噬菌体载体讲稿.ppt

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1、噬菌体载体噬菌体载体第一页，讲稿共五十六页哦n n基因工程又称重组基因工程又称重组DNA技术技术n n其实施至少要有四个必要的条件其实施至少要有四个必要的条件 1.工具酶工具酶 2.基因基因 3.载体载体 4.受体细胞受体细胞 （基因工程基因工程基因工程基因工程.静国忠，静国忠，静国忠，静国忠，8585页）页）页）页）第二页，讲稿共五十六页哦第三页，讲稿共五十六页哦n n噬菌体定义：噬菌体定义：是一类细菌病毒的总称。是一类细菌病毒的总称。n n噬菌体与质粒的区别噬菌体与质粒的区别*质粒：质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分分子。子。*噬菌体：噬菌体：DNA分子

2、除了复制起点之外，还有编分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。码外壳蛋白质的基因。(240(240页页页页)第四页，讲稿共五十六页哦噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜侵染宿主细胞，然后或自主复制

3、繁殖，或整合入宿主基因组中潜侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上

4、述特性使得它们的体或病毒的上述特性使得它们的体或病毒的上述特性使得它们的体或病毒的上述特性使得它们的体或病毒的上述特性使得它们的体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的有用载体，因为：有用载体，因为：有用载体，因为：有用载体，因为：有用载体，因为：有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在

5、受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。第五页，讲稿共五十六页哦第一节第一节 噬菌体的一般生物学特性噬菌体的一般生物学特性n n噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：*一般分为三种类型：一般分为三种类型：无尾部结构的二十面体型。无尾部结构的二十面体型。具尾部结构的二十面体型。具尾部结构的二十面

6、体型。线状体型。线状体型。*大多数噬菌体都属于第二种类型。大多数噬菌体都属于第二种类型。(240(240页页页页)第六页，讲稿共五十六页哦(241(241页页页页)第七页，讲稿共五十六页哦第八页，讲稿共五十六页哦1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：n n噬菌体的核酸：噬菌体的核酸：最常见的是：双链线性最常见的是：双链线性DNA。还有双链环形还有双链环形DNA、单链环形单链环形DNA、单链线形单链线形DNA、单链单链RNA。n n有些噬菌体有些噬菌体DNA碱基不是由标准的碱基不是由标准的A、T、C、G四种碱基组成。四种碱基组成。如如T4噬菌体噬菌体DNA中没有中没有C，取代的

7、是，取代的是5-羟甲羟甲基胞嘧啶（基胞嘧啶（HMC）。）。(240(240页页页页)第九页，讲稿共五十六页哦1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：n n常用作基因工程的噬菌体：常用作基因工程的噬菌体：双链噬菌体：双链噬菌体：噬菌体。噬菌体。*野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多种多种克隆载体。克隆载体。*目前常用的有：目前常用的有：EMBL系列、系列、gt系列、系列、Charon系列。系列。单链噬菌体：单链噬菌体：M13噬菌体。噬菌体。(刘志国，刘志国，刘志国，刘志国，102-105102-105页）页）页）页）第十页，讲稿共五十六页哦2.噬菌

8、体的感染性噬菌体的感染性n n一个噬菌体颗粒一个噬菌体颗粒 感染一个细菌细胞感染一个细菌细胞 迅速形成数百个子代噬菌体颗粒迅速形成数百个子代噬菌体颗粒迅速形成数百个子代噬菌体颗粒迅速形成数百个子代噬菌体颗粒 每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞 再产生出数百个子代颗粒。再产生出数百个子代颗粒。n n如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。能够使数十亿个的细菌细胞致死。n n噬菌斑：噬菌斑：感

9、染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。的空斑。n n菌苔（菌苔（lawn）：）：覆盖培养基表面的单层细菌。覆盖培养基表面的单层细菌。(英英英英含遗工词含遗工词含遗工词含遗工词)(241(241页页页页)第十一页，讲稿共五十六页哦2.噬菌体的感染性噬菌体的感染性n n将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂

10、解之前，将形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培养物涂布在琼脂平板上，此培养物涂布在琼脂平板上，此培养物涂布在琼脂平板上，此培养物涂布在琼脂平板上，20-3020-30分钟之内，头一批感染的分钟之内，头一批感染的分钟之内，头一批感染的分钟之内，头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。n n由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出

11、来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。n n此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的慢慢地

12、向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的噬菌斑噬菌斑噬菌斑噬菌斑。(241(241页页页页)第十二页，讲稿共五十六页哦2.噬菌体的感染性噬菌体的感染性噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：n n烈性噬菌体的生命周期：烈性噬菌体的生命周期：烈性噬菌体的生命周期：烈性噬菌体的生命周期：噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上 DN

13、ADNA注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA复制复制复制复制 合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质 组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌寄主细胞壁被破坏并发生溶菌寄主细胞壁被破坏并发生溶菌寄主细胞壁被破坏并发生溶菌 释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒(241(241页页页页)第十三页，讲稿共五十六页哦234234页页页页n

14、 n噬菌体：噬菌体：细菌病毒。细菌病毒。细菌病毒。细菌病毒。n n烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。胞裂解的噬菌体。胞裂解的噬菌体。胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。n n温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。生溶原性的噬菌体。既能进入

15、溶菌生命周期又能进入溶原既能进入溶菌生命周期又能进入溶原既能进入溶菌生命周期又能进入溶原既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。生命周期的噬菌体。生命周期的噬菌体。生命周期的噬菌体。n n溶原性：溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。n n原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNADNA。n n

16、溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。体的细菌。体的细菌。体的细菌。n n噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。而形成的空斑。而形成的空斑。而形成的空斑。第十四页，讲稿共五十六页哦3.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命

17、周期分为：噬菌体的生命周期分为：n n溶菌周期。溶菌周期。n n溶源周期。溶源周期。两种类型的噬菌体：两种类型的噬菌体：n n烈性噬菌体：只有溶菌周期。烈性噬菌体：只有溶菌周期。n n温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。(242(242页页页页)第十五页，讲稿共五十六页哦3.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶菌生命周期基本过程为：基本过程为：（1 1）吸附：）吸附：）吸附：）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。（2 2）注入：）注入：）注

18、入：）注入：噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA穿过细胞壁注入寄主细胞。穿过细胞壁注入寄主细胞。穿过细胞壁注入寄主细胞。穿过细胞壁注入寄主细胞。（3 3）转变：）转变：）转变：）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。（4 4）合成：）合成：）合成：）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白质。白质。白质。白质。（5 5）组装：）组装：）组装：）组装：包装了包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。的头部和尾部

19、组装成噬菌体颗粒。的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。（6 6）释放：）释放：）释放：）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。(242(242页页页页)第十六页，讲稿共五十六页哦(242(242页页页页)第十七页，讲稿共五十六页哦4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期n n温和噬菌体温和噬菌体感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍然存活着并继续进行细胞分裂。然存活着并继续进行细胞分裂。n n经过了

20、许多世代经过了许多世代之后，如果环境条件正常的话，之后，如果环境条件正常的话，溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。n n寄主细菌会因裂解而致死，寄主细菌会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌释放出许多子代噬菌体颗粒。体颗粒。(243(243页页页页)第十八页，讲稿共五十六页哦234234页页页页n n噬菌体：噬菌体：细菌病毒。细菌病毒。n n烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。

21、只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。n n温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产生感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。命周期的噬菌体。命周期的噬菌体。命周期的噬菌体。n n溶原性：溶原性：溶原性：溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的

22、过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。n n原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。n n溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。的细菌。的细菌。的细菌。n n噬菌斑：噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂在含细菌的固体培

23、养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。解而形成的空斑。、若干基本概念、若干基本概念第十九页，讲稿共五十六页哦4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期、溶源周期的主要特征溶源周期的主要特征（以（以（以（以 噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：（1）噬菌体的噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。分子注入细菌细胞。（2）经过短暂的转录。经过短暂的转录。（3）噬菌体的噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。上，变成原噬菌体。（4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进

24、行复制。菌染色体的一部分进行复制。(243(243页页页页)第二十页，讲稿共五十六页哦(244(244页页页页)第二十一页，讲稿共五十六页哦4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期n n另一种类型的溶源周期另一种类型的溶源周期是以噬菌体是以噬菌体T1为原为原型。比较少见。型。比较少见。n n基本特征是：基本特征是：不存在噬菌体不存在噬菌体DNA分子的整分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒制的环形的质粒DNA分子。分子。(244(244页页页页)第二十二页，讲稿共五十六页哦4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期、超感染免疫性：、

25、超感染免疫性：n n溶源性细菌有两个重要特点：溶源性细菌有两个重要特点：（1）超感染免疫性：）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。免疫性。（2）溶源性细菌的诱发：）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。(245(245页页页页)第二十三页，讲稿共五十六页哦5.重组噬菌体的分离重组噬菌体的分离外源外源外源外源D

26、NA片段片段片段片段 +噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA分子分子分子分子 重组的噬菌体重组的噬菌体重组的噬菌体重组的噬菌体DNADNA分子感染寄主细胞分子感染寄主细胞 用用用用32P P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交 获得阳性克隆获得阳性克隆获得阳性克隆获得阳性克隆 分离大量的重组体噬菌体分离大量的重组体噬菌体DNADNA，实现克隆基因的扩增实现克隆基因的扩增实现克隆基因的扩增实现克隆基因的扩增(247(247页页页页)第二十四页，讲稿共五十六页哦5.重组噬菌体的分离重组噬菌体的分离接种针粘取噬菌体颗粒接种针粘取噬菌体颗粒接种针粘取噬菌体颗粒接种针粘取噬菌

27、体颗粒 新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中 在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯DNADNA与纯蛋白质之间）与纯蛋白质之间）与纯蛋白质之间）与纯蛋白质之间）纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体DNADNA(247(247页页页页)第二十五页，讲稿共五十六页哦(248(248页页页页)第二十六页，讲稿共五十六页哦第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体n n 噬菌体：噬菌体：*分子

28、量为分子量为分子量为分子量为31 x 106 dal。*中等大小的温和噬菌体。中等大小的温和噬菌体。中等大小的温和噬菌体。中等大小的温和噬菌体。*已定位的基因至少有已定位的基因至少有已定位的基因至少有已定位的基因至少有6161个。个。个。个。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬菌另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬菌另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬菌另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬

29、菌体的生命功能。体的生命功能。体的生命功能。体的生命功能。n n人人人人们们们们可可可可以以以以根根根根据据据据需需需需要要要要改改改改变变变变l l l l-DNA-DNA或或或或宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的性性性性质质质质，使使使使噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体或或或或处于处于处于处于溶源状态溶源状态溶源状态溶源状态，或处于，或处于溶菌状态溶菌状态。（张。（张。（张。（张)n nDNA重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要l l l l噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。(张张张张)(248(248页页页页)第二十

30、七页，讲稿共五十六页哦噬菌体：噬菌体：n n作为基因克隆载体的一个重要特性：作为基因克隆载体的一个重要特性：由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬菌体菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞一，可以随着寄主大肠杆菌细胞一道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它们的们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体是整合在大肠杆菌的染色体DNA上，成为后者的一个组成部分。上，成为后者的一个组成部分。(249(249页页页页)第二十八页，讲稿共五十六页哦1.噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述（1 1）基因组的结构：）基因组的结构：）基因组

31、的结构：）基因组的结构：n n碱基对数：碱基对数：碱基对数：碱基对数：48502。n ncoscos位点：位点：位点：位点：线性双链线性双链DNADNA分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由1212个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸组成的彼此完全互补的组成的彼此完全互补的组成的彼此完全互补的组成的彼此完全互补的5 5单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。注入到注入到感染寄主细胞内的感染寄主细胞内的 噬菌体的线性噬菌体的线性噬菌体的线性噬菌体的线性DNADNA分子，会迅速地通过分子，会迅速地

32、通过分子，会迅速地通过分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链粘性末端之间的互补作用，形成双链粘性末端之间的互补作用，形成双链粘性末端之间的互补作用，形成双链DNADNA分子。随后在分子。随后在分子。随后在分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的5-P5-P和和和和3-OH基团封闭起来，基团封闭起来，基团封闭起来，基团封闭起来，并进一步超盘旋化。并进一步超盘旋化。并进一步超盘旋化。并进一步超盘旋化。由这种粘性末端结合形成的双链区称由这种粘性末端结合形成的双链区称为为cos位点。位点。位点。位点。n ncosco

33、s位点：位点：位点：位点：噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNA分子的两端各分子的两端各分子的两端各分子的两端各1212个完全互个完全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。（在包装进蛋白质外壳之前，（在包装进蛋白质外壳之前，（在包装进蛋白质外壳之前，（在包装进蛋白质外壳之前，DNADNA在在在在coscos位点切开成线性）位点切开成线性）位点切开成线性）位点切开成线性）(249(249页页页页)第二十九页，讲稿共五十六页哦(250(250页页页页)第三十页，讲稿共五十六页哦噬菌体基因组的三个区域噬菌体基因组的三个区域n n左侧区：左侧

34、区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。质合成所需要的全部基因。n n中间区：中间区：又称为非必要区。包括与重组以及使噬又称为非必要区。包括与重组以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，和把基因，和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的原噬菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因。基因。n n右侧区：右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因以及溶菌基因。制基因以及溶菌基因。(249(249页页页页)第三十一页，讲稿共五十六页哦(250(250页页页页)第三十二页，

35、讲稿共五十六页哦（2）噬菌体噬菌体DNA的复制的复制n n在在噬菌体感染的噬菌体感染的早期早期，环形的，环形的DNA分子按分子按形形式式从双向进行复制。从双向进行复制。n n到了到了晚期晚期，控制，控制滚环复制滚环复制机理的开关被启动了，机理的开关被启动了，合成出由一系列线性排列的合成出由一系列线性排列的基因组基因组DNA组成的组成的长多连体分子长多连体分子。n n多连体分子经过核酸酶的切割作用，从多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点位点将它分离成将它分离成单体分子单体分子之后，才能够包装。之后，才能够包装。(251(251页页页页)第三十三页，讲稿共五十六页哦在电子显微镜下观察正在复

36、制的在电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域如一只眼睛复制的区域如一只眼睛（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，101101）第三十四页，讲稿共五十六页哦（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，141141）第三十五页，讲稿共五十六页哦（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，141141）第三十六页，讲稿共五十六页哦2.噬菌体载体的构建及其主要类型噬菌体载体的构建及其主要类型（1）构建的基本原理：）构建的基本原理：野生型野生型噬菌体噬菌体DNA，一，一种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。基本原理：删除多余限制位点。基本原理：删除多余限制位

37、点。n n构建的构建的噬菌体的派生载体：噬菌体的派生载体：*插入型载体：插入型载体：只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNA插入的插入的克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此靠近。靠近。*替换型载体：替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的点之间的DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNA片段片段所取代。所取代。(253(253页页页页)第三十七页，讲稿共五十六页哦n n插入型载体：插入型载体：只能承受较小分子量只能承受较小分子量(一般在一般在10kb以内以内)的外源的外源DNA片段的插入，广泛用

38、片段的插入，广泛用于于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。n n替换型载体：替换型载体：可承受较大分子量的外源可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体。物的染色体。(255(255页页页页)第三十八页，讲稿共五十六页哦（2）噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型、插入型载体：、插入型载体：n n插入失活效应：外源的插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的克隆到插入型的噬噬菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。失效力。n n免疫功能失活的插入型载体：免疫功能失活的插入

39、型载体：在基因组的免疫区在基因组的免疫区中插入外源中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性片段，载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。只能形成清晰的噬菌斑。只能形成清晰的噬菌斑。*有外源有外源DNA插入：插入：清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。*没有外源没有外源DNA插入：插入：亲本噬菌体可以进入溶源亲本噬菌体可以进入溶源状态，形成状态，形成浑浊的噬菌斑。浑浊的噬菌斑。n n-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）下页）(255(255页页页页)第三十九页，讲稿共五十六页哦-半乳糖苷酶失活的插入型载体：半

40、乳糖苷酶失活的插入型载体：n n这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5lac5区段，其中有区段，其中有区段，其中有区段，其中有编码编码编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的基因的基因的基因的基因lacZ。n n这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有IPTGIPTG和和和和XgalXgal的培养基平板上，会形成的培养基平板上，会形成的培养基平板上，会形成的培养基

41、平板上，会形成蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑。n n如果如果如果如果外源外源外源外源DNADNA插入到插入到插入到插入到lac5lac5区段上，阻断了区段上，阻断了-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因基因基因基因lacZ的编码序列，那么由这种的编码序列，那么由这种 重组体感染的重组体感染的重组体感染的重组体感染的laclac-指示菌，由指示菌，由指示菌，由指示菌，由于不能合成于不能合成于不能合成于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。无色的噬菌斑。无色的噬菌斑。无色的噬菌斑。n n如使用大肠杆菌如使用

42、大肠杆菌如使用大肠杆菌如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源指示菌，无论有无外源DNADNA插入，都形插入，都形插入，都形插入，都形成成成成蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑。n n可以应用可以应用可以应用可以应用Xgal-IPTGXgal-IPTG显色技术检测转化子。显色技术检测转化子。显色技术检测转化子。显色技术检测转化子。(256(256页页页页)第四十页，讲稿共五十六页哦n n具有功能活性的具有功能活性的具有功能活性的具有功能活性的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶是四聚体。是四聚体。是四聚体。是四聚体。n nXgalXgal（5-bromo-4-chloro-3-i

43、ndolyl-5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside-D-galactoside)：无色化合物。：无色化合物。：无色化合物。：无色化合物。-半半半半乳糖苷酶能将无色的乳糖苷酶能将无色的乳糖苷酶能将无色的乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成切割成切割成切割成半乳糖半乳糖半乳糖半乳糖和和和和深蓝色深蓝色的底物的底物的底物的底物5-5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝。因此，。因此，。因此，。因此，XgalXgal可作为检测可作为检测可作为检测可作为检测-半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。n nIPTGIPTG

44、：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成它可以诱导细胞合成它可以诱导细胞合成它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。称称IPTGIPTG为为为为-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的安慰安慰安慰安慰诱导物诱导物。乳糖诱导物乳糖诱导物乳糖诱导物乳糖诱导物IPTGIPTG（372372页）页）页）页）Xgal-IPTG显色反应显色反应（285285页）页）页）页）第四十一页，讲稿共五十六页

45、哦(257(257页页页页)第四十二页，讲稿共五十六页哦、替换型载体、替换型载体n n又叫取代型载体。又叫取代型载体。n n在其中央部分有一个可以被外源在其中央部分有一个可以被外源DNA分子所取代分子所取代的的DNA片段的克隆载体。片段的克隆载体。n n安排在中间可取代片段两侧的安排在中间可取代片段两侧的多克隆位点多克隆位点是反向是反向重复排列，当外源重复排列，当外源DNA插入时，一对克隆位点插入时，一对克隆位点之间的之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源高了克隆外源DNA片段的能力。片段的能力。(256(256页页页页)第四十三页，讲稿共五十六页

46、哦(257(257页页页页)第四十四页，讲稿共五十六页哦、替换型载体、替换型载体n n例子：例子：M.Thomas等人（等人（1974）发展的）发展的gtc，可可处于稳定的溶源状态，产生浑浊型的噬菌斑。处于稳定的溶源状态，产生浑浊型的噬菌斑。可可取代部分被取代之后，不能进入溶源状态，形成取代部分被取代之后，不能进入溶源状态，形成清晰型的噬菌斑。清晰型的噬菌斑。(256(256页页页页)第四十五页，讲稿共五十六页哦用替换型载体克隆外源用替换型载体克隆外源DNA片段包括三个步骤片段包括三个步骤n n第一：第一：应用适当的核酸内切限制酶消化应用适当的核酸内切限制酶消化载体，载体，除去基因组中可取代的

47、除去基因组中可取代的DNA区段。区段。n n第二：第二：将所得的将所得的DNA臂同外源臂同外源DNA片段连接。片段连接。n n第三：第三：对重组的对重组的DNA分子进行包装和增殖，以分子进行包装和增殖，以得到有感染性的得到有感染性的重组噬菌体。重组噬菌体。(258(258页页页页)第四十六页，讲稿共五十六页哦（3）凯伦噬菌体载体）凯伦噬菌体载体n n有插入型（如凯伦有插入型（如凯伦2）、替换型（如凯伦）、替换型（如凯伦30）。）。基本都含有基本都含有-半乳糖苷酶基因。半乳糖苷酶基因。n n使用凯伦载体的一般程序：使用凯伦载体的一般程序：用限制酶酶切载体用限制酶酶切载体产生左臂、中央区段、右臂，

48、并分离产生左臂、中央区段、右臂，并分离两臂与外源两臂与外源DNA连接连接 包装成具感染能力的噬菌体颗粒包装成具感染能力的噬菌体颗粒涂布在敏感细菌平板上（含有涂布在敏感细菌平板上（含有Xgal）有外源有外源DNA插入的噬菌体，形成无色噬菌斑，插入的噬菌体，形成无色噬菌斑，没有插入的噬菌体，形成蓝色噬菌斑没有插入的噬菌体，形成蓝色噬菌斑第四十七页，讲稿共五十六页哦(253(253页页页页)第四十八页，讲稿共五十六页哦3.噬菌体的改良噬菌体的改良n nSpiSpi+表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：野生型野生型野生型野生型噬菌体有噬菌体有噬菌体有噬菌体有red和和和和gamga

49、m基因。不基因。不能在能在P2P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为Spi+（sensitive of P2 inhibitionsensitive of P2 inhibition）。即对）。即对）。即对）。即对P2P2噬菌体的抑制作用噬菌体的抑制作用呈敏感反应。呈敏感反应。n nSpiSpi-表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了red和和和和gamgam基因，例如基因，例如基因，例如基因，例如被外源被外源被外源被外源DNA

50、所取代，这样的噬菌体则获得了所取代，这样的噬菌体则获得了SpiSpi-的表型，的表型，的表型，的表型，能够在噬菌体能够在噬菌体能够在噬菌体能够在噬菌体P2P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。斑。斑。斑。n n在应用具有在应用具有在应用具有在应用具有redred和和gamgam基因的替换型载体作基因克隆实基因的替换型载体作基因克隆实验中，验中，可以按照可以按照可以按照可以按照SpiSpi特性来选择重组体。特性来选择重组体。特性来选择重组体。特性来选择重组体。n nSpSp-表型提供