一株抗肿瘤活性的红树林细菌的筛选及鉴定_刘悦.docx

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1、DOI: 10.15926/j .cnki .issn 1672-6871.2014.01.017 第 35 往第 1 期 河南科技大报：卩丨然科学版 V l.35 N. I 2 .jj Journal ( Henan Univrsily of Scietic-e and Twlinolugy： Nahiral 2014 文章编号 ： 1672 -6871 (2014)01 -0071 -04 一 株抗肿瘤活性的红树林细菌的筛选及鉴定 刘悦、张京京 2，黄宇明、李荷 1 (1.广东药学院基础学院，广东广州 510006:2.深圳市罗湖外语学校，广东深圳 518004) 摘要：从深圳红树林土壤中

2、分离出一株嗜盐细菌 S17,对其进行生理生化特性研宄并进行潜在的抗菌和抗肿 瘤活性评价，采用 16S rDNA 序列分析及系统发育分析方法对其进行分子鉴定。研宄结果表明：菌株 S17 为中 度嗜盐细菌，与短小芽孢杆菌属 pumifcs ATCC 7061 具有 99%同源性。 S17 的粗提物对多种细菌和肿 瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用，可以进行进一步的开发和利用。 关键词：红树林；中度嗜盐细菌 ;抗菌活性 ;抗肿瘤活性 中图分类号： Q7 文 献标志码 :A 引言 随着微生物来源的药物需求量不断增加，向海洋微生物寻求药用物质和药物先导化合物已成为各 国的研宄重点 14。红树林是热带、亚热

3、带陆地与海洋潮间带的木本植物群落，是一种比较特殊的森林 生态系统，也是物种多样性最丰富的生态系统之一，具有重要的生态地位。红树林区的微生物由于所处 耐盐、厌氧等特殊生境，遗传及生理特性与其他生境中的微生物相比具有特异性，具有产生新型活性物 质的潜力，是开发新药的重要资源 5。目前，己经从红树林土壤中筛选出多种有用物质。本研 究 主 要 是 对 从深 圳 福 田 红 树 林 自 然 保 护 区 土 壤 中 分 离 纯 化 到 的 属 细 菌 S17 进行分离鉴 定，研究其代谢产物的抗菌和抗肿瘤活性，以期作为新的生物活性物质的来源。 1 材 料 和 方 法 1.1 试验材料 本试验样品采集于深圳福

4、田红树林自然保护区中红树林根泥 ， 4 C 保存，进行后续的菌株筛选。 分离培养基 （ 1 L):胰蛋白胨 5 g、 牛肉膏 2 g、 酵母粉 1.5 g、 葡萄糖 5 g、 K2HP040.1 g、 MgS04 *7:0 0. 1 g、NaC15 g、（ NH4)2S04 0.1 g、 琼脂 15 g、 pH7.0。 1.2 菌株的分离纯化及生化鉴定 将采集土样用无菌水进行适当稀释成 KT1 10_5 梯度浓度，取 100 fJiL 稀释液涂布于分离培养基 上 ,37 C 倒置培养 2 3 d,挑取单菌落平板划线分离、纯化菌种。观察菌株的生长形态，根据常见细菌 系统鉴定手册 12和伯杰氏细菌

5、鉴定手册 M进行常规生化鉴定。 1.3 菌株的耐盐度特性测定 将筛选的菌株接种于不同盐浓度的液体培养基中， NaCl 终浓度 （ g/100 mL)分别为 0%、 1%、 3%、 5%、7%、 9%、 11%、 15%， 37 t ,170 r/min 恒温培养，培养 2 3 d， 测 测 定 菌 种 生 长 浓 度 。 1.4 菌株的 16S rDNA 的序列测定及系统发育分析 用 SDS 法提取细菌 DNA,以通用引物 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ） 和 1 492 R (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT-3） 进行 PCR 反应扩增 16S

6、 rDNA 基因。 PCR 产物用 omega 胶回收试剂盒 进行纯化。纯化后的菌种 16S rDNA 与 pMD 18-T 载体 （ Takara)进行连接，将连接片段转入经 CaCl2处 理的 DH5a感受态细胞中，采用选择性 LB 培养基平板（加氨苄青霉素、 IPTG、 X$al)进行 基金项 H :国家自然科学基金项 H (30970107);广东省科技厅基金项 H (2012B01030002) 作者简介：刘悦 （ 1987-),女，安徽阜阳人，硕士生；李荷 （ 196S-),女，黑龙江绥化人，为通信作者，教授，博士，硕士生导师，主 要从事微生物分子生物学的研究 . 收稿日期 :20

7、13-04-12 阳性克隆子的筛选。提取白色阳性克隆单菌落的质粒，经酶切验证后送测序，测序由华大基因完成。 测序结果与 GenBank 中己有的序列进行 BLAST 对比。选择相似性最大的即同源性比较高的菌株 16SrDNA 序列进行序列比对，构建系统进化树。采用 Clustal X1.83 软件进行多序列比对，利用 MEGA4.0绘制系统进化树。菌株 S17 的 16S rDNA 序列已经提交到 NCBI 的 GenBank 数据库中，序列 号为 KC778622。 1.5 抗菌及抗肿瘤活性的测定 利用平板划线法得到细菌 S17 的单菌落，挑选一个单菌落接种到含有 20 mL 改良培养基中，

8、 37 丈、 175 r/min， 培养 12 h， 将 20 mL 种子液接种到 200 mL 相同培养基中；同样生长条件培养 48 h， 菌种发酵 液离心 （ 5 000 r/min， 25 丈 ， 10 min)，上清液用乙酸乙酯抽提 3 次，收集有机相，旋转蒸发仪 60 丈减压浓 缩至适量，冷冻干燥，得发酵粗提取样品；精密称取适量该提取样品，用体积分数为 80%的甲醇溶液溶 解粗提取样品至终浓度为 10 mg/mL 的样品溶液，用于抗菌和抗肿瘤活性检测，以 80%的甲醇作空白对 照溶液。 采 用牛津杯法进行抗菌活性的测定，以金黄色葡萄球菌 （ StepWococciw aure()、大

9、肠杆菌 (&c/ieric/iia co/i)、芽抱杆菌 （ BaciWiw 和黑曲霉 raiger)作为指夺 :菌。根据抑菌圈的直 径定性判断菌株的抗菌能力。 采用 MTT 法检测嗜盐细菌 S17 粗提物对人肝癌细胞 HePG2 细胞增殖的抑制作用。取对数生长期 的HePG2 细胞，用新鲜 DMEM 高糖培养基配制成 2 x 105个 /mL 的细胞悬液，接种于 96 孔板中，每孔加 细胞悬液 200 137 丈培养 1 h 后，每孔加样品液或空白对照溶液各 2 |xL， 每个浓度设 3 个复孔，继续 37 丈培养 24 h。 培养结束后，每孔加 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 |x

10、L， 37 丈孵育 4 h,每孔加 DMS0 150 |xL， 室温充分振荡 10 min 使 MTT 紫色产物完全溶解，测量 570 nm 处的吸光度 （ 0/)。取 0D 平均值，以 空白对照组为100%，按下式计算抑制率 （ /fi% ): /R% = (0_0 空白对照 -0Z)样品 ） /0Z)空白对照 x 100%。 2 结 果 与 分 析 2.1 菌株 S17 的形态特征 菌株 S17 在分离培养基中生长状况良好，如图 1 所示，菌落表面色暗有褶皱，淡黄色，不规则形，不 透明，革兰氏染色显示 S17 为革兰氏阳性，菌体形态呈杆状，很少成链。染色均匀，菌体大小为 （ 0.6 0.7

11、) |xm x (2.0 3.0) |xm 2.2 菌株 S17 的生理特征 耐盐度特性试验结果见表 1，由表 1 可看出：菌株 S17 在盐浓度为 0% 15%培养基中可以生长，生 长最适盐质量浓度范围为 5% 11%，最适盐质量浓度为 5%，在低盐质量浓度 （ 11%)培养基中生长相对缓慢，根据文献中嗜盐菌的分类，将其归属于中度嗜盐菌 14。 表 1 盐 度 对 菌 株 S17 生长的影响 盐质量浓度 Mg/l mL) m 0 0.02 1 0.05 3 0.08 5 0.69 7 0.54 9 0.38 11 0. 13 15 0. 11 2.3 菌株 S17 的系统发育分析 菌株 S1

12、7 的 16S rDNA 基因序列分析结果见图 2,它与短小芽孢杆菌 ATCC 7061 (NR_043242)聚 类 为 一 支 ， 它 们 的 16S rDNA 序 列 相 似 性 高 达 99%，判断 S17 与最接 近，可以初步确定菌株 S17 属于芽杆菌属。 图 2 中度耐盐菌 S17 及其相关属种的 16S rDNA序列构建的系统发育树 2.4 抗菌活性筛选结果 表 2 为细菌 S17 的抗菌性筛选结果，由表 2 可知：菌株 S17 的粗提物对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球 菌、芽孢杆菌和丝状真菌黑曲霉均有明显抗菌活性，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌无抗菌活性。可见，菌 株 S17 的粗提物的

13、抗菌活性以抗革兰氏阳性菌为主，对指示菌的抑制强度表现为革兰氏阳性菌 革兰 氏阴性菌 丝状真菌，其中 S17 抑制金黄色葡萄球菌的能力最强，抑菌圈为 10. 1 mm。 用 MTT 法检测细菌 S17 发酵粗提物的细胞毒活性，测得 3 个复孔 ttD57。值分别为 ： OR = 1.271， OD2 = 1.258, OD3 = 1.352, RSD =0.051,因此， 01制 =1.294 0.051, OD 如 =2. 703 0.024,其 /R 为 52.2%。结果表明：其粗提物对人肝癌细胞的增殖具有明显抑制作用，而阴性空白对照对人肝癌细胞 HepG2 未显示细胞毒性作用。 3 讨论

14、本研究筛选分离出的嗜盐菌 S17 最适盐质量 浓度范围为 5% 11%，根据嗜盐菌的分类，中 度嗜盐菌最适生长盐质量浓度 3% 15% (0.5 2.5 mol/L),因此属于中度嗜盐菌。己有的研究 结果表明，中度嗜盐菌有着重要的研究价 值和广 阔的应用前景，对其研究主要是集中在对其产生 的酶、一些功能性分子和大分子多聚物以及生物 环保等方面。普通酶在高盐条件下会变性失活，而嗜盐菌产生的酶在高盐条件下仍能保持较高的活性 和稳定性，更能适应工业生产条件的需要，因而具有极高的应用潜能。文献 15从烟台海域也分离筛 选出一株中度嗜盐芽孢杆菌 YTM-5,最适宜的生长条件为 3%盐质量浓度，本研究筛选

15、出的 S17 最适生 长条件为 5%盐质量浓度，相比较而言 ， S17 更加耐盐，从而也更能满足工业应用的需要。 通过对菌株 S17 生理特性的研宄和 16S rDNA 序 列 的 比 对 ，确 定 其 为 属 的 中 度 嗜 盐 菌，进一步研宄了其对多种指示菌的抗菌活性及对肿瘤细胞的抑制作用，将其应用于药用活性物质的筛 选。研宄结果显示：菌株 S17 对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以黑曲霉为代表的丝状真 表 2 细菌 S17 的抗菌活性筛选结果 指示菌 抑菌圈 / mm 抑菌效果 金黄色葡萄球菌 10. 1 + + 大肠杆菌 0 芽孢杆菌 8.4 + + 黑曲霉 7.2 + + 注

16、 :试验采用的牛津杯外径为 (6.01.0) mm。 抑菌圈直径 3： 7. 0 mm,视为该样品具有抑菌活性；抑菌圈直径 3： 12. 0 mm,视为抑菌效果较明显；表示没有抑菌活性。 菌表现出很强的抑制作用，并对人肝癌细胞 HePG2 有很强的抑制作用，可以作为发现新型生物活性物 质的潜在资源。近几年研宄人员已经从多种生境中分离到一批具有抗菌、抗肿瘤的细菌和真菌。比如， 文献 16从北极的沉积物中筛选出一株嗜冷细菌，以人胃癌细胞 MGC80-3 为测试细胞株，发现该菌株 的发酵液有较强的细胞毒活性。文献 17对 100 株深海真菌进行了抗肿瘤及抗菌活性检测，发现深海 真菌具有良好的生物活性

17、，细胞毒性阳性率占 49%， 26%的菌株具有明显抗大肠杆菌效果， 23%抗枯草 芽孢杆菌，5%抗白假丝酵母， 21%抗金黄色葡萄球菌。这一系列的研宄都表明，从微生 物资源中探寻新 型抗生素和抗肿瘤药物是一种行之有效的途径，本研宄也为后期开发新药提供了研宄基础。 参考文献： 1 Nikapitiya C. Bioactive Secondary Metabolites from Marine Microbes for Drug Discovery j . Adv Food Nutr Res2012,65 : 363 -387. 2 Zotchev S B. Marine Actinomycet

18、es as an Emerging Resource for the Drug Development Pipelines j J Biotechnol,2012, 158(4) : 168 - 175. 3 Jaiganesh R,Sampath K,Sampath N. Marine Bacterial Sources of Bioactive Compounds j . Adv Food Nutr Res2012,65: 389 -408. 4 Lordan S Ross R P Stanton C. Marine Bioactives as Functional Food Ingred

19、ients: Potential to Reduce the Incidence of Chronic Diseases j . Mar Drugs,2011 9 (6) : 1056 - 100. 5 Russo P Cesario A. New Anticancer Drugs from Marine Cyanobacteria j . Curr Drug Targets2012,13 (8) : 1048 - 1053. 6 Javed F,Qadir M LJanbaz K H,et al. Novel Drugs from Marine Microorganisms j . Crit

20、 Rev Microbiol? 2011,37 ( 3 ) : 245 -249. 7 朱兰，何伟，许书宁 .抗肿瘤的海洋微生物筛选 0.大连民族学院学报 ， 2011 (5) :524 -525. 8 曹雪，杨瑞丽 .源于海洋微生物抗肿瘤活性物质的研宄 DQ.药物生物技术， 2007， 14(4) :302 -305. 9 Jiang Y X， Zheng T L， Tian Y红树林土壤微生物的研宄 :过去、现在、未来 D.微生物学报， 2006,46(5) :848 -851. 10 Xu J. Biomolecules Produced by Mangrove-associated M

21、icrobes j . Curr Med Chem,2011,18 (34) :5224 -5266. 11 程中山，徐树兰，陈其津 .代谢产物具杀虫活性的红树林真菌 1893 菌株培养条件的研宄 D.环境昆虫学报， 2008, 30(2) : 120 -126. 12 东秀珠，蔡妙英 .常见细菌系统鉴定手册 M.北京 :北京科学出版社， 2001:242-244,259 -266. 13 Holt J GKrieg N RSneath P H A,et al. Bergey, s Manual of Determinative Bacteriology j . 9 ed. Baltimore

22、: Williams & Wilkins, 1994:175 -187. 14 冯二梅，宿红艳，王磊 .中度嗜盐菌的研宄进展 D.安徽农业科学， 2009(31) :15125 -15126,15190. 15 王磊，冯二梅，宿红艳 .烟台海域一株中度嗜盐芽孢杆菌 YTM-5 的鉴定及其耐盐机制研宄 I.新乡学院学报：自 然科学版 ， 2010 (3) :50 -55. 16 曾润颖，李根，林昱 .一株具抗肿瘤活性的北极细菌的筛选及分子鉴定 D.厦门大学学报：自然科学版 ， 2002 ( 6 ) : 800 -803. 17 徐新霞，易志伟，马群，等 .100 株深海真菌次生代谢产物的生物活性

23、初步研宄 D.台湾海峡， 2010(4) :465 -472. VI Journal l 11 man l nivrrsity l Srirnrc and I rchimlogv ； ialnral 2014 Architecture Fatigue Performance of Corroded RC Beams Strengthened with CFRP Sheets . ( 58 ) CHEN Shuang1,2, CHEN Yihu2 Liang Jinxiu2XU Ning3 (1. Guangxi Scientific Experiment Center of Mining, M

24、etallurgy & Environmenti Guilin 541004, China 2. Bowen College of Managements Guilin University of Technologyy Guilin 541004, China 3. Central & Southern China Municipal Engineering Design & Research Institute Co.，Ltd.， Wuhan 43QQ1Q， China) Abstract:The capacities of two un-corroded and six corroded

25、 RC (reinforced concrete) beams were tested. Four of corroded RC beam were strengthened by CFRP (Carbon Fiber Reinforced Polymer) in different ways. This paper analyzed the fatigue performance of CFRP reinforced RC beams. The results shows that the fatigue performance including crack width, deformat

26、ion and stiffness are all improved with the reinforcement volume increase. Different strengthening ways and quantity have obvious influence on the fatigue performance. Besides? U-shaped hoop of carbon fiber has greater affect on fatigue properties. Key words: carbon fiber reinporced polymer; corrosi

27、on; RC beam; fatigue CLC number:TU317 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)014)058-05 Fire Resistance of Beam-Column Connection of Top-Seat-Web Angle Steel . ( 63 ) WANG Xinwu1， DAI Dongliang2， LIANG Bin2， BU Xin1 (1. Department of Civil Engineerings Luoyang Institute of Science & Technologyf

28、 Luoyang 471023 China 2. Civil Engineering School， Henan University of Science & Technology i Luoyang 471023 China) Abstract: In this paper 3 nonlinear finite element model for beam-column connection of top-seat web angle steel was built to analyze load bearing capacity, temperature conductivity and

29、 deformation state under static force and thermal force. The mechanical mechanisms of top-seat angles， web angles and bolts under high temperature were presented and the rule of prestress loss affected by temperature for bolts was obtained which could not be obtained by experiment. The research resu

30、lts provide good theoretical references to fire resistance property application of beam-column connection of top-seat web angle steel. Key words: thermal-stress coupled ； semirigid connection; top-seat angle； web angle CLC number:TU391 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)01-0063-04 Agricultu

31、re and Biology Isolation and Identification of Field Strains of Mareks Disease Virus from Henan Province . (67 ) YU Zuhua12a 2b， DING Ke1， TENG Man2a 2b， SU Jingwei2d 2b， LUO Jun2a 2b (1. Key Laboratory of Animal Disease & Public Safety f Henan University of Science & Technology i Luoyang 471003 Chi

32、na ,2 a. Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture 2b. Henan Province Key Laboratory of Animal Immunology y Henan Academy of Agricultural Sciences i Zhengzhou 450002? China) Abstract: Marek s disease (MD) was outbroken in vaccinated chickens in Henan province of China during

33、 2011 2012. Using chicken embryo fibroblasts (CEF)， 17 filed isolates were obtained from diseased chickens. The isolates adapted to CEFs very well and most produced typical plaque at 3 5 d post4nfection. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the 132 bp repeats sequence from the viral geno

34、me verified that all the isolates are Marek? s disease virus (MDV) . However, the copies of 132 bp repeats are apparently different in distinct isolates. The filed MDYs of differing virulence may widely spread in the central regions of Henan prorince. Key words: Marek? s disease virus ； isolation; i

35、dentification ； 132 bp repeat sequence CLC number:S852.65 ;Q78 Document code: A Article ID: 1672-6871 (2014)01 -0067-04 Isolation and Identification of Bacterium from Mangrove Soil with Antitumor Activity . ( 71 ) LIU Yue1， ZHANG Jingjing2， HUANG Yuming1， LI He1 ( 1. School of Basic Courses f Guangd

36、ong Pharmaceutical University， Guangzhou 51QQQ6， China ， 2. Shenzhen Luohu Foreign Languages School， Shenzhen 518004, CW) Abstract:The halophilic bacteria S17 was isolated from mangrove soil in Shenzhen. The identification of the strain S17 was based on the physiological and biochemical characterist

37、ics and 16S rDNA sequence homology comparison. Potential antimicrobial and antitumor activities were also investigated. The results show that the strain SI7 belongs to moderately halophilic bacterium, and is identified as Bacillus pumilus according to 99% sequence identity to Bacillus pumilus ATCC 7

38、061. The crude extraction from S17 shows strong antimicrobial activities which inhibits the growth of many bacteria and tumor. This particular property makes S17 has high research value and application potential. Key words: mangrove soil ； moderately halophilic bacteria ； antimicrobial activity ； cy

39、totoxic activity CLC number:Q7 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)01-0071-04 Mathematics and Physics Cores of a Class of Fuzzy Cooperative Games . ( 75 ) WANG Fengye， HUANG Zhiyong， SHANG Youlin， CHEN Peng (Mathematics & Statistics School， Henan University of Science & Technology Luoyang 47

40、1023 China) Abstract: Based on crisp cooperative games with infinite players? a class of fuzzy cooperative games with Choquet integral form was proposed. The properties of the fuzzy cooperative games were discussed, such as monotonity superadditivity and non-atom. The existence and integral form of

41、the core of the class of fuzzy cooperative games were proven. Key words: fuzzy cooperative games; choquet integral; core CLC number:0225 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)01-0075-04 A New Class of Geometric Constants in Banach Spaces . ( 79 ) ZHANG Haixia1， CUI Huanhuan2， LI Hao1 (1. Colle

42、ge of Mathematics & Information Science Henan Normal Universityf Xinxiang 453007, China, 2. College of Mathematical Sciencey Luoyang Normal University， Luoyang 411022, China) Abstract: The uniform nonquareness of a Banach space was characterized in this paper. Two new geometric constants H ( X ) and

43、 h ( X ) were introduced. And the relation equation between H ( X ) and the modulus of convexity 8 x ( s ) was obtained. It is also proved that a Banach space is uniformly nonsquare if and only if the value of H ( X ) is less than 2. The exact values of H ( X ) and h (X) for some concrete Banach spa

44、ces are computed. Key words ： Banach space ； harmonic mean ； uniform nonquareness CLC number:0177.2 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)01-0079-04 Output Characteristics of Yb3 +-doped Double-clad Fiber Laser . ( 83 ) ZHANG Liping， LI Xinzhong， ZHEN Zhiqiang (Physics & Engineering School， He

45、nan University of Science & Technology i Luoyang 471023 China) Abstract: Analytical solutions to threshold pump power and output power of Yb3 + -doped double-elad fiber laser were deduced by using rate equations. Under the condition of threshold， the amplified spontaneous emission was considered. Th

46、e cavity mirror reflectivity and the optical fiber length were discussed. The optimal fiber length was investigated. The results show that the smaller cavity mirror reflectivity the higher threshold pump power and output laser power. When the fiber laser runs at the optimal fiber length, the output

47、laser power is highest. Key words: double-clad fiber laser; analytical solution ; spontaneous emission; threshold pump power CLC number:TN248 Document code:A Article ID: 1672-6871 (2014)014)083-05 Experiment of Liquid Refractive Index Sensing Based on Crystal Photonic Band-Gap . ( 88 ) ZHANG Zhilalb， YAN Haitaolalb， LI Libenla lb， HAO Hui2a 2b， WANG Ming2a2b (la. Physics Enginee