综合性设计性实验.ppt

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1、综合性设计性实验综合性设计性实验-3-3A蛋白质翻译后修饰位点预测蛋白质翻译后修饰位点预测A醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素血红蛋白和细胞色素CA目标蛋白的目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定电泳分离分析及其生物质谱鉴定此实验共包括如下三个部分此实验共包括如下三个部分1.1.第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测2.2.第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳3.3.第三部分，目标蛋白的第三部分，目标蛋白的2D2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定电泳分

2、离分析及其生物质谱鉴定第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测泛泛素素化化对对于于细细胞胞分分化化与与凋凋亡亡、DNA修修复复、免免疫疫应应答答和和应应激激反反应应等等生生理理过过程程起起着重要作用；着重要作用；磷磷酸酸化化涉涉及及细细胞胞信信号号转转导导、神神经经活活动动、肌肌肉肉收收缩缩以以及及细细胞胞的的增增殖殖、发发育育和和分分化等生理病理过程；化等生理病理过程；糖糖基基化化在在许许多多生生物物过过程程中中如如免免疫疫保保护护、病病毒毒的的复复制制、细细胞胞生生长长、炎炎症症的的产产生生等起着重要的作用；等起着重要的作用；脂基化对于生物体内的信号转导过程起着

3、非常关键的作用；脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用；组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。甘露糖化修饰预测甘露糖化修饰预测：N位糖基化修饰预测：位糖基化修饰预

4、测：http:/O位糖基化修饰预测：位糖基化修饰预测：豆蔻酰化位点预测：豆蔻酰化位点预测：乙酰化位点预测：乙酰化位点预测：http:/磷酸化位点预测：磷酸化位点预测：http:/以以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果电泳的含义电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用电泳的应用1.1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2.2.分析某种物质的纯度及分子量分析某种物质的纯度及分子量第二部分，醋酸

5、纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳电泳的基本原理电泳的基本原理在电场中，推动带电质点运动的力（在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（与电场强度（E）的乘积。的乘积。FQE 质点的前移同样要受到阻力（质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：定律，即：F6r（r为质点半径，为质点半径，为介质粘度，为介质粘度，为质点移动速度）为质点移动速度）当质点在电场中作稳定运动时：当质点在电场中作稳定运动时：FF即：即：QE6r在同一电泳条件下，不同的物

6、质因其分子大小（在同一电泳条件下，不同的物质因其分子大小（r）和带电量（）和带电量（Q）的差异而具有不同）的差异而具有不同的泳动速度，因此，电泳一定的时间（的泳动速度，因此，电泳一定的时间（t）就可互相分离。）就可互相分离。EqfqEghghn n6=待分离大分子的性质待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强

7、度增缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。时，需附有冷却装置。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。支持介质的筛孔支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。：筛孔越小，则颗粒在移动的

8、过程中所受到的阻力也就越大。缓冲液缓冲液pHpH和离子强度：和离子强度：pHpH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大也就越大 ；但是；但是pHpH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持强度过低，则缓冲能力差，不易维持PHPH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛）

9、，降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为减慢。一般所用离子强度为0.020.020.20.2之间。之间。电泳的影响因素电泳的影响因素血清蛋白醋酸纤维膜电泳血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验目的实验目的 掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义熟悉电泳仪器的使用和操作熟悉电泳仪器的使用和操作 +白蛋白白蛋白(A)12血清蛋白的血清蛋白的pI大多在大多在7.5以下，在以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤

10、的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成维薄膜上分离成A、1、2、和和五条区带。五条区带。蛋白名称蛋白名称等电点等电点分子量分子量白蛋白白蛋白4.88690005.061：200002：300005.1290000-1500006.85-7.50156000-300000醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。

11、目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经醋酸纤维素薄膜经1,41,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性醋酸纤维素薄膜的特性实验操作及注意事项实验操作及注意事项1.膜的预处理：将薄膜切成膜的预处理：将薄膜切成2.58cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。自然

12、浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。2.加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端加样：光面用铅笔标注，无光泽面距一端1.5cm处用点样器蘸取新鲜血清点样（不能处用点样器蘸取新鲜血清点样（不能看见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样器。看见有液滴形成），待血清进入膜内，移开点样器。3.电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，电泳：放置于电泳槽架时，无光泽面向下，点样端置于负极，膜与电极紧密接触，不能留有气泡，平衡不能留有气泡，平衡5分钟，通电分钟，通电1h。4.染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基

13、黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。5.定量：定量：取取6支试管，编号，分别用吸管吸取支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml；剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约

14、半小时；洗出，约半小时；用分光光度计进行比色，波长用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、1、2、球蛋白各管的光密度。球蛋白各管的光密度。6.计算：计算：光密度总和光密度总和 T A+1+2+白蛋白白蛋白A/T100%1球蛋白球蛋白 1/T 100%2球蛋白球蛋白 2/T 100%球蛋白球蛋白/T 100%球蛋白球蛋白/T 100%临床意义临床意义正常值：正常值：白蛋白：白蛋白：5772%1球蛋白：球蛋白：25%2球蛋白：球蛋白：49%球蛋白：球蛋白：6.512%球蛋白：球蛋白：1220%急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，

15、发病两周后白蛋白、急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、2及及球蛋白减少，球蛋白减少，球蛋球蛋白增高。白增高。慢性肝炎：慢性肝炎：球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。肝硬化：白蛋白、肝硬化：白蛋白、1、2球蛋白均明显下降，球蛋白均明显下降，球蛋白极度升高，甚至球蛋白极度升高，甚至A/G比值倒置。比值倒置。肾病综合征时，白蛋白降低，肾病综合征时，白蛋白降低，2、球蛋白升高。球蛋白升高。聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验目的实验目的学习等电聚焦电泳分离血清蛋白的原理学习等电聚焦电泳分离血清蛋白的原理学习聚丙烯酰胺作为电泳

16、介质的优点及用途学习聚丙烯酰胺作为电泳介质的优点及用途了解等电聚焦电泳和普通聚丙烯酰胺电泳的异同了解等电聚焦电泳和普通聚丙烯酰胺电泳的异同以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的pH梯梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当与自身度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当与自身 pI的位置中聚合成一狭窄的区带而停留下来。的位置中聚合成一狭窄的区带而停留下来。实验原理实验原理聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳是

17、以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰（胶是由单体的丙烯酰（Acrylamide,Acr）和甲叉双丙烯酰胺（和甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide,Bis）在催化剂作用下聚合而成。在催化剂作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶的特点：机械弹度好、弹性大、透明、化学稳定性高及无电渗等。聚丙烯酰胺凝胶的特点：机械弹度好、弹性大、透明、化学稳定性高及无电渗等。聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高。聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高。等电聚焦电泳等电聚焦电泳蛋蛋白白质质是是带带有有电电荷荷的的两两性性生生物物大大分分

18、子子，其其正正负负电电荷荷的的数数量量随随所所处处环环境境酸酸碱碱度度的的变变化化而而变变化化。在在电电场场存存在在下下的的一一定定pH溶溶液液中中，带带正正电电的的蛋蛋白白分分子子将将向向负负极极移移动动而而带带负负电电的的蛋蛋白白分分子子将将向向正正极极移移动动，在在某某一一pH时时，蛋蛋白白分分子子在在电电场场中中不不再再移移动动，此此时时的的pH值值即即为为该该蛋蛋白白质质的的等等电点。电点。等等电电聚聚焦焦(IEF）电电泳泳就就是是在在凝凝胶胶中中加加入入两两性性电电解解质质从从而而构构成成从从正正极极到到负负极极pH逐逐渐渐增增加加的的pH梯梯度度，处处在在其其中中的的蛋蛋白白分分

19、子子在在电电场场的的作作用用下下运运动动，最最后后各各自自停停留留在在其其等等电电点点的的位位置置上上，测出蛋白分子聚焦位置的测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。值，便可以得到它的等电点。两性电解质两性电解质 Ampholine(由瑞典由瑞典LKB公司生产公司生产)它是由许多脂肪族的多氨基它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的多羧基的异构体和同系物组成的,pH范围范围，4-6.5，5-8，。在没有电场时在没有电场时,载体两性电解质溶液的载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液值大约是该溶液pH范围的平均值范围的平均值(如如pH3-10的载的载体两性电解质溶液，其体

20、两性电解质溶液，其pH约为约为6.5左右左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移，阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移，在凝胶内制造一个在凝胶内制造一个pH梯度。梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处。处。等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结

21、束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）高高pH低低pH实验操作及注意事项实验操作及注意事项1.凝胶配制：凝胶配制：取取10 0.5cm内径的玻璃管，选择底部较齐平的一端用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎内径的玻璃管，选择底部较齐平的一端用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），从一端量出紧），从一端量出7cm作好标记，垂直放置。作好标记，垂直放置。按下表配制聚丙烯酰胺凝胶，见下页按下表配制聚丙烯酰胺凝胶，见下页 注意事项：注意事项：a.按表中的顺序加入试剂，并摇匀。按表中的顺序加入试剂，并摇匀。b.TEMED最后加，注意混匀。最后加，注意混匀。TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)通过催化

22、过硫酸通过催化过硫酸 铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。c.将长滴管及时清洗将长滴管及时清洗试剂试剂数量（数量（ml）蒸馏水蒸馏水7.0Acr Bis240%Ampholine0.2样品：人样品：人Hb和和CytC混合物混合物（1mg/ml）4滴滴10过硫酸铵过硫酸铵0.15TEMED5 l总量总量9.35按下表配制聚丙烯酰胺凝胶按下表配制聚丙烯酰胺凝胶用长滴管汲取配置好的凝胶液，沿玻璃管倾斜缓慢注入到用长滴管汲取配置好的凝胶液，沿玻璃管倾斜缓慢注入到7ml标记平面，避免产生气泡。标记平面，避免产生气泡。立即用立即用5ml注射器针头沿玻

23、璃壁内侧面缓慢加入注射器针头沿玻璃壁内侧面缓慢加入0.5cm高度的蒸馏水，加时贴近凝胶，尽量高度的蒸馏水，加时贴近凝胶，尽量减少胶面与水相混和。加蒸馏水的目的除了隔离空气中的氧外，还能消除液柱表面的弯月减少胶面与水相混和。加蒸馏水的目的除了隔离空气中的氧外，还能消除液柱表面的弯月面，使凝胶液面平坦。然后垂直静置待其聚合。面，使凝胶液面平坦。然后垂直静置待其聚合。2.电泳电泳将已聚合的凝胶去除水层，凝胶端加将已聚合的凝胶去除水层，凝胶端加2氢氧化钠消除凹面，垂直插入电泳槽中的橡氢氧化钠消除凹面，垂直插入电泳槽中的橡皮管中；皮管中；在电泳槽中的上槽注入在电泳槽中的上槽注入0.2硫酸或硫酸或5磷酸，

24、下槽注入磷酸，下槽注入0.4乙醇胺或乙醇胺或2氢氧化钠。氢氧化钠。加完电极液后，要仔细检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必需排除，否则影响导电；加完电极液后，要仔细检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必需排除，否则影响导电；上槽接正极，下槽接负极，电压上槽接正极，下槽接负极，电压50V，预电泳预电泳30分钟，然后将电压维持在分钟，然后将电压维持在200-300V，1-2小时；小时；电泳结束后，取下玻璃管；电泳结束后，取下玻璃管；3.剥胶剥胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与玻璃管壁之间，边旋转边注水，使针用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与玻璃管壁之间，边旋转边注水，使针头慢

25、慢旋转前进。靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，最后可用洗耳球在头慢慢旋转前进。靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，最后可用洗耳球在玻璃管的一端轻轻加压，就可将凝胶从玻璃管内压出，凝胶盛于培养皿中。玻璃管的一端轻轻加压，就可将凝胶从玻璃管内压出，凝胶盛于培养皿中。4.测定样品测定样品pI 方法一：直接用方法一：直接用PH试纸插入所需测定的蛋白区带中，此法虽然十分方便，但较为粗略。试纸插入所需测定的蛋白区带中，此法虽然十分方便，但较为粗略。方法二：将所需测定的蛋白区带用刀片切下，置于方法二：将所需测定的蛋白区带用刀片切下，置于5ml蒸馏水的小烧杯中，经常搅拌，蒸馏水的小烧杯中，经

26、常搅拌，4小小时后用时后用PH计测其计测其pI。第三部分，目标蛋白的第三部分，目标蛋白的2D电泳电泳分离分析及其生物质谱鉴定分离分析及其生物质谱鉴定蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，以细胞内全部蛋白质的存蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。在及其活动方式为研究对象。人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正

27、执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。律和生物功能。2D电泳可用于蛋白质转录及转录后修饰研究、蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作电泳可用于蛋白质转录及转录后修饰研究、蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用、细胞分化凋亡研究、致病机制及耐药机制的研究、疗效监测、新药开发、癌症用、细胞分化凋亡研究、致病机制及耐药机制的研究、疗效监测、新药开发、癌症研究、蛋白纯度检查、小量蛋白纯化、新替代疫苗的研制等许多方面。研究、蛋白纯度检查、小量蛋白纯化、新替代疫苗的研制等许多方面。蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳(Two D

28、imensional Electrophoresis，2DE)是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另另两种是质谱技术和蛋白质组信息学两种是质谱技术和蛋白质组信息学)。双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置。双向电泳技术在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置。双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开，从而分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开，

29、从而大大提高了分辨率。大大提高了分辨率。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，确位置和强度，蛋白质组研究的重点是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。蛋白质组研究的重点是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。质谱（质谱（Mass Spectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷

30、比（或质量）的大小顺是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。的仪器。将双向凝胶电泳的蛋白点挖出来，用质谱分析，能得到该蛋白的分子量，质荷比等参数，将双向凝胶电泳的蛋白点挖出来，用质谱分析，能得到该蛋白的分子量，质荷比等参数，随后搜索蛋白质数据库，将该蛋白判断为哪个蛋白。随后搜索蛋白质数据库，将该蛋白判断为哪个蛋白。实验设计实验设计1.查阅相关资料，设计一个实验流程，分析正常人细胞与食管癌细胞间的差异查阅相关资料，设计一个实验流程，分析正常人细胞与食管癌细胞间的差异基因表达，应注意什么事项；基因表达，应注意什么事项；2.了解目前质谱技术的种类和原理，选择哪种技术来分析这些差异表达基因；了解目前质谱技术的种类和原理，选择哪种技术来分析这些差异表达基因；3.请介绍一些双向电泳数据库的内容和使用方法。请介绍一些双向电泳数据库的内容和使用方法。