin离心15 min，参与硼酸钠缓冲(pH9O)05ml使沉淀溶解；置于37恒温箱中水浴，再向管内参与25 mmolL CaC1 溶液，观看从凝块形成到完全溶解的时间，此时间为优球蛋白溶

15、解时间。（5） 血小板聚拢率(诱导剂分别为胶原,ADP和瑞斯托霉素). 每组家兔分别采血2ml，分别以3.8 %的枸橼酸钠和2 %EDTA 1 :9 抗凝,3 000 rpm 低温离心15 分钟,用血小板聚拢仪测PAgT ,以最大聚拢率表示,聚拢诱导剂分别为胶原,ADP和瑞斯托霉素,终浓度10mol/ L 。 电镜观看：置备血管切片 ,电镜下观看细胞超微构造，看细胞内皮是否损伤，推断海带多糖对内皮细胞的保护作用。100 毫升Hepes 缓冲液将血管内血液冲洗净，然后，以 0.25%硝酸银水溶液灌流 30 秒，然后再用 100 毫升 Hepes 缓冲液冲洗血管腔， 紧接用 2.5%戊二醛(溶于

16、0.1M 磷酸缓冲液)灌流固定 2 小时，将动脉移出，修剪，纵行剖开，置备超薄切片等，做扫描电镜观看内皮细胞形态及内皮细胞损伤状况。三、可行性分析海带多糖经过多年的试验争论,已经取得了一系列的成果,发表论文 20 多篇,并且得到了国家自然基金的支助,为以后进一步的争论探究奠定了坚实的根底.我导师在海带多糖的提取及分别，家兔内皮损伤血栓模型建立，ELISA 法检测TF 和TFPI 水公正关键试验技术上有丰富的实践操作阅历，能供给技术指导，试验者生疏动物试验，ELISA 法等关键试验技术。本校中心试验室供给相应设备和试验场所。本校试验动物中心能供给试验所需的西兰家兔。试验经费足够。四、争论根底1.

17、 所需试验手段、争论条件和试验条件一、所需试验手段：1、动物试验2、ELISA3、电镜二、争论条件和试验条件1、具有完善的试验条件：本课题组和我校医学科学试验中心具有良好的试验室和试验设备，关键的仪器配备齐全。我校动物试验中心可以供给SPF 级标准化试验动物。2、承受成熟的动物模型制备试验方法，为确保课题争论的顺当进展和按时结题奠定了坚实的根底。2. 所需经费，包含经费来源、开支预算仪器设备、材料须填写名称、规格、数量电子显微镜观看1000 元论文发表费2023 元资料查询、论文印刷等300 元仪器设备费耗材费5000 元治理费100 元试验动物费2023 元协作费500 元数据处理费500

18、元五、工作打算时数1分别提纯海带多糖2023.5-2023.92动物试验2023.9-2023.123因子测定2023.12-2023.14电镜观看2023.1-2023.35资料整理 论文书写2023.3-2023.4序号阶段及内容工作量估量起讫日期阶段成果形式合计广西医科大学科学型争论生学位论文选题报告评分表一、选题依据A30%80100 分6080 分选题有较强的理论意义、有用价值，较深的学术争论内涵。选题有确定的理论意义、有用价值，有确定的学术争论内涵。60 分以下选题缺乏理论意义和有用价值。二、理论根底和特地学问(B)20%80100 分6080 分60 分以下较好的把握坚实宽广的理

19、论根底和系统专业学问根本的把握坚实宽广的理论根底和系统专业学问未能把握坚实宽广的理论根底和系统学问三、选题难度及先进性(C)30%80100 分6080 分60 分以下争论课题属本学科进展方向并居前沿位置，具有自己独特的思考、争论课题具有较强的先进性争论课题属本学科的进展方向，并具有先进性。争论课题与本学科的进展方向先进性不明显， 难度欠佳。四、文字表达D10%80100 分6080 分60 分以下条理清楚，分析严谨，文笔流畅 条理较好，层次清楚，文笔较流畅写作力气较差五、口头报告(E)10%80100 分6080 分60 分以下论文严密、规律性强、表达清楚。根本概念清楚、层次清楚。表达较清楚。表达较差权得分百评审工程评 分 标 准重分制总分总分=0.3A+0.2B+0.3C+0.1D+0.1E备注：评审专家只对五项指标每一项的最终一栏内打分百分制，不必计算总分。评审小组组成：组成姓名职称单位签字导师成员注：此评分表作为争论生中期考核必备的材料之一六、评审意见年月日评审小组意见组长组员年月日