噬菌体和粘粒载体课件.ppt

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1、第一节 噬菌体的一般生物学特性噬噬菌菌体体颗颗粒粒基基本本类类型型:无无尾尾二二十十面面体体型型、具尾二十面体型具尾二十面体型和和线状体型线状体型。噬噬菌菌体体的的核核酸酸，最最常常见见的的是是双双链链线线性性DNA。除除此此之之外外，还还发发现现有有双双链链环环形形DNA、单单链链环环形形DNA、单单链链线线性性DNA以及以及单链单链RNA等多种形式等多种形式。5.1.1.1结构及核酸结构及核酸返回第五章返回第五章少少量量噬噬菌菌体体感感染染高高浓浓度度寄寄主主细细胞胞后后，涂涂板板，结结果果在在平平板板上上，以以最最初初被被感感染染的的细胞为中心，形成大量的细胞为中心，形成大量的噬菌斑噬菌

2、斑。5.1.1.2噬菌体的感染性噬菌体的感染性返回第五章返回第五章（1）尾部末端）尾部末端吸附吸附；（2）通过尾轴把）通过尾轴把DNA全部全部注入注入到细胞到细胞，蛋白质外壳则留在胞外；，蛋白质外壳则留在胞外；（3）噬菌体的）噬菌体的DNA在细菌体内在细菌体内合成合成自自身身DNA和蛋白质；和蛋白质；（4）新合成）新合成DNA与蛋白质与蛋白质组装组装子代噬子代噬菌体；菌体；（5）细菌的解体）细菌的解体,子代噬菌体子代噬菌体释放释放。具体过程：具体过程：返回第五章返回第五章p裂裂解解寄寄主主细细胞胞，释释放放子子代代噬噬菌菌体体的生命周期的生命周期p只只具具有有溶溶菌菌生生长长周周期期的的噬噬菌

3、菌体体叫叫做做烈性噬菌体烈性噬菌体。5.1.噬茵体的溶菌生命周期噬茵体的溶菌生命周期溶菌生长周期之间的共同特征：溶菌生长周期之间的共同特征：1吸吸附附：2注注入入：3转转变变：4合合成：成：5组装：组装：6释放：释放：.1.噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期返回第五章返回第五章温和噬菌体温和噬菌体：溶溶源源性性细细菌菌：整整合合有一套完整的噬菌体基因组的细菌。溶溶源源化化：用温和噬菌体感染细菌使之形成溶源性细菌的过程。原原噬噬菌菌体体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA。5.1.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬感染过程中没有产生出子代噬

4、菌体颗粒，噬菌体菌体DNA是整合到寄主细胞染色体是整合到寄主细胞染色体DNA上，上，成为它的一个组成部分。成为它的一个组成部分。只有双链只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。的噬菌体才具有溶源周期。返回第五章返回第五章已已知知存存在在两两种种不不同同类类型型的的溶溶源源周周期期，其其中中最最普普遍遍的的一一种种是是以以噬噬菌菌体体为原型，具有如下特性：为原型，具有如下特性：噬菌体的噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。分子注入细菌细胞。短短暂暂的的转转录录期期之之后后，合合成成一一种种整整合合酶酶，之之后后转转录录活活性性便便被被一一种种阻阻遏物所关闭。遏物所关闭。噬菌体噬菌体DNA分子插入到细菌染

5、色体基因组分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。上，变成原噬菌体。细细菌菌继继续续生生长长、增增殖殖，噬噬菌菌体体的的基基因因作作为为细细菌菌染染色色体体的的一一部部分分进进行复制。行复制。5.1.2.1溶源周期的主要特征溶源周期的主要特征返回第五章返回第五章另一种类型的溶源周期是以噬菌体另一种类型的溶源周期是以噬菌体PI为原型为原型，较为少见，其基本特征是不存，较为少见，其基本特征是不存在噬菌体在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒质粒DNA分子。分子。返回第五章返回第五章返回第五章返回第五章

6、溶源性细菌溶源性细菌有有两个重要特点两个重要特点：第第一一，溶溶源源性性细细菌菌不不能能够够被被头头一一次次感感染染并并使使之之溶溶源源化化的的同同种种噬噬菌菌体体感感染染。溶溶源源性性细细菌菌所所具具有有的的这这种种抗抗御御同同种种噬噬菌菌体体感感染染的的性性质质，叫叫超超感染免疫性感染免疫性。第第二二，经经过过许许多多世世代代之之后后，溶溶源源性性细细菌菌便便能能够够开开始始进进入入溶溶菌菌周周期期，这这一一过过程程叫叫溶溶源源性性细细菌菌的的诱诱发发。在在诱诱发发过过程程中中，噬噬菌菌体体基基因因组组以以单单一一DNA片段的形式从寄主染色体片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来上删除下来

7、。5.1.2.2超感染免疫性超感染免疫性返回第五章返回第五章阻阻遏遏基基因因cI编编码码的的阻阻遏遏蛋蛋白白，与与两两个个分分别别同同启启动动基基因因PL、PR相相邻邻的的操操纵纵基因基因OL和和OR结合结合。噬菌体的超感染免疫性现象噬菌体的超感染免疫性现象-阻遏一操纵体系阻遏一操纵体系p阻遏物能够持续地合成，产量就其操纵基因而言是略为超量的。阻遏物能够持续地合成，产量就其操纵基因而言是略为超量的。p由于阻遏物同由于阻遏物同OL和和OR结合，结合，PL和和PR这两个早期启动子开始的转录被这两个早期启动子开始的转录被抑制的。使原噬菌体保持抑制的。使原噬菌体保持“关闭关闭”的形式，这就是的形式，这

8、就是溶源性细菌能够不停溶源性细菌能够不停地生长而不发生溶菌裂解地生长而不发生溶菌裂解的原因。的原因。p同时，后进入的同类噬菌体由于同时，后进入的同类噬菌体由于PL和和PR被抑制，无法溶原化。称这种被抑制，无法溶原化。称这种抑制作用抑制作用同源免疫超感染抗性同源免疫超感染抗性。返回第五章返回第五章超感染的超感染的噬菌体噬菌体DNA将会发生什么样的变化呢？将会发生什么样的变化呢？这种这种DNA可形成超盘旋的结构，由于处在超盘旋结构状态的可形成超盘旋的结构，由于处在超盘旋结构状态的DNA复制基因复制基因很难进行复制，而细菌细胞却没有受到影响，仍能正常地生长和分裂，结果很难进行复制，而细菌细胞却没有受

9、到影响，仍能正常地生长和分裂，结果经过若干世代之后，在细菌细胞群体中，感染的经过若干世代之后，在细菌细胞群体中，感染的DNA分子便逐渐地被稀释掉分子便逐渐地被稀释掉了了。返回第五章返回第五章p有有些些温温和和噬噬菌菌体体，如如噬噬菌菌体体21和和434，各各自自具具有有自自身身的的免免疫疫体体系系，具具有有自自身身的的阻阻遏遏基基因因和和操操纵纵基基因因。因因此此，其其阻阻遏遏物物不不能能同同的的操操纵纵基基因因结结合合；反反过过来来，的的阻阻遏遏物物，也也不不能能够够同同21和和434噬噬菌菌体体的的操操纵纵基基因因结结合合。这这样样的的一一对对噬噬菌菌体体，互称为异源免疫性互称为异源免疫性

10、。p温和噬菌体可以在异源免疫性的溶源性细菌的菌苔上形成噬菌斑。温和噬菌体可以在异源免疫性的溶源性细菌的菌苔上形成噬菌斑。p噬菌体噬菌体DNA的免疫性区段（包括的免疫性区段（包括cI基因、操纵基因和启动基因），以基因、操纵基因和启动基因），以imm表表示，如示，如imm、imm21和和imm434等。等。5.1.2.3异源免疫性异源免疫性返回第五章返回第五章p溶溶源源性性细细菌菌中中的的阻阻遏遏基基因因处处于于失失活活状状态态时时，操操纵纵基基因因就就将将是是自自由由的的，转转录录就就会会正常启动，诱发噬菌体进入裂解途径。正常启动，诱发噬菌体进入裂解途径。p噬菌体的诱发噬菌体的诱发还需要合成一种

11、叫做还需要合成一种叫做删除酶删除酶的噬菌体产物。的噬菌体产物。p删删除除酶酶的的功功能能是是将将原原噬噬菌菌体体DNA从从细细菌菌染染色色体体DNA上上删删除除下下来来，而而后后环环化化成成环形的环形的DNA分子。分子。5.1.2.4溶源噬菌体的诱发溶源噬菌体的诱发返回第五章返回第五章 pDNA整整合合在在染染色色体体上上的的位位点点叫叫做做附着位点附着位点att.p大大多多数数的的温温和和噬噬菌菌体体都都整整合合在在特特定定位位置置上上。少少数数一一些些噬噬菌菌体体可可整整合合在在数数个个位位点点上上，甚甚至至染染色色体体的任何一个位点上。的任何一个位点上。p整整合合酶酶:由由基基因因int

12、编编码码,能能够够识识别别DNA和和细细菌菌DNA的的附附着着位位点点，并并能能催催化化这这两两种种DNA之之间间发发生生链链的交换。的交换。5.1.2.5附着位点附着位点attDNA首先环化，然后通过在两个首先环化，然后通过在两个att物理性的破裂，并进行准确的噬菌物理性的破裂，并进行准确的噬菌体体DNA和寄主和寄主DNA的再接合，从而的再接合，从而发生整合作用发生整合作用返回第五章返回第五章疑问疑问-插入之后为何不马上删除呢？插入之后为何不马上删除呢？删删除除应应该该比比插插入入更更容容易易发发生生，因因为为此此时时两两个个附附着着位点都是存在于同一位点都是存在于同一DNA分子上。分子上。

13、实际上：实际上：整合与删除不是同一过程。整合与删除不是同一过程。其原因是整合后的位点是杂合的。其原因是整合后的位点是杂合的。返回第五章返回第五章第二节 噬菌体载体p研研究究得得最最为为详详尽尽，双双链链DNA，分分子子量量31106，48502bp;中中等等大大小小，温和噬菌体。温和噬菌体。p基基因因至至少少有有61个个，其其中中有有一一半半参参与与生生命命周周期期的的活活动动，称称为为必必须须基基因因；另一部分基因为另一部分基因为非必须基因非必须基因。p溶源周期中溶源周期中整合整合在染色体在染色体DNA上上(作为克隆载体的重要特性作为克隆载体的重要特性)。p其它优点：其它优点：l研究历史悠久

14、研究历史悠久；l寄主范围较质粒狭窄寄主范围较质粒狭窄，更加安全；，更加安全；l噬菌体噬菌体DNA两端具有由两端具有由12个核着酸组成的粘性末端，可用来个核着酸组成的粘性末端，可用来构建质粒类载体构建质粒类载体。返回第五章返回第五章基基因因除除了了两两个个正正调调节节基基因因N和和Q之之外外，其其余余的的是是按按功功能能成成簇簇:头头部部、尾尾部部、复复制及重组制及重组四大功能基因簇。四大功能基因簇。为叙述方便，往往划分为三个区域：为叙述方便，往往划分为三个区域：5.2.1基因组结构基因组结构左侧区：左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因；包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部

15、蛋白质合成所需要的全部基因；中间区：中间区：又称为非必要区，包括一些与重组有关的基因（例如又称为非必要区，包括一些与重组有关的基因（例如redA和和redB），），以及以及int基因，和基因，和xis基因。基因。右侧区：右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因以及溶菌基因包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因以及溶菌基因G和和R。返回第五章返回第五章(1)red和和gam控控制制DNA的的重重组组作作用用，在在感感染染的的早早期期使使寄寄主主RecBC蛋蛋白白质质失失去去功功能能（RecBC蛋蛋白白质质是是一一种种多多功功能能的的核核酸酸酶酶，它具有核酸内切酶和核酸外切酶活性它具有核

16、酸内切酶和核酸外切酶活性）。）。(2)xis和和int基因基因(3)N和和Q编码抗终止因子，分别控制早期功能和晚期功能的调节；编码抗终止因子，分别控制早期功能和晚期功能的调节；(4)cI基因编码的蛋白质是一种阻遏物；基因编码的蛋白质是一种阻遏物；cro蛋白也是一种阻遏物，能同操纵蛋白也是一种阻遏物，能同操纵基因基因OL和和OR结合而抑制转录结合而抑制转录返回第五章返回第五章早期早期，按，按 式复制式复制晚期晚期，滚环复制。，滚环复制。受受gam基基因因产产物物控控制制，抑抑制制RecBC酶酶(内内、外外切切酶酶)gam+的的噬噬菌菌体体只只能能产产生生出多连体的出多连体的DNA分子，分子，ga

17、m-噬噬菌菌体体只只能能产产生生出出单单体分子。体分子。5.2.2 噬菌体DNA的复制返回第五章返回第五章消去多余的限制位点消去多余的限制位点和和非必要的区段非必要的区段:野野生生型型的的，有有过过多多的的限限制制位位点点，例例如如有有5个个EcoRI的的限限制制位位点点和和7个个Hindlll的的限限制位点。制位点。所以说，构建所以说，构建载体的载体的基本原理基本原理是多余限制位点的删除。是多余限制位点的删除。（1）构建）构建噬菌体载体的基本原理噬菌体载体的基本原理5.2.3 噬茵体载体的构建及其主要类型返回第五章返回第五章将将噬噬菌菌体体感感染染到到具具有有EcoRI限限制制一一修修饰饰体

18、体系系和和不不具具有有EcoRI限限制制一一修修饰体系饰体系的两种寄主细胞中循环生长。的两种寄主细胞中循环生长。将将得得到到的的完完全全失失去去EcoRI位位点点的的，同同野野生生在在体体内内进进行行杂杂交交，然然后后选选择仅具有择仅具有1-2个限制位点重组体噬菌体。个限制位点重组体噬菌体。（2）筛选失去固有EcoRI 位点的突变体的办法返回第五章返回第五章插入型载体插入型载体外源的外源的DNA克隆到插入型的人载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，克隆到插入型的人载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的即所谓的插入失活效应插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，插入型的人

19、载体又可以进。根据插入失活效应的特异性，插入型的人载体又可以进一步区分为一步区分为免疫功能失活免疫功能失活的和的和大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶失活半乳糖苷酶失活的两种。的两种。（）（）噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型返回第五章返回第五章基因组中有一段免疫区基因组中有一段免疫区imm当当外外源源DNA插插入入时时，合合成成活活性性阻阻遏遏物物的的功功能能遭遭受受破破坏坏，而而不不能能进进入入溶溶源源周期。周期。重重组组体体都都只只能能形形成成清清晰晰的的噬噬菌菌斑斑，而而没没有有外外源源DNA插插入入的的亲亲本本噬噬菌菌体体就就会形成混浊的噬菌斑会形成混浊的噬菌斑。imm免疫功能失活的插入

20、型载体：免疫功能失活的插入型载体：返回第五章返回第五章基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ 区段lacZ开半乳糖苷酶失活的插入型载体开半乳糖苷酶失活的插入型载体指示菌：lac一培养基：IPTG和Xgal返回第五章返回第五章又叫做取代型载体又叫做取代型载体：提高克隆外源：提高克隆外源DNA片段的能力。片段的能力。MThomas等等人人（1974）:替替换换型型载载体体AgtAc，可可取取代代片片段段含含有有att、int及及xis三三个基因。个基因。野生型载体可以处于稳定的溶源状态，并能产生出混浊型的噬菌斑。野生型载体可以处于稳定的溶源状态，并能产生出混浊型的噬菌斑。重组体载体失去了整合作用的功能

21、，不能进入溶源状态，产生出清晰型的噬菌斑。重组体载体失去了整合作用的功能，不能进入溶源状态，产生出清晰型的噬菌斑。替换型载体替换型载体返回第五章返回第五章凯凯伦伦噬噬菌菌体体是是FRBlattner等等人人于于1977年年在在噬噬菌菌体体基基础础上上发发展展出出来来的一种特殊的噬菌体载体。的一种特殊的噬菌体载体。凯凯伦伦（Charon）是是古古希希腊腊神神话话中中的的一一位位老老摆摆渡渡工工，专专司司在在斯斯蒂蒂克克斯斯河河（RiverStyx）上上运运送送亡亡灵灵到到阴阴间间。所所以以Blattner形形象象地地称称自自己己所所构构建建的的噬菌体为凯伦载体。噬菌体为凯伦载体。这类载体这类载体

22、有插入型有插入型的，如凯伦的，如凯伦2；也有替换型的也有替换型的，如凯伦，如凯伦30。许许多多Charon噬噬菌菌体体载载体体，都都带带有有编编码码着着从从半半乳乳糖糖苦苦酶酶基基因因以以及及它它的的操操纵纵基因和启动子的基因和启动子的lae取代区段。取代区段。凯伦噬菌体载体返回第五章返回第五章第第一一，核核酸酸内内切切酶酶消消化化载载体体，除去可取代的除去可取代的DNA区段。区段。第第二二，DNA臂臂同同外外源源DNA片段连接。片段连接。第第三三，重重组组体体的的DNA分分子子进进行行包包装装和和增增殖殖，得得到到有有感感染染性性的的重组噬菌体。重组噬菌体。用替换型载体克隆外源用替换型载体克

23、隆外源DNA包括三个步骤：包括三个步骤：返回第五章返回第五章5.2.4 噬茵体载体的改良改良改良噬菌体载体的噬菌体载体的首要目的首要目的在于增加在于增加容纳能力容纳能力。除此之外，改良工作还围绕着如下三个主要目的进行：除此之外，改良工作还围绕着如下三个主要目的进行：设计可对重组分子正选择的设计可对重组分子正选择的噬菌体载体噬菌体载体可转录重组可转录重组DNA以制备其以制备其RNA探针探针使重组使重组cDNA与与LacZ融合形成融合蛋白融合形成融合蛋白返回第五章返回第五章一一批批经经过过改改良良的的载载体体的的一一个个共共同同特特点点是是，在在中中心心限限制制片片段段上上具具有有的的两两个个基基

24、因因：red和和gam(决决定定sensitive to P2 inhibition，即即不能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长）。redgamSpi-正选择的噬菌体载体野生型：表型为Spi突变型：表型为SPi一，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。返回第五章返回第五章应应用用载载体体获获得得了了阳阳性性噬噬菌菌班班后后，必必须须对对克克隆隆的的基基因因进进行行鉴鉴定定，而而且且大大分分子子量量的的载载体体在在限限制制图图的的构构建建及及基基因因序序列列测测定定方方面面都都是是相相当当麻麻烦烦的的。因因此此，以以往往是是在在分分离离到到了了含含有有目目的的基基因因的的载载体体之

25、之后后，先先把把插插入入其其中中的的外外源源DNA片片段段亚亚克克隆隆到到质质粒粒载载体体上上，再再进进行行各各项项有有关关的的分分析析。这这是是一一种相当烦琐的过程种相当烦琐的过程。能能否否发发展展出出一一种种可可将将插插入入的的DNA片片段段直直接接从从载载体体转转移移到到质质粒粒载载体体的的快快速简便的体内系统呢？速简便的体内系统呢？具有体内删除特性的噬菌体载体-ZAP载体返回第五章返回第五章ZAP本本质质上上是是插插入入型型载载体体。基基因因组组中中含含有有一一个个可可以以在在体体内内发发生生删删除除作作用用的的pBluescript噬噬菌菌粒粒（见见本本章章第第五五节节）的的DNA片

26、片段段，两两侧是由两个单链侧是由两个单链DNA噬菌体噬菌体fi的复制信号。的复制信号。pBluescript SK(+/-)2958 bp重组ZAP载体感染细胞后，再用辅助噬菌体M13（或fi）超感染。返回第五章返回第五章ZAP载体的主要特点单个酶的单识别位点，可以克隆单个酶的单识别位点，可以克隆10kb大小的外源大小的外源DNA片段；片段；能从能从lacZ启动子表达启动子表达lacZ/外源外源DNA的融合蛋白质，并可用抗体筛选；的融合蛋白质，并可用抗体筛选；lacZ基因部位有单克隆位点，可在基因部位有单克隆位点，可在Xgal显色反应平板上筛选；显色反应平板上筛选；克克隆隆的的外外源源DNA片

27、片段段，可可在在体体内内自自动动地地从从载载体体上上随随pBluescriptSK（一一）一一道道删删除除下下来来，置置于于较较小小型型的的噬噬菌菌粒粒载载体体上上，便便于于进进行行限限制制图图的的构构建建和和DNA核酸序列的测定。核酸序列的测定。利利用用T3或或T7噬噬菌菌体体的的RNA聚聚合合酶酶，可可方方便便地地制制备备外外源源DNA插插入入序序列列的的RNA转录本，制备转录本，制备RNA探针。探针。返回第五章返回第五章5.2.5 重组体 DNA分子的体外包装由由寄寄主主细细胞胞捕捕获获裸裸露露的的噬噬菌菌体体DNA的的过过程程叫叫做做转转染染（transfection），它有别于以噬菌

28、体颗粒为媒介的它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导转导（transduction）。）。转染转染本质上同质粒本质上同质粒DNA的的转化转化作用作用,但但转染转染是一种低效的过程是一种低效的过程。即即便便是是使使用用未未经经任任何何处处理理的的新新鲜鲜DNA，典典型型的的转转染染效效率率（即即每每微微克克DNA转染产生的噬菌班数目），也仅为转染产生的噬菌班数目），也仅为105106之间。之间。返回第五章返回第五章应用应用体外包装技术体外包装技术，把重组，把重组DNA分子包装成成熟的分子包装成成熟的噬菌噬菌体颗粒体颗粒，从而能够按照正常，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄主的噬菌体感染过程导入寄主

29、细胞，明显地细胞，明显地提高提高重组体重组体DNA分子转染效率。分子转染效率。所谓所谓DNA的体外包装作用，就是要在体外试管中，完成上述发生于寄的体外包装作用，就是要在体外试管中，完成上述发生于寄主细胞内的全部包装过程。主细胞内的全部包装过程。返回第五章返回第五章返回第五章返回第五章5.2.5 噬菌体 DNA的包装限制问题噬噬菌菌体体头头部部外外壳壳蛋蛋白白质质容容纳纳DNA的的能能力力是是有有一一定定限限度度的的。上上限限不不得得超超过过其其正正常野生型常野生型DNA总量的总量的575。这就是。这就是噬菌体的包装限制。噬菌体的包装限制。野生 DNA分子长度为 48kb计算，其其包装上限是 k

30、b。野生 DNA中必要基因28kb，因此载体克隆外源DNA的理论极限值应是 kb。替换型载体中的可取代片段，超过其替换型载体中的可取代片段，超过其DNA总量总量25，就不能被有效地包装，就不能被有效地包装，只有在新只有在新DNA片段插入的情况下，才能形成噬菌斑。片段插入的情况下，才能形成噬菌斑。返回第五章返回第五章5.2.6 重组分子的选择方法CI基基因因编编码码的的阻阻遏遏蛋蛋白白质质，是是促促使使大大肠肠杆杆菌菌寄寄主主细细胞胞进进入入溶溶源源化化状状态态的的必必要要条条件件。CI基基因因失失活活或或缺缺失失的的噬噬菌菌体体在在培培养养基基菌菌苔苔上上形形成成的的是是清清亮亮型型的噬菌斑。

31、的噬菌斑。CI，清亮型的噬菌斑清亮型的噬菌斑CI+，混浊型的噬菌斑，混浊型的噬菌斑（l）CI基因功能选择法基因功能选择法噬菌体载体不具有抗菌素抗性选择记号。噬菌体载体不具有抗菌素抗性选择记号。对重组体的选择，除了采用正选择方法之外，主要是依据噬菌斑的形对重组体的选择，除了采用正选择方法之外，主要是依据噬菌斑的形态学特征和态学特征和XgallPTG显色反应作出判断的。显色反应作出判断的。返回第五章返回第五章（2）lacZ基因功能选择法基因功能选择法lacZ（3）Spi一选择法一选择法redgam的red和gam 蛋白质会抑制噬菌体使之无法在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长返回第五章返回第

32、五章5.2.7 克隆在噬菌体载体上的外源基因的表达大大多多数数的的噬噬菌菌体体都都是是在在其其PL启启动动子子或或PR启启动动子子能能够够进进行行有有效效转转录录的的区区段上接受外源段上接受外源DNA的插入的。的插入的。返回第五章返回第五章第三节 柯斯质粒载体“cosmid”是是英英文文cos site-carryingplasmid”缩缩写写，其其原原意意是是指指带带有有粘粘性性末末端端位位点点的的质质粒粒。因因此此，所所谓谓柯柯斯斯质质粒粒，乃乃是是一一类类由由人人工工构构建建的的含含有有DNA的的COS序序列列和和质质粒粒复复制制子子的的特特殊殊类类型型的的质质粒粒载体。载体。返回第五章

33、返回第五章p具有噬菌体的特性：.p具有质粒载体质粒载体的特性：.p具有高容量的克隆能力：.柯斯质粒载体的柯斯质粒载体的特点特点返回第五章返回第五章柯斯克隆柯斯克隆返回第五章返回第五章柯斯克隆改良柯斯克隆改良-1返回第五章返回第五章柯斯克隆改良柯斯克隆改良-2返回第五章返回第五章第四节 单链丝状噬菌体载体包括M13、f1、fd 组织形式相同，颗粒大小，形状相近，DNA同源高，98%差异位于第三密码子，互补活跃，彼此间易重组，视为等同.返回第五章返回第五章5.4.1 特点v都都以以双双链链环环行行DNADNA为为中中间间体体，形形成成RF RF DNA DNA（replicativereplica

34、tive formform复复制制型型DNA DNA）v不不论论ssDNAssDNA还还是是RF RF DNADNA，都都能能转转染染大大肠肠杆杆菌菌，或或产产生生噬噬菌菌斑斑，或或形形成成菌菌落落 v细细胞胞外外组组装装，颗颗粒粒大大小小受受其其DNADNA多多寡制约，不存在包装限制寡制约，不存在包装限制v可容易测得可容易测得DNADNA插入方向插入方向v可可大大量量制制备备含含外外源源DNA DNA 的的单单链链DNADNA分子分子基因基因V:类似类似SSB,结合（结合（+）DNA返回第五章返回第五章5.4.3 M13噬菌体载体-互互补补：插插入入一一段段laclac DNADNA片片段段

35、，即即 带带 有有-半半 乳乳 糖糖 苷苷 酶酶 基基 因因（lacZlacZ）的的调调控控序序列列及及其其N N端端头头146146个个aaaa编编码码信信息息，宿宿主主F F因因子子携携带带缺失第缺失第11-4111-41位氨基酸的位氨基酸的lacZlacZ M13噬菌体载体克隆体系：噬菌体载体克隆体系：包括载体包括载体本身和寄住菌株两部分本身和寄住菌株两部分返回第五章返回第五章有时不稳定，不作为常规克隆载体和增殖，主要用于制备单链有时不稳定，不作为常规克隆载体和增殖，主要用于制备单链DNADNA 用双脱氧链终止法测序用双脱氧链终止法测序 寡核苷酸定点诱变寡核苷酸定点诱变 ssDNAssD

36、NA探针探针返回第五章返回第五章5.4.4 噬菌体展示载体丝状噬菌体表面一端存在丝状噬菌体表面一端存在35拷贝基因拷贝基因蛋白，与组装和吸附有关。蛋白，与组装和吸附有关。返回第五章返回第五章第五节 噬菌粒载体用于制备用于制备ssDNAssDNA带有丝状噬菌体复制起点的质粒带有丝状噬菌体复制起点的质粒含含phagemidphagemid的的细细菌菌被被M13M13（或或f1f1）（Help Help phagephage）感感染染后后，基基因因IIII蛋蛋白白作作用于间隔区，启动滚环复制用于间隔区，启动滚环复制ssDNAssDNA包装包装挤压出细胞挤压出细胞返回第五章返回第五章同同M13相比：相

37、比：分子量小分子量小克隆能力大克隆能力大能稳定遗传能稳定遗传可制备单、双连可制备单、双连DNADNAdsDNAdsDNA稳定，高产，具有质粒的特征稳定，高产，具有质粒的特征免却亚克隆至免却亚克隆至M13M13得到得到1010kb kb ssDNAssDNA 缺点：缺点：ssDNAssDNA产量低，重复性差产量低，重复性差 返回第五章返回第五章pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118/pUC119噬菌粒载体噬菌粒载体返回第五章返回第五章返回第五章返回第五章噬菌粒载体的优点（1 1）小分子量、拷贝数高的）小分子量、拷贝数高的cccDNAcccDNA，可克隆高达，可克隆高达10 kb

38、10 kb的外源的外源DNADNA；（2 2）有）有ampampr r 等基因作为选择记号；等基因作为选择记号；（3 3）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制；粒一样复制；（4 4）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链合成出单链DNADNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。（5 5）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。返回第五章返回第五章噬菌

39、粒体外转录载体返回第五章返回第五章返回第五章返回第五章第六节 人工染色体载体5.6.1酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(yeast artificial chromosome)yeast artificial chromosome)具真核mRNA的加工活性,克隆能力达1000kb以上。复制的必须成分复制的必须成分:复制起点复制起点oriori,自主复制序列自主复制序列ARSARS autonomously replicating sequence autonomously replicating sequence着丝粒（着丝粒（CENCEN）使使染染色色体体在在分分裂裂过过程程中中能能正正

40、确确分分配配到到子子细细胞胞中中有有丝丝分分裂裂中中的的纺纺锤锤丝丝联系的那段联系的那段DNADNA两个端粒（两个端粒（TELTEL）即末端基因，末端复制所必需，且可防止染色体被核酸酶降解即末端基因，末端复制所必需，且可防止染色体被核酸酶降解返回第五章返回第五章5.6.2人工细菌染色体载体人工细菌染色体载体克隆的片段大小克隆的片段大小10-21510-215kbkb，平均平均100100kbkb，少量大于少量大于300300kbkb BACBAC载载体体本本质质上上为为质质粒粒载载体体，由由于于可可克克隆隆较较大大DNADNA片片段段，具具有有部部分分类类似似YACYAC载体的特征，因此将其称为人工染色体载体载体的特征，因此将其称为人工染色体载体返回第五章返回第五章谢谢谢谢返回第五章返回第五章