《化工原理》实验教学大纲.pdf

《《化工原理》实验教学大纲.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《化工原理》实验教学大纲.pdf（13页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、化工原理实验教学大纲 1、课程属性：任选 2、实验属性：独立设课 3、学时学分：总学时30、实验学时 30、学分 1.5 4、实验应开学期：春季 5、先修课程：有机化学、分析化学、普通化学、生物化学 一、课程的性质与任务 生物化学与分子生物学综合实验的实验课是在学习生物化学与分子生物学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果与现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或者进行综合性的实验，巩固与加深对生物化学与分子生物学课程中基本理论知识的懂得，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、仪器仪表的使用能力、实验数据的处理与分析能力。二、实验目

2、的与基本要求 本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握与运用学过的基本理论；运用生物化学与分子生物学理论分析实验过程中的各类现象与问题，培养、训练学生的分析与解决问题的能力。学生务必完成的基本要求：准备实验，预习实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。三、实验考核方式及办法 考核方式：考查。实验成绩评分办法：实验技能占 40%，实验态度占 20%，实验报告占 20%，实验室常识占 20%。四、实验项目一览表 生物化学与分子生物学综合实验项目一览表 序号 实验项目名称 实验类型 实验要求 适用专业 学时 1 2 3 4 5 6 7 蛋白质含量测定

3、(考马斯亮蓝 G-250 法)蛋白质含量测定(双缩脲法)蛋白质含量测定(Folin 酚试剂法)蛋白质含量测定(紫外汲取法)淀粉酶活力测定 质粒 DNA 的提取 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分析 聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 设计性 设计性 设计性 设计性 综合性 综合性 综合性 综合性 综合性 必做 必做 必做 必做 必做 必做 必做 必做 必做 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工

4、程类 3 3 6 3 3 6 6 五、实验项目的具体内容 实验一 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝 G-250 法)1、本次实验的目的与要求 学习与掌握考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理与方法。比较不一致方法测定蛋白质含量的异同。2、实验内容或者原理 考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈棕褐色，当它与(浓度 0100g/ml)蛋白质结合呈蓝色，颜色随蛋白质浓度的增加而加深，在 595nm 波长下光汲取与蛋白质浓度成正比。3、需用的仪器与试剂 试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250 4、实验步骤 标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算

5、 5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。实验

6、二 蛋白质含量测定(双缩脲法)1、本次实验的目的与要求 学习与掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理与方法。比较不一致方法测定蛋白质含量的异同。2、实验内容或者原理 碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能与Cu2+产生紫红色的络合物，这一反应称之“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸构成及分子质量无关。其可测定范围为110mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。Tris，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。3、需用的仪器与试剂 试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、

7、牛血清白蛋白、双缩脲试剂、NaOH 4、实验步骤 标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算 5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对

8、实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。实验三 蛋白质含量测定(Folin 酚试剂法)1、本次实验的目的与要求 掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。比较不一致方法测定蛋白质含量的异同。2、实验内容或者原理 Folin-酚法测定蛋白质含量的过程包含两步反应:第一步是在碱性条件下蛋白质与CuSO4作用生成络合物，第二步是此络合物还原Folin试剂(磷钼酸与磷钨酸试剂)，生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。3、需用的仪器与试剂 分光光度计、水浴锅、试管、具塞试管

9、、小烧杯、漏斗及架、电子天平、吸管、容量瓶、滤纸、玻棒、研钵、离心机、离心管、Folin-酚试剂 4、实验步骤 标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算 5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

10、（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。实验四 蛋白质含量测定(紫外汲取法)1、本次实验的目的与要求 学习用紫外汲取法测定蛋白质含量。熟悉分光光度计的操作。比较不一致方法测定蛋白质含量的异同。2、实验内容或者原理 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸与苯丙氨酸等残基在280nm波长下具有最大的汲取。由于各类蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。3、需用的仪器与试剂 紫外分光光度计

11、，离心机，电子天平，研钵，容量瓶，刻度吸管 4、实验步骤（1）取4ml的豆菜提取液，在紫外分光光度计上，于280nm与260nm波长下分别测其吸光度。（2）根据公式计算出蛋白质含量：蛋白质(g/ml)=(1.45A280-0.74A260)稀释倍数 5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始

12、数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。实验五 淀粉酶活力测定 1、本次实验的目的与要求 学习酶活力测定的通常方法，巩固并熟练分光光度计的使用。2、实验内容或者原理 淀粉酶要紧包含-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶与 R-酶。-淀粉酶随机作用于直链淀粉与支链淀粉的直链部分-1，4 糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、-极限糊精与少量葡萄糖。它比较耐热但不耐酸，pH下列可使其钝化。淀粉酶从非还原

13、端作用于-1，4 糖苷键，遇到支链淀粉的-1，键时停止。单独作用时产物为麦芽糖与极限糊精，70保温 15min 可使其钝化。通常提取液中-淀粉酶与-淀粉酶同时存在。能够先测定（+）淀粉酶总活力，然后在 70加热 15min 钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶活力，用总活力减去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3，5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的 3，5-二硝基水杨酸生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活力大小。3、需用的仪器与试剂 电子天平、研

14、钵、容量瓶、具塞刻度试管、吸管、离心机、恒温水浴、分光光度计 1%淀粉溶液、柠檬酸缓冲液、NaOH、3，5-二硝基水杨酸、麦芽糖标准液（1mg/ml）4、实验步骤（1）酶液提取 称取 2g 萌发 3 天的小麦种子（芽长 1cm 左右），置研钵中加少量石英砂与 2ml 左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100ml。每隔数分钟振荡 1 次，提取 20min。3000r/min 离心 10min，转入上清液备用。（2）标准曲线的制作 取 25ml 刻度试管 7 支，编号。分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，

15、然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 1.0ml，再各加 3，5-二硝基水杨酸试剂 1.0ml,置沸水煮沸 5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至 12.5ml。混匀后用分光光度计再520nm 波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。（3）-淀粉酶活力测定 取试管 4 支，标明 2 支为参照管，2 支为测定管。于每管中各加酶液 1ml,在 70恒温水浴中准确加热 15min，钝化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。在参照管中加入 4ml 0.4mol/L 氢氧化钠。在 4 支试管中各加入 1mlpH5.6 的柠檬酸缓冲液。将 4 支试管置另一个 40 0.

16、5恒温水浴中保温 15min，再向各管分别加入 40下预热的 1%淀粉溶液 2ml，摇匀，立即放入 40恒温水浴准确记时保温 5min。取出后向测定管迅速加入 4ml0.4mol/L 氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。（4）淀粉酶总活力测定 取 4 支试管编号，2 支为参照，2 支为测定管。然后加入提取的酶液 1ml。在参照管 加入 4ml 0.4mol/L 氢氧化钠。4 支试管中各加 1mlpH5.6 的柠檬酸缓冲液。下列步骤重复-淀粉酶测定第步的操作，同样准备测糖。（5）样品的测定：取步骤 2，3 中酶作用后的各管溶液 1ml，分别放入相应的 4 支 25ml 具塞刻度试管中，各加入 1ml

17、 3，5二硝基水杨酸试剂。下列操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误

18、差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。实验六 质粒 DNA 的提取 1、本次实验的目的与要求 通过该实验使学生掌握质粒培养的方法，条件（包含培养基的配制、灭菌、接种、培养）、与提取质粒的方法。2、实验内容或者原理 从大肠杆菌中提取质粒 DNA 的方法很多，其中的碱性 SDS 法提取质粒是基于染色体 DNA与质粒 DNA 的变性与复性存在差异而予以分离的。在强碱性条件下，染色体 DNA 与质粒 DNA均变性(双链解开)。由于质粒 DNA 是共价闭合环状超螺旋结构，变性后两条互补链不可能完全分开。当溶液 pH 调节到中性时，质粒

19、 DNA 容易复性并溶解在溶液中，而染色体 DNA 不容易复性，互相缠绕，在离心时极易与蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的质粒 DNA。以具有质粒 pETblue-2 的大肠杆菌实验材料，用碱性 SDS 法可从该菌体中提取到质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳能够检测出。3、需用的仪器与试剂 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡摇床、台式高速离心机、真空干燥器、低温冰箱、恒温水浴、移液器、LB 培养基、羧苄青霉素（Carb）、四环素（tet）、TE 、溶液、溶液、溶液、无水乙醇、70%乙醇 4、实验步骤（1）先在 3mL LB 液体培养基中加入 3uL 羧苄青霉素

20、（Carb,终浓度 50ug/mL）与 7.5uL 四环素（Tet,终浓度 12.5ug/mL），然后接入一个含 pETBlue2 质粒的大肠杆菌单菌落，37 190r/min 振荡培养过夜。（2）将过夜培养的菌液加入 1.5 mL 小指管管中，4000r/min 离心 1 分钟，吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。（3）加入 100L 溶液 I 于含菌体细胞的小指管中，旋涡振荡将细菌沉淀悬浮，室温放置 10 分钟。（4）加入 200L 溶液 II(新鲜配制)，轻轻混匀内容物，将小指管置于冰上使菌液裂解变清（不可用旋涡震荡器）。（5）加入 150L 溶液 III(冰上预冷),盖紧管口，

21、轻轻混匀数次。冰上放置 15 分钟让质粒 DNA 复性（不可用旋涡震荡器）。（6）12000 r/min 离心 10 分钟，将上清转至另一 1.5 mL 小指管中。（7）向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(去蛋白与脂类)，旋涡混匀，12000 r/min离心 5 分钟，将上清转移到另一 1.5 mL 小指管中。（8）向上清中加入等体积氯仿：异戊醇(去微量酚与脂类)，旋涡混匀，12000 r/min 离心 5 分钟，将上清转移到另一 1.5 mL 小指管中。（9）向上清中加入 2 倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置 30 分钟。12000 r/min 离心 10 分钟，吸去上清液。（10）用

22、1mL 75%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀两次（每次 12000 r/min 离心 5 分钟），吸去上清液，真空抽干或者空气中干燥。（11）加 20L TE，使质粒 DNA 完全溶解，20储存。5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确

23、提出本次实验的结论（8）回答思考题。实验七 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分析 1、本次实验的目的与要求 掌握电泳鉴定的基本操作技术，为从事基因工程与分子生物学研究奠定初步基础。2、实验内容或者原理 琼脂糖凝胶电泳适于分离鉴定 20020000bp 的核酸片段。在中性 pH 条件下，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。GoldView 是一种可代替溴化乙锭的新型核酸染料，其灵敏度与 EB 相当，使用方法与之完全相同，当与 DNA 结合后，在紫外透射光下双链 DNA 呈现黄色荧光，由于未发现 GoldView有致癌作用，且灵敏度与 EB 相当，将有可能

24、逐步取代 EB 而得以广泛应用。3、需用的仪器与试剂 琼脂糖、标准分子质量 DNA、上样缓冲液（6loading buffer）、TAE、GoldView 电泳仪、水平电泳槽、移液器 4、实验步骤（1）将有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。（2）将有机玻璃内槽放置于水平位置，并放好样品梳子。（3）将称取 0.25g 琼脂糖放入三角瓶中，加入 25mL 1TAE，用封瓶膜封住三角瓶的上口，在微波炉中将琼脂糖溶化。（4）待冷到 60左右的琼脂糖凝胶液时，加入 2L GoldView 核酸染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻

25、璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)（5）待胶液凝固后，取下橡皮膏，将机玻璃内槽放入电泳槽内。（6）加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。（7）加样：DNA 样品中按照 5：1 的比例添加 6凝胶加样缓冲液(loading-buffer)，混合均匀,用移液枪将 DNA 样品加入样品孔中。(记录点样顺序及点样量)。（8）电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，恒压 80V(注意正负极，DNA 片段从负极向正极移动)。DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5V/cm。当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿 12cm 处，停止电泳。（9）254nm 紫外灯下观察

26、 DNA 条带的完整性及亮度。5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论；（8）回答思考题。实验八 聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测 1、本次实验的目的与要求 熟悉 PCR 实验原理及操作技术，讲授引物设计的原

27、则，观看 PCR 课件 2、实验内容或者原理 PCR 是一种在体外扩增的 DNA 的技术，其基本原理是通过高温使双链 DNA 解旋成单链，然后退火，使特征引物与互补序列配对，最后在 TaqDNA 聚合酶的作用下合成 DNA 片段，经多次循环，直至产生足够的 DNA 片段。Khorana 等早在 1971 年就提出 PCR 概念，但直到 1988 年 Saiki 等从真细菌 Thurmas aquticus rT1 中开发出热稳固的 TaqDNA 聚合酶并实现 PCR 技术的完全自动化后，PCR 才在生命科学研究领域被广泛用来扩增 DNA 片段。PCR 技术可在一个酶促反应中产生大量已知序列的

28、DNA 片段，简化了克隆、鉴定、修饰核酸等程序。正是由于具有如此快速、简便、经济、高效的特点，使得 PCR 技术成为分子生物学研究强有力的技术工具。酶：来源 TaqDNA 聚合酶最适温度 90 多度，但那时其半衰期短不足以支持 30 个循环。因此选择 72作为延伸温度足以支持 30 个循环。DNA 片段快速扩增的方法：即通过引物在 DNA 聚合酶的作用下，延伸核酸某个区域而引起的双向 DNA 合成。反应物含有：（1）模板：阳性参照（2）Taq 酶：（3）引物 1（4）引物 2（5）dNTPs(dATP 、dCTP、dGTP、dTTP）（6）电极缓冲液 TAE：Tris-乙酸（7）buffer

29、缓冲液含有：20-24 个核苷酸，40%-50%的鸟苷酸、胞苷酸，与反应所需的MgCl2。反应的过程：变性 、扩增、复性 、延伸 3、需用的仪器与试剂 PCR 仪、水平电泳槽、恒压电泳仪、加样器、封口膜、PCR 管、台式高速离心机、紫外检测仪、10PCR 反应液、中性 dNTP、引物 1、引物 2、DNA 模板、Taq 酶（2.5U/l）、电泳缓冲液（1TAE）、琼脂糖、Goldview、DNA Markers（标准 DNA）4、实验步骤 PCR 扩增目的基因（碱性磷酸酶 AKP）（1）在 0.2mL PCR 管内配制 50L 反应体系 2.5 mmol/L dNTP Mixture 4uL

30、10 x PCR buffer 5uL 10umol/mL sense 2uL 10umol/mL anti-sense 2uL 模板 DNA 1uL Ex-Taq 1uL（1U）ddH2O 35uL（2）按下述程序进行扩增 1)94 预变性 5 分钟 2)94 变性 1 分钟 3)55 退火 1 分钟 4)72 延伸 2 分钟 5)重复步骤 2)一 4)30 次 6)72延伸 10 分钟。（3）琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果。配制 0.8琼脂糖凝胶 30mL（1TAE），加 1.5ulGoldView。50L PCR 扩增产物6uL 10loading-buffer 6uL SYBR 核酸

31、染料，混匀，全部上样电泳，恒压 80V。5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论。（8）回答思考题。实验九 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1、本次实验的目的与要求 学习与掌握 SDS聚丙烯酰胺凝胶电

32、泳的原理、方法、并应用该方法测定蛋白质分子量。2、实验内容或者原理 假如在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS），由于 SDS 带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽键完全伸展，使蛋白质分子与 SDS 充分结合，形成带负电性的蛋白质-SDS 复合物；如今蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不一致蛋白质间所带电荷的差异。蛋白质分子量愈大，所带的负电荷愈多，在电场中移动得越快；反之越慢。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移速率取决于它所带的电荷的多少、分子的大小与形状。假如用

33、还原剂（如巯基乙醇或者二硫苏糖醇等）与十二烷基硫酸钠（SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，同时 1g 蛋白质可定量结合 1.4g SDS，亚基的结构呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的 SDS 呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，其数值大大超过蛋白质原有的电荷量，掩盖了不一致亚基间原有的电荷差异。各类蛋白质-SDS 复合物具有相同的电荷密度，电泳时纯粹按亚基大小靠凝胶的分子筛效应进行分离。有效迁移率与分子质量的对数成很好的线性关系。因此，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅是一种好的蛋白质分离方法，也是一种十分有用的测定蛋白质分子质量的方法。应该注意的是，SDS-聚丙烯酰胺凝胶

34、电泳法测得的是蛋白质亚基的分子质量。对寡聚蛋白来说，为了正确反应其完整的分子结构，还应用连续密度剃度电泳或者凝胶过滤等方法测定天然构象状态下的分子质量及分子中肽链（亚基）的数目。3、需用的仪器与试剂 恒压电泳仪、垂直板电泳槽、注射器、加样器、烧杯、下层胶缓冲液、上层胶缓冲液、Acr+Bis 贮备液、10%过硫酸铵、样品缓冲液（裂解液）、电极缓冲液、染色液、脱色液、1.5%琼脂、“低分子量标准蛋白”、牛血清白蛋白、鸡血清 4、实验步骤（1）电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，再用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，垂直地固定在两半槽之间，对角拧紧。电泳槽装好后，将溶化的 1.5%的琼脂注入背面槽内

35、的小池中。（2）样品的处理：将标准蛋白质样品及未知样品分别配制浓度为 2mg/ml 的溶液，溶剂为 SDS 样品处理液，溶解后在沸水浴中加热 3-4min。冷却后待用。（3）制胶：将胶沿玻璃壁缓慢加入已准备好的凝胶（在注胶过程中防止产生气泡），胶加到玻璃顶 3cm 处，立即覆盖 3-5cm 的水层，静止聚合 40min 左右。胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶聚合好之后，吸去分离胶上的水层，注入浓缩胶，同时插入梳子。其下端应具分离胶面 1cm，待胶聚合好后小心的取出梳子。（4）点样：标准分子量蛋白：将标准分子量蛋白溶于 SDS 样品缓冲液中（1-2mg/ml）在沸水浴中加热 3

36、-4nin 冷却后使用。未知样品：将提取的未知分子量蛋白用处理标准蛋白的方法处理之。在两槽内加入电极缓冲液，用微量进样器将已知分子量的标准蛋白质混合物加入到一样品槽内，将未知样品加入到其他样品槽内。（5）电泳：加样接通电源后立即电泳（上槽接负极，下槽接正极），最初操纵在 15mA，当样品进入分离胶以后，电流加大到 30 mA，电压恒定在 80-100V 之间，当指示剂染料溴酚蓝到达距分离胶底部 1-2cm 时可停止电泳，电泳约需 34 小时。（6）固定与染色：电泳完毕，将胶取出，在水中浸泡 10min，浸出部分 SDS。后加入考马斯亮蓝 R-250，染色时间以染透整个凝胶板为准，染料可重复使用

37、。除去染色液后，用少量蒸馏水洗掉染料，然后加入脱色液，直至看出清晰的蛋白带，去掉脱色液加入固定液。（7）脱色：用自来水冲洗凝胶上的染色液。之后放入脱色液中脱色。至能看出清晰的蛋白带测量已知与未知蛋白质的迁移率。（8）结果与计算：相对迁移率（Rm）=蛋白质的迁移距离（d2）/指示剂的迁移距离（d1）绘制标准曲线及测定未知蛋白分子量 以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数为纵坐标。在半对数坐标纸上作图，可得一条线，然后根据未知样品的迁移率在标准曲线上就可查得相应的分子量，即为未知蛋白的分子量。5、教学方式 学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。6、考核要求 以出勤、随堂提问、实验报告

38、与预习报告为要紧考核内容。7、实验报告要求 实验报告应包含下列各项：（1）报告的题目（要简明确切）；（2）写报告人及共同测定人员的姓名；（3）实验目的；（4）实验原理；（5）实验仪器与试剂（包含要紧仪器的规格、要紧试剂的名称）；（6）实验数据记录（包含原始数据记录表格与整理后的数据记录表格）；（7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；（9）回答思考题。六、实验教材及要紧参考资料 刘祥云，张云贵，李天俊主编，生物化学实验指导，2005 年 张龙翔等编著 生物化学实验方法与技术（第二版）北京大学出版社