《化工原理》实验教学大纲crc.docx

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1、生物化化学与分分子生物物学综合合实验实实验教学学大纲1、课程程属性：任选2、实验验属性：独立设设课3、学时时学分：总学时时30、实实验学时时30、学学分1.54、实验验应开学学期：春春季5、先修修课程：有机化化学、分分析化学学、普通通化学、生生物化学学一、课程程的性质与与任务生物化学学与分子子生物学学综合实实验的实验课是在学学习生物物化学与与分子生生物学理理论课的的基础上上进行的的一个实实践性环环节，本本课程的的教学任任务是让让学生运运用已学学过的知知识验证证一些结结论、结结果和现现象，及及综合运运用已学学过的理理论知识识设计实实验或进进行综合合性的实实验，巩巩固和加加深对生生物化学学与分子子

2、生物学学课程中中基本理理论知识识的理解解，训练练学生理理论知识识的运用用能力、实实验操作作技能、仪仪器仪表表的使用用能力、实实验数据据的处理理和分析析能力。二、实验验目的与与基本要要求本实验课课配合理理论教学学，通过过实验从从实践中中进一步步学习，掌掌握和运运用学过过的基本本理论；运用生生物化学学与分子子生物学学理论分分析实验验过程中中的各种种现象和和问题，培培养、训训练学生生的分析析和解决决问题的的能力。学生必须须完成的的基本要要求：准准备实验验，预习习实验；写出预预习报告告，拟定定记录表表格；测测取实验验数据；整理实实验数据据；写出出实验报报告。三、实验验考核方方式及办办法考核方式式：考查

3、查。实验成成绩评分分办法：实验技技能占440%，实验验态度占占20%，实验验报告占占20%，实实验室常常识占220%。四、实验验项目一一览表生物化学学与分子子生物学学综合实验验项目一一览表序号实验项目目名称实验类型型实验要求求适用专业业学时1234567蛋白质含含量测定定(考马斯斯亮蓝GG-2550法)蛋白质含含量测定定(双缩缩脲法)蛋白质含含量测定定(Foolinn酚试剂剂法)蛋白质含含量测定定(紫外外吸收法法)淀粉酶活活力测定定质粒DNNA的提提取质粒DNNA的琼琼脂糖凝凝胶电泳泳分析聚合酶链链式反应应(PCCR)技技术及电电泳检测测SDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳法测定定蛋白质质分子量量

4、设计性设计性设计性设计性综合性综合性综合性综合性综合性必做必做必做必做必做必做必做必做必做农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类农科类、植植保、工工程类3363366五、实验验项目的的具体内内容实验一 蛋白白质含量量测定(考马斯斯亮蓝GG-2550法)1、本次次实验的的目的和和要求学习和掌掌握考马马斯亮蓝蓝G-2250法法测定蛋蛋白质含含量的原原理和方方法。比比较不同同方法测定定蛋白质质含量的的异同。2、实验验内容或或原理考马斯亮亮蓝G-25

5、00在游离离状态下下呈棕褐褐色，当当它与(浓度001000g /ml)蛋白质质结合呈呈蓝色，颜颜色随蛋蛋白质浓浓度的增增加而加加深，在在5955nm波波长下光光吸收和和蛋白质质浓度成成正比。3、需用用的仪器器和试剂剂试管、离离心管、研研钵、移移液管、离离心机、分分光光度度计、牛血清清白蛋白白、考马马斯亮蓝蓝G-22504、实验验步骤标准曲线线的配制制、样品品中蛋白白质的提提取、结结果与计计算5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题

6、目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写入此栏栏；（9）回回答思考考题。实验二蛋蛋白质含含量测定定(双缩脲脲法)1、本次次实验的的目

7、的和和要求学习和掌掌握双缩缩脲法测测定蛋白白质含量量的原理理和方法法。比较较不同方法法测定蛋蛋白质含含量的异异同。2、实验验内容或或原理碱性溶液液中双缩缩脲(NNH2-COO-NHH-COO-NHH2)能与与Cu22+产生生紫红色色的络合合物，这这一反应应称为“双缩脲脲反应”。蛋白白质分子子中的肽肽键也能能与铜离离子发生生双缩脲脲反应，溶溶液紫红红色的深深浅与蛋蛋白质含含量在一一定范围围内符合合朗伯-比尔定定律，而而与蛋白白质的氨氨基酸组组成及分分子质量量无关。其其可测定定范围为为1110mgg蛋白质质，适用用于精度度要求不不高的蛋蛋白质含含量测定定。Trris，一一些氨基基酸，EEDTAA等

8、会干干扰该测测定。3、需用用的仪器器和试剂剂试管、离离心管、研研钵、移移液管、离离心机、分分光光度度计、牛血清清白蛋白白、双缩缩脲试剂剂、NaaOH4、实验验步骤标准曲线线的配制制、样品品中蛋白白质的提提取、结结果与计计算5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂

9、剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写入此栏栏；（9）回回答思考考题。实验三蛋蛋白质含含量测定定(Foolinn酚试剂剂法)1、本次次实验的的目的和和要求掌握Foolinn-酚法法测定蛋蛋白质含含量的原原理方法法，熟悉悉分光光光度计的的操作。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。2、实验验内容或或原理Fo

10、liin-酚酚法测定定蛋白质质含量的的过程包包括两步步反应:第一步步是在碱碱性条件件下蛋白白质与CCuSOO4作用生生成络合合物，第第二步是是此络合合物还原原Follin试试剂(磷磷钼酸和和磷钨酸酸试剂)，生成成深蓝色色的化合合物，且且颜色深深浅与蛋蛋白质的的含量成成正比关关系。该该方法灵灵敏度高高于双缩缩脲法1000倍。3、需用用的仪器器和试剂剂分光光度度计、水水浴锅、试管管、具塞塞试管、小小烧杯、漏漏斗及架架、电子子天平、吸吸管、容容量瓶、滤纸、玻玻棒、研研钵、离离心机、离离心管、Follin-酚试剂剂4、实验验步骤标准曲线线的配制制、样品品中蛋白白质的提提取、结结果与计计算5、教学学方式

11、学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及

12、原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写入此栏栏；（9）回回答思考考题。实验四蛋蛋白质含含量测定定(紫外外吸收法法)1、本次次实验的的目的和和要求学习用紫紫外吸收收法测定定蛋白质质含量。熟悉分分光光度度计的操操作。比比较不同同方法测定定蛋白质质含量的的异同。2、实验验内容或或原理蛋白质分分子中的的酪氨酸酸、色氨氨酸和苯苯丙氨酸酸等残基基在2880nmm波长下下具有最最大的吸吸收。由由于各种种蛋白质质中都含含有酪氨氨酸，因因此2880nmm的吸光光度是蛋蛋白质的的一种普普遍性质质。在一一定程度度上，蛋蛋白质溶溶液在2280nnm吸光光度

13、与其其浓度成成正比，故故可用作作蛋白质质定量测测定。3、需用用的仪器器和试剂剂紫外分光光光度计计，离心机机，电子天平平，研钵，容量瓶瓶，刻度吸吸管4、实验验步骤（1）取取4mll的豆菜菜提取液液，在紫紫外分光光光度计计上，于于2800nm和和2600nm波波长下分分别测其其吸光度度。（2）根根据公式式计算出出蛋白质质含量：蛋白质质(g/mml) =(1.45AA2800-0.74AA2600)稀释倍倍数5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）

14、报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写入此栏栏；（9）回回答思考考题。实验五淀淀粉酶活活力测定定1、本次次实验的的目的

15、和和要求学习酶活活力测定定的一般般方法，巩巩固并熟熟练分光光光度计计的使用用。2、实验验内容或或原理淀粉酶主主要包括括-淀粉粉酶、-淀粉粉酶、葡葡萄糖淀淀粉酶和和R-酶酶。-淀粉粉酶随机机作用于于直链淀淀粉和支支链淀粉粉的直链链部分-1，44糖苷键键，单独独使用时时最终生生成寡聚聚葡萄糖糖、-极限限糊精和和少量葡葡萄糖。它它比较耐耐热但不不耐酸，pH以下可使其钝化。淀粉粉酶从非非还原端端作用于于-1，44糖苷键键，遇到到支链淀淀粉的-1，键时停停止。单单独作用用时产物物为麦芽芽糖和极限限糊精，70保温15min可使其钝化。通常提取取液中-淀粉粉酶和-淀粉粉酶同时时存在。可可以先测测定（+）淀粉

16、粉酶总活活力，然然后在770加热115miin钝化化-淀粉粉酶，测测出-淀粉粉酶活力力，用总总活力减减去-淀粉粉酶活力力，就可可求出-淀粉粉酶活力力。 淀粉酶酶活力大大小可用用其作用用于淀粉粉生成的的还原糖糖与3，55-二硝硝基水杨杨酸的显显色反应应来测定定。还原原糖作用用于黄色色的3，55-二硝硝基水杨杨酸生成成棕红色色的3-氨基-5-硝硝基水杨杨酸，生生成物颜颜色的深深浅与还还原糖的的量成正正比。以以每克样样品在一一定时间间内生成成的还原原糖（麦麦芽糖）量量表示酶酶活力大大小。3、需用用的仪器器和试剂剂电子天平平、研钵、容量瓶瓶、具塞刻刻度试管管 、吸管、离心机机、恒温水水浴、分光光光度计

17、1%淀粉粉溶液、柠檬酸酸缓冲液液、NaOOH、3，55-二硝硝基水杨杨酸、麦芽糖糖标准液液（1mmg/mml）4、实验验步骤（1）酶酶液提取取称取2gg萌发33天的小小麦种子子（芽长长1cm左右右），置置研钵中中加少量量石英砂砂和2mml左右右蒸馏水水，研成成匀浆，无无损地转转入1000mll容量瓶瓶中，用用蒸馏水水定容至至1000ml。每每隔数分分钟振荡荡1次，提提取200minn。30000rr/miin离心心10mmin，转转入上清清液备用用。（2）标标准曲线线的制作作取25mml刻度度试管77支，编编号。分分别加入入麦芽糖糖标准液液（1mmg/mml）00、0.1、0.3、0.5、0.

18、7、0.9、1.0mll，然后后用吸管管向各管管加蒸馏馏水使溶溶液达11.0mll，再各各加3，55-二硝硝基水杨杨酸试剂剂1.0mll,置沸沸水煮沸沸5minn。取出出冷却，用用蒸馏水水稀释至至12.5ml。混混匀后用用分光光光度计再再5200nm波长长下进行行比色，记记录吸光光度。以以吸光度度为纵坐坐标，以以麦芽糖糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。（3）-淀粉粉酶活力力测定取试试管4支支，标明明2支为为对照管管，2支支为测定定管。于每每管中各各加酶液液1mll,在70恒温水水浴中准准确加热热15mmin，钝钝化-淀粉粉酶。取取出后迅迅速用流流水冷却却。在对对照管中中加入44ml0.4m

19、ool/LL氢氧化化钠。在44支试管管中各加加入1mmlpHH5.66的柠檬檬酸缓冲冲液。将44支试管管置另一一个4000.55恒温水水浴中保保温155minn，再向向各管分分别加入入40下预热热的1%淀粉溶溶液2mml，摇摇匀，立立即放入入40恒温水水浴准确确记时保保温5mmin。取取出后向向测定管管迅速加加入4mml0.4mool/LL氢氧化化钠，终终止酶活活动，准准备测糖糖。（4）淀淀粉酶总总活力测测定取4支试试管编号号，2支支为对照照，2支支为测定定管。然然后加入入提取的的酶液11ml。在在对照管管加入4mml0.4mool/LL氢氧化化钠。44支试管管中各加加1mllpH55.6的的

20、柠檬酸酸缓冲液液。以下下步骤重重复-淀粉粉酶测定定第步的操操作，同同样准备备测糖。（5）样样品的测测定： 取步骤骤2，33中酶作作用后的的各管溶溶液1ml，分分别放入入相应的的4支255ml具具塞刻度度试管中中，各加加入1ml3，55二硝基基水杨酸酸试剂。以以下操作作同标准准曲线制制作。根根据样品品比色吸吸光度，从从标准曲曲线查出出麦芽糖糖含量，最最后进行行结果计计算。5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；

21、（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写入此栏栏；（9）回回答思考考题。实验六质质粒 DDNA的的提取1、本次次实验的的目的和和要求通过该实实验使学学生掌

22、握握质粒培培养的方方法，条条件（包包括培养养基的配配制、灭灭菌、接接种、培培养）、以及提取质粒的方法。2、实验验内容或或原理从大肠杆杆菌中提提取质粒粒DNAA的方法法很多，其其中的碱碱性SDDS法提提取质粒粒是基于于染色体体DNAA与质粒粒DNAA的变性性与复性性存在差差异而予予以分离离的。在在强碱性性条件下下，染色色体DNNA和质质粒DNNA均变变性(双链解解开)。由于于质粒DDNA是是共价闭闭合环状状超螺旋旋结构，变变性后两两条互补补链不会会完全分分开。当当溶液ppH调节节到中性性时，质质粒DNNA容易易复性并并溶解在在溶液中中，而染染色体DDNA不不容易复复性，互互相缠绕绕，在离离心时极

23、极易和蛋蛋白质-SDSS复合物物等一起起沉淀下下来。转转移出上上清液，再再用乙醇醇沉淀出出其中的的质粒DDNA。以具有质质粒pETbbluee-2的的大肠杆杆菌实验验材料，用用碱性SSDS法法可从该该菌体中中提取到到质粒DDNA，经经琼脂糖糖凝胶电电泳可以以检测出出。3、需用用的仪器器和试剂剂高压蒸汽汽灭菌锅锅、超净工工作台、恒温振振荡摇床床、台式高高速离心心机、真空干干燥器、低温冰冰箱、恒温水水浴、移液器器、LB培养基基、羧苄青青霉素（CCarbb）、四环素素（teet）、TE 、溶液、溶液、溶液 、无水乙乙醇、70%乙醇4、实验验步骤（1） 先在33mL LB液液体培养养基中加加入3uuL

24、羧苄苄青霉素素（Caarb,终浓度度50uug/mmL）和和7.55uL四环素（TTet,终浓度度12.5ugg/mLL），然然后接入入一个含含pETBBluee2质质粒的大大肠杆菌菌单菌落落，3771900r/mmin振振荡培养养过夜。（2）将将过夜培培养的菌菌液加入入1.55 mLL小指管管管中，4000r/min离心1分钟，吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。（3）加加入1000L溶液I于含菌菌体细胞胞的小指指管中，旋旋涡振荡荡将细菌菌沉淀悬悬浮，室室温放置置10分钟钟。（4）加加入2000L溶液III(新鲜鲜配制)，轻轻轻混匀内内容物，将将小指管管置于冰冰上使菌菌液裂解解变清（

25、不不可用旋旋涡震荡荡器）。（5）加加入1550L溶液IIII (冰上预预冷),盖紧管管口，轻轻轻混匀匀数次。冰冰上放置置15分钟钟让质粒粒DNAA复性（不不可用旋旋涡震荡荡器）。（6）1120000 rr/miin离心心10分分钟，将将上清转转至另一一1.55 mLL小指管管中。（7）向向上清中中加入等等体积酚酚：氯仿仿：异戊戊醇 (去蛋白白和脂类类)，旋涡涡混匀，12000 r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5 mL小指管中。（8）向向上清中中加入等等体积氯氯仿：异异戊醇(去微量量酚和脂脂类)，旋涡涡混匀，12000 r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5 mL小指管中。（9）

26、向向上清中中加入22倍体积积无水乙乙醇，旋旋涡混匀匀后，室室温放置置30分分钟。1120000 rr/miin 离离心100分钟，吸吸去上清清液。（10）用1mLL 755%乙醇洗洗涤质粒粒DNAA沉淀两两次（每每次1220000 r/minn 离心心5分钟），吸吸去上清清液，真真空抽干干或空气气中干燥燥。（11）加20L TTE，使使质粒DDNA完完全溶解解，220保存。5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切

27、）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论（8）回回答思考考题。实验七 质粒粒DNAA的琼脂脂糖凝胶胶电泳分分析1、本次次实验的的目的和和要求掌握电泳泳鉴定的的基本操操作技术术，为从从事基因因工程和和分子生生物学研研究奠定定初步基基础。2、实验验内容或或原理琼脂糖凝凝胶电泳泳适于分分离鉴定定200200000bbp的核核酸片段段。在中中性

28、pHH条件下下，核酸酸带负电电荷，在在电场中中向正极极移动，电电泳后，核核酸在凝凝胶中的的位置通通过“染色”来显现现。GolddVieew是一一种可代代替溴化化乙锭的的新型核核酸染料料，其灵灵敏度与与EB相相当，使使用方法法与之完完全相同同，当与与DNAA结合后后，在紫紫外透射射光下双双链DNNA呈现现黄色荧荧光，由由于未发发现GooldVVieww有致癌癌作用，且且灵敏度度与EBB相当，将将有可能能逐渐取取代EBB而得以以广泛应应用。3、需用用的仪器器和试剂剂琼脂糖、标准分分子质量量DNAA 、上样缓缓冲液（66loaadinng bbufffer）、TAE、GoldView电泳仪、水水平电

29、泳泳槽、移移液器4、实验验步骤（1）将将有机玻玻璃内槽槽，洗净净，晾干干，用橡橡皮膏将将有机玻玻璃内槽槽的两端端边缘封封好 (一定封封严，不不能留缝缝隙)。（2）将将有机玻玻璃内槽槽放置于于水平位位置，并并放好样样品梳子子。（3）将将称取00.255g琼脂脂糖放入入三角瓶瓶中，加加入255mL 11TAEE，用封封瓶膜封封住三角角瓶的上上口，在在微波炉炉中将琼琼脂糖溶溶化。（4）待待冷到660左右的的琼脂糖糖凝胶液液时，加加入2L GGolddVieew核酸酸染料，轻轻轻混匀匀，将混混匀的胶胶液缓缓缓倒入有有机玻璃璃内槽，直直至有机机玻璃板板上形成成一层均均匀的胶胶面 (注意不不要形成成气泡)

30、（5）待待胶液凝凝固后，取取下橡皮皮膏，将将机玻璃璃内槽放放入电泳泳槽内。（6）加加入电泳泳缓冲液液（1TAEE）至电电泳槽中中使缓冲冲液刚好好没过胶胶平面，轻轻轻取出出梳子。（7）加加样：DDNA样样品中按按照5：1的的比例添添加6凝胶加加样缓冲冲液(lloaddingg-buuffeer)，混混合均匀匀,用移移液枪将将DNAA样品加加入样品品孔中。(记录点样顺序及点样量)。（8）电电泳：接接通电泳泳槽与电电泳仪的的电源，恒恒压800V (注意正正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。（

31、9）2254nnm紫外外灯下观观察DNNA条带带的完整整性及亮亮度。5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论；（8

32、）回回答思考考题。实验八聚聚合酶链链式反应应(PCCR)技技术及电电泳检测测1、本次次实验的的目的和和要求了解PCCR实验验原理及及操作技技术，讲讲授引物物设计的的原则，观观看PCCR课件件2、实验验内容或或原理PCR是是一种在在体外扩扩增的DDNA的的技术，其其基本原原理是通通过高温温使双链链DNAA解旋成成单链，然然后退火火，使特特征引物物与互补补序列配配对，最最后在TTaqDDNA聚聚合酶的的作用下下合成DDNA片片段，经经多次循循环，直直至产生生足够的的DNAA片段。KKhorranaa等早在在19771年就就提出PPCR概概念，但但直到119888年Saaikii等从真真细菌TThu

33、rrmass aquuticcus rTT1中开开发出热热稳定的的TaqqDNAA聚合酶酶并实现现PCRR技术的的完全自自动化后后，PCCR才在在生命科科学研究究领域被被广泛用用来扩增增DNAA片段。 PPCR技技术可在在一个酶酶促反应应中产生生大量已已知序列列的DNNA片段段，简化化了克隆隆、鉴定定、修饰饰核酸等等程序。正正是因为为具有如如此快速速、简便便、经济济、高效效的特点点，使得得PCRR技术成成为分子子生物学学研究强强有力的的技术工工具。酶：来源源 TaaqDNNA聚合合酶最适适温度990多度度，但那那时其半半衰期短短不足以以支持330个循循环。所所以选择择72作为延延伸温度度足以支

34、支持300个循环环。DNA片片段快速速扩增的的方法： 即通通过引物物在DNNA聚合合酶的作作用下，延延伸核酸酸某个区区域而引引起的双双向DNNA 合合成。反反应物含含有：（1）模模板：阳阳性对照照（2）TTaq酶：（3）引引物1（4）引引物2（5）ddNTPPs ( dAATP 、dCTP、 dGTP 、dTTP）（6）电电极缓冲冲液TAAE：TTriss-乙酸酸（7）bbufffer缓缓冲液含含有：220-224个核核苷酸，440%-50%的鸟苷苷酸、胞胞苷酸，以以及反应应所需的的MgCCl2。反应的过过程： 变性性 、扩增增 、 复性性 、 延伸3、需用用的仪器器和试剂剂PCR仪仪、水平电

35、电泳槽、恒压电电泳仪、加样器器、封口膜膜、PCRR管、台式高高速离心心机、紫外检检测仪、10PCRR反应液液、中性性dNTTP、引物11、引物22、DNAA模板、Taqq酶（22.5UU/l）、电泳缓缓冲液（11TAEE）、琼脂糖、Gooldvvieww、DNAA Maarkeers（标标准DNNA）4、实验验步骤PCR扩扩增目的的基因（碱碱性磷酸酸酶AKKP）（1）在在0.2mL PCRR管内配配制500L反应体体系2.5 mmool/LL ddNTPP Miixtuure 4uuL10x PCRR buuffeer 5uuL10ummol/ mLL seensee 2uuL10ummol/

36、 mLL annti-sennse 2uuL模板DNNA 11uLEx-TTaq 1uuL（11U）ddH22O 335uLL（2）按按下述程程序进行行扩增 1) 994预变性性 55分钟 2) 994变性 11分钟3) 55退火 11分钟 4) 772延伸2分分钟 5) 重重复步骤骤2)一4)300次 6) 772延伸100分钟。（3）琼琼脂糖凝凝胶电泳泳分析PPCR结结果。配制0.8琼琼脂糖凝凝胶300mL（1TAEE），加加1.55ulGGolddVieew。50LL PCCR扩增增产物6uLL 100loaadinng-bbufffer 66uL SYBBR核酸酸染料，混混匀，全全部上

37、样样电泳，恒恒压800V。5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论。（8）回回答思考考题。实验九 SDDS-聚丙烯

38、烯酰胺凝凝胶电泳泳法测定定蛋白质质分子量量1、本次次实验的的目的和和要求学习和掌掌握SDDS聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳的原理理、方法法、并应应用该方方法测定定蛋白质质分子量量。2、实验验内容或或原理如果在聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶中加入入一定浓浓度的十十二烷基基硫酸钠钠（SDDS），由由于SDDS带有有大量的的负电荷荷，且这这种阴离离子表面面活性剂剂能使蛋蛋白质变变性，特特别是强强还原剂剂如巯基基乙醇存存在下，蛋蛋白质分分子内的的二硫键键被还原原，肽键键完全伸伸展，使使蛋白质质分子与与SDSS充分结结合，形形成带负负电性的的蛋白质质-SDDS复合合物；此此时蛋白白质分子子上所带带的负电电荷量远远远超过

39、过蛋白质质分子原原有的电电荷量，掩掩盖了不不同蛋白白质间所所带电荷荷的差异异。蛋白白质分子子量愈大大，所带带的负电电荷愈多多，在电电场中移移动得越越快；反反之越慢慢。 在聚丙丙烯酰胺胺凝胶电电泳中，蛋蛋白质的的迁移速速率取决决于它所所带的电电荷的多多少、分分子的大大小和形形状。如如果用还还原剂（如如巯基乙乙醇或二二硫苏糖糖醇等）和和十二烷烷基硫酸酸钠（SSDS）加加热处理理蛋白质质样品，蛋蛋白质分分子中的的二硫键键将被还还原，并并且1gg蛋白质质可定量量结合11.4gg SDDS，亚亚基的结结构呈长长椭圆棒棒状。由由于与蛋蛋白质结结合的SSDS呈呈解离状状态，使使蛋白质质亚基带带上大量量负电荷

40、荷，其数数值大大大超过蛋蛋白质原原有的电电荷量，掩掩盖了不不同亚基基间原有有的电荷荷差异。各各种蛋白白质-SSDS复复合物具具有相同同的电荷荷密度，电电泳时纯纯粹按亚亚基大小小靠凝胶胶的分子子筛效应应进行分分离。有有效迁移移率与分分子质量量的对数数成很好好的线性性关系。所所以，SSDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳不仅是是一种好好的蛋白白质分离离方法，也也是一种种十分有有用的测测定蛋白白质分子子质量的的方法。应应该注意意的是，SSDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳法测得得的是蛋蛋白质亚亚基的分分子质量量。对寡寡聚蛋白白来说，为为了正确确反应其其完整的的分子结结构，还还应用连连续密度度剃度电电泳或凝凝胶

41、过滤滤等方法法测定天天然构象象状态下下的分子子质量及及分子中中肽链（亚亚基）的的数目。3、需用用的仪器器和试剂剂恒压电泳泳仪、垂直板板电泳槽槽、注射器器、加样器器、烧杯、下层胶胶缓冲液液、上层胶胶缓冲液液、Acrr + Biss 贮备备液、10% 过硫硫酸铵、样品缓缓冲液（裂裂解液）、电极缓冲液、染色液、脱色液、1.5%琼脂、“低分子量标准蛋白”、牛血清白蛋白、鸡血清4、实验验步骤（1）电电泳槽的的安装：玻璃板板先用洗洗液浸泡泡，再用用热水冲冲洗，再再用蒸馏馏水冲洗洗，直立立干燥，垂垂直地固固定在两两半槽之之间，对对角拧紧紧。电泳泳槽装好好后，将将溶化的的1.55%的琼琼脂注入入背面槽槽内的小

42、小池中。（2）样样品的处处理：将将标准蛋蛋白质样样品及未未知样品品分别配配制浓度度为2mmg/mml的溶溶液，溶溶剂为SSDS样样品处理理液，溶溶解后在在沸水浴浴中加热热3-44minn。冷却却后待用用。（3）制制胶：将将胶沿玻玻璃壁缓缓慢加入入已准备备好的凝凝胶（在在注胶过过程中防防止产生生气泡），胶胶加到玻玻璃顶33cm处处，立即即覆盖33-5cmm的水层层，静止止聚合440miin左右右。胶聚聚合好的的标志是是胶与水水层之间间形成清清晰的界界面。分离胶聚聚合好之之后，吸吸去分离离胶上的的水层，注注入浓缩缩胶，同同时插入入梳子 。其下下端应具具分离胶胶面1cm，待待胶聚合合好后小小心的取取

43、出梳子子。（4）点点样：标准分子子量蛋白白：将标标准分子子量蛋白白溶于SSDS样样品缓冲冲液中（11-2mmg/mml）在在沸水浴浴中加热热3-44ninn冷却后后使用。未知样品品：将提取取的未知知分子量量蛋白用用处理标标准蛋白白的方法法处理之之。在两两槽内加加入电极极缓冲液液，用微微量进样样器将已已知分子子量的标标准蛋白白质混合合物加入入到一样样品槽内内，将未未知样品品加入到到其他样样品槽内内。（5）电电泳：加加样接通通电源后后立即电电泳（上上槽接负负极，下下槽接正正极），最最初控制制在155mA，当当样品进进入分离离胶以后后 ，电电流加大大到300 mAA，电压压恒定在在80-1000V之

44、间间，当指指示剂染染料溴酚酚蓝到达达距分离离胶底部部1-22cm时可可停止电电泳，电电泳约需需344小时。（6）固固定和染染色：电电泳完毕毕，将胶胶取出，在在水中浸浸泡100minn，浸出出部分SSDS。后后加入考考马斯亮亮蓝R-2500，染色色时间以以染透整整个凝胶胶板为准准，染料料可重复复使用。除除去染色色液后，用用少量蒸蒸馏水洗洗掉染料料，然后后加入脱脱色液，直直至看出出清晰的的蛋白带带，去掉掉脱色液液加入固固定液。（7）脱脱色：用用自来水水冲洗凝凝胶上的的染色液液。之后后放入脱脱色液中中脱色。至至能看出出清晰的的蛋白带带测量已已知与未未知蛋白白质的迁迁移率。（8）结结果与计计算：相对迁

45、移移率（RRm）= 蛋白白质的迁迁移距离离（d22）/ 指示示剂的迁迁移距离离（d11）绘制标准准曲线及及测定未未知蛋白白分子量量以标准蛋蛋白的迁迁移率为为横坐标标，以其其对应的的分子量量的对数数为纵坐坐标。在在半对数数坐标纸纸上作图图，可得得一条线线，然后后根据未未知样品品的迁移率率在标准准曲线上上就可查查得相应应的分子量量，即为为未知蛋蛋白的分子量量。5、教学学方式学生为主主，教师师辅助，充分预习，独立完成。6、考核核要求以出勤、随随堂提问问、实验验报告和和预习报报告为主主要考核核内容。7、实验验报告要要求实验报告告应包括括下列各各项：（1）报报告的题题目（要要简明确确切）；（2）写写报告人人及共同同测定人人员的姓姓名；（3）实实验目的的；（4）实实验原理理；（5）实实验仪器器和试剂剂（包括括主要仪仪器的规规格、主主要试剂剂的名称称）；（6）实实验数据据记录（包包括原始始数据记记录表格格和整理理后的数数据记录录表格）；（7）实实验结果果。明确确提出本本次实验验的结论论，用公公式计算算。（8）分分析与讨讨论，要要对实验验结果做做出估计计，分析析误差大大小及原原因，对对实验中中发现的的问题应应进行讨讨论，对对实验方方法、实实验设备备有何改改进建议议也可写写