噬菌体载体和柯斯载体.ppt

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1、第五章第五章 噬菌体载体和噬菌体载体和柯斯载体柯斯载体本章主要内容本章主要内容n n噬菌体一般特性噬菌体一般特性n n噬菌体噬菌体n n柯斯质粒柯斯质粒n nM13噬菌体噬菌体1、M13噬菌体特性及基因组结构噬菌体特性及基因组结构2、M13噬菌体载体类型及特点噬菌体载体类型及特点噬菌粒噬菌粒比较比较比较比较第一节第一节 噬菌体的一般生物学特性噬菌体的一般生物学特性（BacteriophageBacteriophage，phagephage）噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体可可可可以以以以在在在在脱脱脱脱离离离离寄寄寄寄主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的状状状状态态态态下下下下保保保保持持持持生生生生命命

2、命命，但但但但一一一一旦旦旦旦脱脱脱脱离离离离了了了了寄寄寄寄主主主主细细细细胞胞胞胞，就不能生长和复制就不能生长和复制就不能生长和复制就不能生长和复制 利利利利用用用用寄寄寄寄主主主主的的的的核核核核糖糖糖糖体体体体、蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质合合合合成成成成因因因因子子子子、氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸和和和和产产产产能能能能体体体体系系系系，进进进进行行行行生生生生长长长长和和和和繁繁繁繁殖殖殖殖n n可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。n n除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：除了对

3、寄主的依赖性，还具备其它的功能：除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：1、保保保保护护护护自自自自己己己己的的的的核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸分分分分子子子子（DNADNA、RNARNA）免免免免遭遭遭遭环境化学物质的破坏；环境化学物质的破坏；环境化学物质的破坏；环境化学物质的破坏；2 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞；3 3、将将将将被被被被感感感感染染染染的的的的细细细细菌菌菌菌细细细细胞胞胞胞转转转转变变变变成成成成制制制制造造

4、造造噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的体体体体系系系系，从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；从而生长出大量的子代噬菌体颗粒；4 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒一、一、噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型 结构：结构：无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二

5、十面体型、线状体型线状体型线状体型线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性DNADNA、双链环形双链环形双链环形双链环形DNADNA、单链环形单链环形单链环形单链环形DNADNA、单链线形单链线形单链线形单链线形DNADNA、单链单链单链单链RNARNA。n n 不不同同的的噬噬菌菌体体之之间间的的核核酸酸分分子子量量的的差差异异也也是是比比较较大大的的。大大分分子子量量的的噬噬菌菌体体生生命命周周期期比比较较复杂；对寄主的依赖性较低复杂；对寄主的依赖性较低n n有有 些些 噬噬 菌菌 体体 的的 DNA碱碱 基

6、基 不不 是是 由由 标标 准准 的的A/T/C/G组成的。组成的。Example：T4 4噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体DNADNA没没没没有有有有C C碱碱碱碱基基基基，取取取取代代代代的的的的是是是是5-5-羟羟羟羟甲甲甲甲基基基基胞胞胞胞嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶（HMCHMC）；SP01SP01噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体DNADNA中中中中没没没没有有有有T T碱碱碱碱基基基基，取代的是取代的是取代的是取代的是5-5-羟甲基尿嘧啶（羟甲基尿嘧啶（羟甲基尿嘧啶（羟甲基尿嘧啶（HMUHMU）。）。）。）。二、噬菌体的感染性二、噬菌体的感染性噬菌斑形成噬菌斑形成噬菌斑形成噬菌斑形成噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体感

7、染高浓度细菌感染高浓度细菌感染高浓度细菌感染高浓度细菌在未发生第一次裂解在未发生第一次裂解在未发生第一次裂解在未发生第一次裂解前涂布平板前涂布平板前涂布平板前涂布平板 噬菌体的感染过程尾部粘至细胞壁尾部粘至细胞壁尾部粘至细胞壁尾部粘至细胞壁尾部蛋白质收缩尾部蛋白质收缩尾部蛋白质收缩尾部蛋白质收缩核酸注入细菌核酸注入细菌核酸注入细菌核酸注入细菌利用细菌的利用细菌的利用细菌的利用细菌的RNARNA聚合聚合聚合聚合酶和核糖体翻译得到酶和核糖体翻译得到酶和核糖体翻译得到酶和核糖体翻译得到噬菌体蛋白噬菌体蛋白噬菌体蛋白噬菌体蛋白使细菌的使细菌的使细菌的使细菌的DNADNA降解降解降解降解合成自身的合成自

8、身的合成自身的合成自身的DNADNA至至至至数百个拷贝数百个拷贝数百个拷贝数百个拷贝合成头部尾部蛋白合成头部尾部蛋白合成头部尾部蛋白合成头部尾部蛋白进行组装进行组装进行组装进行组装三、噬菌体的溶菌生命周期三、噬菌体的溶菌生命周期n n噬菌体的生命周期分为噬菌体的生命周期分为噬菌体的生命周期分为噬菌体的生命周期分为溶菌周期溶菌周期溶菌周期溶菌周期和和和和溶源周期溶源周期溶源周期溶源周期n n只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。n n烈性噬菌体溶菌生长的基本过

9、程：烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1 1、吸附、吸附、吸附、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2 2、注入、注入、注入、注入 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA穿过细胞壁注入寄主细胞穿过细胞壁注入寄主细胞穿过细胞壁注入寄主细胞穿过细胞壁注入寄主细胞3 3、转变、转变、转变、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场

10、所4 4、合成、合成、合成、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5 5、组装、组装、组装、组装 包装了包装了包装了包装了DNADNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒头部和尾部组装成噬菌体的颗粒头部和尾部组装成噬菌体的颗粒头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6 6、释放、释放、释放、释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来四、噬菌体的溶源生命周期四、噬菌体的溶源生命周期n n溶溶源源生生长长周周期期：是是指指在

11、在感感染染过过程程中中没没有有产产生生出出子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，噬噬菌菌体体的的DNA是是整整 合合到到寄寄主主细细胞胞染染色色体体DNA上上，成成为为它它的的一一个组成部分。个组成部分。n n现现知知道道只只有有双双链链DNA的的噬噬菌菌体体才才具具有有溶溶源源周期周期1、概念、概念n n温温和和噬噬菌菌体体：既既能能进进入入溶溶菌菌生生命命周周期期又又能能进进入溶源生命周期。入溶源生命周期。n n溶溶源源性性细细菌菌：具具有有一一种种完完整整的的噬噬菌菌体体基基因因组组的细菌的细菌n n溶溶源源化化：用用温温和和噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌培培养养物物使使之之形成溶源性细菌的过程形

12、成溶源性细菌的过程n n整整合合：噬噬菌菌体体的的DNA是是被被包包容容在在寄寄主主细细胞胞染色体染色体DNA中中n n原原噬噬菌菌体体：在在溶溶源源细细菌菌内内存存在在的的整整合合的的或或非整合的噬菌体非整合的噬菌体n n超超感感染染免免疫疫性性：溶溶源源性性细细菌菌不不能能够够被被头头一一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。2、溶源周期的主要特征、溶源周期的主要特征n n 噬菌体和噬菌体和噬菌体和噬菌体和P1P1噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体n n 噬菌体的特征：噬菌体的特征：噬菌体的特征：噬菌体的特征：(1)(1)噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的DNAD

13、NA分子注入细菌细胞分子注入细菌细胞分子注入细菌细胞分子注入细菌细胞(2)(2)经经经经过过过过短短短短暂暂暂暂的的的的转转转转录录录录之之之之后后后后，需需需需要要要要合合合合成成成成一一一一种种种种整整整整合合合合酶酶酶酶，于于于于是转录活性便被一种阻遏物所关闭是转录活性便被一种阻遏物所关闭是转录活性便被一种阻遏物所关闭是转录活性便被一种阻遏物所关闭(3)(3)噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的DNADNA分分分分子子子子插插插插入入入入到到到到细细细细菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体基基基基因因因因组组组组DNADNA上，变成原噬菌体上，变成原噬菌体上，变成原噬菌体上，变成原噬菌体(4)(

14、4)细细细细菌菌菌菌继继继继续续续续生生生生长长长长、增增增增值值值值，噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的基基基基因因因因作作作作为为为为细细细细菌菌菌菌染染染染色体的一部分进行复制。色体的一部分进行复制。色体的一部分进行复制。色体的一部分进行复制。n n 噬菌体噬菌体P1基本特征：基本特征：不不存存在在噬噬菌菌体体DNA分分子子的的整整合合作作用用体体系系，而而是是变变成成了了一一种种进进行行独独立立复复制制的的环环形形的的质质粒粒DNA分子。分子。3、超感染免疫性、超感染免疫性（1）溶源细菌的两个重要特点：）溶源细菌的两个重要特点：n n不不能能被被头头一一次次感感染染的的噬噬菌菌体体再再次

15、次感感染染，称称为为超感染免疫性超感染免疫性；n n经经过过许许多多世世代代以以后后，溶溶源源性性细细菌菌可可以以进进入入溶溶菌周期，称为菌周期，称为溶源性诱发溶源性诱发。超敏感免疫性超敏感免疫性n n阻阻遏遏操操纵纵体体系系：c基基因因编编码码阻阻遏遏蛋蛋白白，启启动子动子PL和和PR，操纵基因，操纵基因OL和和OROLPLcPROR阻阻遏遏蛋蛋白白同同操操纵纵基基因因结结合合使使RNA聚聚合合酶酶不不能能起起始始转转录录，这这种种状状态态有有充充分分的的能能力力使使原原噬噬菌菌体体保保持持“关闭关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。形式，溶源细菌能够正常生长。溶源噬菌体的诱发溶源噬菌体的诱发n

16、 n依依赖赖于于阻阻遏遏基基因因与与操操纵纵基基因因的的相相互互作作用用。阻阻遏遏物物被被一一种种蛋蛋白白酶酶切切割割，失失活活，使使噬噬菌菌体转录。体转录。n n需需要要删删除除酶酶将将噬噬菌菌体体的的DNA从从大大肠肠杆杆菌菌染染色色体体上上删删除除下下来来，使使之之形形成成环环形形的的DNA分分子，恢复溶源周期开始时的状态。子，恢复溶源周期开始时的状态。整合酶必须首先与整合酶必须首先与宿主编码宿主编码的的宿主整合因子宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)结合形成结合形成复合体，才能催化复合体，才能催化attP和和attB在在O区进行重组而形成原噬菌体。区进行重

17、组而形成原噬菌体。Hif五、重组噬菌体的分离大肠杆菌培养至对数生长期大肠杆菌培养至对数生长期加入加入噬菌体悬浮液，噬菌体悬浮液，37培养培养1小时小时用新鲜培养稀释，继续培养用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时小时高速离心，沉淀噬菌体高速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放-DNA乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀DNA。backback1、噬菌体特性及基因组结构噬菌体特性及基因组结构2、噬菌体载体类型及特点噬菌体载体类型及特点第二节第二节 噬菌体噬菌体载体载体backback噬噬 菌菌 体体 分分 子子 量量31106dal，中中等等大大小小的的温温和和噬噬菌菌体体，目目前前已已经经定

18、定位位61个个基基因因，其其中中一一半半参参与与了了生生命命周周期期，为为必必要要基基因因；余下的为非必要基因。余下的为非必要基因。溶菌阶段溶菌阶段 (复制和释放复制和释放)溶源阶段溶源阶段 (整合寄主染色体整合寄主染色体)phagephage一、一、噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述1、基因组结构、基因组结构（1）cos位点位点线线性性双双链链DNA分分子子两两端端各各有有一一条条12nt组组成成的的彼此完全互补的彼此完全互补的5突出单链突出单链注注入入宿宿主主后后，粘粘性性末末端端互互补补形形成成双双链链区区，成成为为cos位点位点。coscos位点的两个作用：位点的两个作用：位

19、点的两个作用：位点的两个作用：n n使使使使进进进进入入入入细细细细菌菌菌菌的的的的DNADNA分分分分子子子子成成成成为为为为环环环环状状状状 ，这这这这是是是是插插插插入入入入细细细细菌菌菌菌基基基基因因因因组组组组的先决条件。的先决条件。的先决条件。的先决条件。n n作作作作为为为为识识识识别别别别位位位位点点点点，由由由由内内内内切切切切酶酶酶酶将将将将滚滚滚滚环环环环复复复复制制制制的多联体的多联体的多联体的多联体DNADNA切开切开切开切开5-CGGGGCGGCGACCTCG-35-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-53-GCCCCGCCGC

20、TGGAGC-5 Cleavage Cleavage LigationLigation(during packaging)(after(during packaging)(after infection)infection)GGGCGGGCGACCTCG-3 GGGCGGGCGACCTCG-35-CG +GC-55-CG +GC-53-GCCCCGCCGCTGGA3-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form 左侧区左侧区AJ中间区中间区JN右侧区右侧区N右侧右侧（2）基因组）基因组COSCOSA W B C A W B

21、C D ED E F Z U V G H M L K I J b2 F Z U V G H M L K I J b2 cIcI crocro cIIcII O P Q S R O P Q S R attatt intint xisxis gamgam red red cIIIcIII N N COSCOS 头部基因头部基因头部基因头部基因 尾部基因尾部基因尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区功能不明区功能不明区 溶源化溶源化溶源化溶源化 重组重组重组重组 早期控制早期控制早期控制早期控制 阻遏阻遏阻遏阻遏 DNADNA合成合成合成合成 溶菌溶菌溶菌溶菌生长非必要区段生长非必要区段生长非必要区

22、段生长非必要区段cIcI基因：溶源过程控制基因基因：溶源过程控制基因基因：溶源过程控制基因基因：溶源过程控制基因噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构n n感感感感染染染染早早早早期期期期：从从从从单单单单一一一一复复复复制制制制起起起起点点点点开开开开始始始始双双双双向向向向 型型型型复复复复制制制制，由由由由OO基因和基因和基因和基因和P P基因产物激活；基因产物激活；基因产物激活；基因产物激活；n n随随随随后后后后开开开开始始始始滚滚滚滚环环环环复复复复制制制制，产产产产生生生生的的的的线线线线性性性性DNADNA为为为为基基基基因因因因组组组组首首首首尾串连的多联体尾串连的多联体尾串连

23、的多联体尾串连的多联体DNADNA分子分子分子分子DNA复制复制O基因和基因和P基因基因早期蛋白表达早期蛋白表达型复制型复制cos早期蛋白不表达，晚期蛋白表达早期蛋白不表达，晚期蛋白表达 溶源化控制基因溶源化控制基因att int xisn nXis：控制一种蛋白质删除酶的合成：控制一种蛋白质删除酶的合成n nint：控制整合酶的合成：控制整合酶的合成n natt：提供整合酶的识别位点：提供整合酶的识别位点 控制基因控制基因 cIII、N、cI、cro、cII 溶菌基因溶菌基因S、RDNAProtein coatcoscosNonessential regionLong(left)armsho

24、rt(right)armExogenous DNA(20-23 kb)phagephage12bp1、插入式载体、插入式载体n n一一一一种种种种只只只只具具具具有有有有一一一一个个个个可可可可供供供供外外外外源源源源DNADNA插插插插入入入入的的的的克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点的的的的 派派派派生生生生载载载载体体体体。只只只只能能能能插插插插入入入入较较较较小小小小分分分分子子子子量量量量的的的的外外外外源源源源（10kb10kb），），），），广泛用于广泛用于广泛用于广泛用于cDNAcDNA及小片段及小片段及小片段及小片段DNADNA的克隆的克隆的克隆的克隆2、替换型载体（取代型载

25、体）、替换型载体（取代型载体）n n具具具具有有有有成成成成对对对对的的的的克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点，在在在在这这这这两两两两个个个个位位位位点点点点之之之之间间间间的的的的 DNADNA区区区区段段段段可可可可以以以以被被被被外外外外源源源源插插插插入入入入的的的的DNADNA片片片片段段段段所所所所取取取取代代代代。可可可可以以以以克克克克隆隆隆隆较较较较大大大大分分分分子子子子量量量量的的的的外外外外源源源源，克克克克隆隆隆隆高高高高等等等等真真真真核核核核生生生生物物物物DNADNA二、二、噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型（一）插入式载体（一）插入式载体 噬噬噬噬菌菌菌

26、菌体体体体载载载载体体体体相相相相对对对对于于于于质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体来来来来说说说说，克克克克隆隆隆隆片片片片段段段段较较较较大大大大，所以一般用于所以一般用于所以一般用于所以一般用于cDNAcDNA文库或基因组文库的构建文库或基因组文库的构建文库或基因组文库的构建文库或基因组文库的构建。1 1、cIcI基因插入失活基因插入失活基因插入失活基因插入失活如如如如gt10gt10、NM1149NM1149等等等等载载载载体体体体，在在在在cIcI基基基基因因因因上上上上有有有有EcoREcoR I I及及及及Hind Hind IIIIII的的的的酶酶酶酶切切切切位位位位点点点点。外

27、外外外源源源源基基基基因因因因插插插插入入入入后后后后将将将将导导导导致致致致cIcI基基基基因因因因的的的的失失失失活活活活。cIcI基基基基因因因因失失失失活活活活后后后后将将将将导导导导致致致致噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体不不不不能能能能溶溶溶溶源源源源化化化化，产产产产生生生生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gtgt 10 10 gt 10 Lac Z基基因因插插入入失失活活：如如charon16A，gtgt 1111载载体体

28、，在在非非必必需需区区段段引引入入lac Z基基因因，在在lac Z基基因因上上有有EcoR位位点点，插插入入失失活活后后利利用用X-gal法法筛筛选（兰白筛选）。选（兰白筛选）。lac ZLA 19.9RA21.9EcoR Icharon16A（二）（二）（二）（二）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）外源外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段感染和复制非必要的片段(20 kb)高感染效率高感染效率(109 转化株转化株/ug 载体载体 DNA，比质，比质粒高粒高100-倍倍)替

29、换型噬菌体替换型噬菌体是使用最广泛的载体。是使用最广泛的载体。eg:EMBL3,DASH Charon 4A载体载体 CharonCharon 4A4A载载载载体体体体是是是是用用用用Lac Lac 5 5（乳乳乳乳糖糖糖糖操操操操纵纵纵纵子子子子的的的的大大大大部部部部分分分分系系系系列列列列，包包包包括括括括完完完完整整整整的的的的Lac Lac Z Z）替替替替换换换换入入入入噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的中中中中间间间间区区区区段段段段，同同同同时将时将时将时将Lac 5Lac 5作为选择标记作为选择标记作为选择标记作为选择标记使使使使用用用用时时时时用用用用EcoRIEcoRI水水

30、水水解解解解，去去去去掉掉掉掉中中中中间间间间的的的的片片片片段段段段，再再再再与与与与欲欲欲欲克克克克隆隆隆隆片片片片段段段段在在在在体体体体外外外外进进进进行行行行重重重重组组组组、包包包包装装装装。而而而而后后后后，感感感感染染染染E.coliE.coli使使使使之之之之在在在在E.coliE.coli内繁殖，并裂解内繁殖，并裂解内繁殖，并裂解内繁殖，并裂解E.coliE.coli，形成空斑形成空斑形成空斑形成空斑Lac 5 EcoR ICharon 4A EMBLEMBL3/43/4、Charon40Charon40 CharonCharon 4040的的的的中中中中间间间间可可可可取

31、取取取代代代代区区区区段段段段是是是是一一一一种种种种DNADNA短短短短片片片片段段段段多多多多次次次次重重重重复复复复而而而而成成成成，称称称称为为为为多多多多节节节节段段段段区区区区，两两两两个个个个短短短短片片片片段段段段之之之之间间间间可可可可被被被被NaeNae识识识识别别别别，因因因因此此此此用用用用它它它它做做做做载载载载体体体体可可可可以以以以有有有有效效效效的的的的将将将将其其其其中中中中的的的的多多多多节节节节段段段段区区区区清清清清除除除除，从从从从而而而而得得得得到到到到的的的的多多多多是是是是重重重重组组组组的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体。克隆能力达到克隆能力达到

32、克隆能力达到克隆能力达到9 922kb22kb短片段短片段重复替换区重复替换区 MCS MCS Charon 40LA19.2RA9.6n n在在NM781替替换换型型载载体体中中，可可取取代代的的EcoR片片段段，编编码码有有一一个个supE基基因因（大大肠肠杆杆菌菌突突变变体体tRNA基基因因），这这种种NM781噬噬菌菌体体感感染染细细胞胞后后，寄寄主主细细胞胞lacZ基基因因的的琥琥珀珀突突变变被被抑抑制制，因因此此能能在在X-gal琼琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。n n如如果果这这个个具具有有supE基基因因的的EcoR片片段段被被外外源源DNA取取代代

33、了了，那那么么所所形形成成的的重重组组体体噬噬菌菌体体，在在上上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。NM781替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNA的步骤的步骤1、应应用用适适当当的的核核酸酸内内切切酶酶消消化化载载体体，除除去去可可取代的取代的DNA片段；片段；2、将将上上述述所所得得的的 DNA载载体体臂臂同同外外源源DNA片片段的连接；段的连接；3、对对重重组组体体的的DNA分分子子进进行行包包装装和和增增殖殖，以以得到有感染性的得到有感染性的重组噬菌体重组噬菌体 取代载体取代载体取代载体取代载体2、组装、组装1.连接连接3、侵染、侵染（三）凯

34、伦噬菌体载体（三）凯伦噬菌体载体 在在噬噬菌菌体体基基础础上上发发展展起起来来的的，既既有有插插入入型型又又有有替替换换型型；在在基基因因工工程程实实验验中中的的用用途途十十分分广泛广泛 承受外源承受外源DNA的能力：几个的能力：几个kb到到23kb（左右臂（左右臂（左右臂（左右臂连连接）接）接）接）（三段自身（三段自身（三段自身（三段自身连连接）接）接）接）（插入片段）（插入片段）（插入片段）（插入片段）三、三、噬菌体载体的改良噬菌体载体的改良改良的目标：改良的目标：n n扩大克隆容量扩大克隆容量n n设计可对重组体分子作正选择的克隆载体设计可对重组体分子作正选择的克隆载体n n构建可以方便

35、的通过转录作用制备外源构建可以方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之插入序列之RNA探针的克隆载体探针的克隆载体n n发展可以使插入的真核发展可以使插入的真核cDNA与与半乳糖苷半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆载体酶形成融合蛋白的克隆载体1、Spi-正选择的正选择的噬菌体载体噬菌体载体n n1059、L47.1n nSpi-重组体的筛选重组体的筛选 n n野野生生型型噬噬菌菌体体不不能能在在携携带带有有P2原原噬噬菌菌体体的的溶溶源源菌菌中中生生长长，的的这这种种表表型型称称为为Spi+(对对P2的的干干扰敏感扰敏感)n n但但是是当当基基因因组组中中缺缺少少参参与与重重组组的的两两个个基基因

36、因red和和gam时时，突突变变体体可可以以在在P2溶溶原原菌菌中中生生长长，其表型称为其表型称为Spi-。n n基基因因red和和gam位位于于非非必必需需区区域域内内，外外源源DNA片片段段能能置置换换基基因因red和和gam形形成成重重组组体体，其重组体不能在其重组体不能在recA-的的P2溶溶源源菌中繁殖菌中繁殖n n可可以以在在recA的的P2溶溶源源菌菌中中繁繁殖殖并并且且显显示示出出Spi-的的表表型型。因因此此只只要要选选用用recA+的的P2溶溶源源菌菌作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。recArecA的的的的P2P2溶源菌溶源菌溶源菌溶源

37、菌n nDNADNA的的的的复复复复制制制制是是是是由由由由 型型型型向向向向滚滚滚滚环环环环型型型型的的的的转转转转变变变变，受受受受到到到到gamgam基因控制基因控制基因控制基因控制n n基基基基因因因因gamgam功功功功能能能能：蛋蛋蛋蛋白白白白产产产产物物物物和和和和寄寄寄寄主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的外外外外切切切切核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶（宿宿宿宿主主主主recBrecB和和和和recCrecC基基基基因因因因产产产产物物物物）结结结结合合合合成成成成复复复复合合合合物物物物，失失失失去去去去对对对对DNADNA的的的的作作作作用用用用活活活活性性性性，因因因因而而而而 噬

38、噬噬噬菌菌菌菌体体体体能能能能够够够够合合合合成成熟的多联体成成熟的多联体成成熟的多联体成成熟的多联体DNADNA，供作包装底物，供作包装底物，供作包装底物，供作包装底物n n基基基基因因因因redred功功功功能能能能：参参参参与与与与裂裂裂裂解解解解性性性性生生生生长长长长早早早早期期期期发发发发生生生生的的的的重重重重组组组组反反反反应应应应，是是是是核核核核酸酸酸酸外外外外切切切切酶酶酶酶，使使使使 型型型型复复复复制制制制中中中中的的的的病病病病毒毒毒毒DNADNA分离形成子代闭环分离形成子代闭环分离形成子代闭环分离形成子代闭环DNADNA分子分子分子分子n nrecA的的P2溶原菌

39、溶原菌n nred-gam-：利利 用用 大大 肠肠 杆杆 菌菌 的的 重重 组组 酶酶（recA），通通过过单单体体DNA间间的的重重组组作作用用，产产生生出出成成熟熟的的多多联联体体DNA以以进进行行包包装装，大大肠肠杆杆菌菌的的重重组组系系统统依依赖赖于于recA基因。基因。n nchi位点的引入位点的引入n n redred和和和和gamgam基基基基因因因因缺缺缺缺失失失失(red(red-和和和和gamgam-)的的的的 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体在在在在P2P2溶溶溶溶源源源源菌菌菌菌或或或或野野野野生生生生型型型型大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中生生生生长长长长较较较较差

40、差差差，形形形形成成成成的的的的噬噬噬噬斑斑斑斑很很很很少少少少，然然然然而而而而当当当当在在在在DNADNA中中中中引引引引人人人人chichi位位位位点点点点后后后后，SpiSpi-噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体在在在在宿宿宿宿主主主主菌中的繁殖力便会随之增强，噬斑变大。菌中的繁殖力便会随之增强，噬斑变大。菌中的繁殖力便会随之增强，噬斑变大。菌中的繁殖力便会随之增强，噬斑变大。n nchichi位位位位点点点点（交交交交换换换换热热热热点点点点激激激激活活活活区区区区）由由由由一一一一段段段段长长长长度度度度为为为为八八八八核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸的的的的DNADNA序序序序列列列列组组组组成成

41、成成，其其其其序序序序列列列列为为为为5 5 GCTGGTCG GCTGGTCG 3 3。野野野野生生生生型型型型DNADNA中中中中并并并并无无无无此此此此序序序序列列列列，但但但但在在在在大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌染染染染色色色色体体体体DNADNA和和和和真真真真核核核核基基基基因因因因组组组组中中中中都都都都存存存存在在在在有有有有chichi序序序序列列列列，大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌DNADNA平均每平均每平均每平均每5000bp5000bp出现一次出现一次出现一次出现一次chichi序列。序列。序列。序列。n nchi位位点点：与与重重组组事事件件有有关关联联的的DN

42、A序序列列，激激活活以以rec为为媒媒介介的的交交换换反反应应，是是recB、C系系统统催催化化重重组组作作用用的的底底物物。但但RecB、C重重组组酶酶的的活活性性可可被被基基因因gam的的产产物物所所抑抑制制。因因此此对对于于red-、gam-突突变变体体或或因因外外源源DNA的的插插入入而而呈呈Spi-表表型型的的重重组组体体而而言言，chi位位点点的的引引人人会会使噬菌体生长繁殖力变强，噬斑增大。使噬菌体生长繁殖力变强，噬斑增大。四、体外包装四、体外包装1、重组体重组体DNA分子的转染作用分子的转染作用 噬噬菌菌体体DNA体体外外重重组组后后，一一般般必必须须经经过过体体外外包包装装，

43、然然后后以以噬噬菌菌体体感感染染（转转导导）的的方方式式将将重重组组DNA导入导入E.coli细胞内。细胞内。因因 为为 以以 感感 染染 方方 式式 导导 入入 细细 胞胞 的的 频频 率率 可可 达达106108/gDNA，而而以以转转染染（translation）的的方方式导入的频率仅为式导入的频率仅为103104/gDNA。n n体体外外包包装装：把把重重组组体体DNA分分子子包包装装成成成成熟熟的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒，从从而而能能够够按按照照正正常常的的噬噬菌菌体体感感染染过过程程导导入入宿宿主主细细胞胞，可可以以提提高高转转染染效率，可达效率，可达107左右。左右。2、重组体DN

44、A的体外包装n n在在A蛋蛋白白（有有终终止止复复制制功功能能），E蛋蛋白白（是是包包装装蛋蛋白白），D蛋蛋白白（是是插插入入蛋蛋白白）共共同同作作用用下下使使重重组组体体DNA转转入入头部。头部。主主 要要 外外壳壳 蛋蛋 白白是是基基因因E的产物的产物基因基因A的产物在的产物在cos位位点切割后进入头部点切割后进入头部包含在外壳中包含在外壳中基因基因D的产物的产物基因基因W和和F的产物组装成的产物组装成完整的尾部完整的尾部n n重重组组体体DNA的的体体外外包包装装：在在体体外外试试管管中中完完成上述反应，利用成上述反应，利用D基因突变和基因突变和E基因突变。基因突变。n nE基基因因琥琥

45、珀珀突突变变（Eam）不不能能形形成成任任何何头头部部，积累大量的尾部积累大量的尾部n nD基基因因琥琥珀珀突突变变（Dam），重重组组体体DNA不不能能进进入入头头部部，成成熟熟作作用用在在头头部部前前体体阶阶段段被被终终止止，因因而而它它感感染染的的宿宿主主中中有有大大量量头头部部前前体体蛋蛋白积累。白积累。n n使使用用具具有有c857突突变变基基因因的的噬噬菌菌体体的的溶溶源源大大肠肠杆杆菌菌：BHB2690（Dam）和和BHB2685（Eam）菌株培养获得头部和尾部）菌株培养获得头部和尾部n nc857是是温温度度敏敏感感性性阻阻遏遏基基因因，32为为溶溶源源状状态态，4445诱诱发

46、发，溶溶菌菌的的S基基因因突突变变，因因而而不会溶菌。不会溶菌。n n大大量量收收集集头头部部尾尾部部蛋蛋白白，在在体体外外与与重重组组DNA包装包装由由于于噬噬菌菌体体包包装装时时，当当DNA的的长长度度短短于于野野生生型型的的75%或或超超过过105%时时，噬噬菌菌体体的的活活性性就就 急急 剧剧 下下 降降。因因 此此 只只 包包 装装 它它 的的 野野 生生 型型DNA（48KB）的的75%105%左左右右的的，要要求求载载体体DNA和和外外源源DNA长长度度上上限限是是51kb，必需基因为，必需基因为28kb，外源极限在外源极限在23kb。3、噬菌体的包装限制噬菌体的包装限制n n计

47、算包装范围（计算包装范围（KB）n n4875%36n n48105%51n n必需基因为必需基因为28n n包装范围包装范围8kb23kbn n分子克隆试验指南分子克隆试验指南 78%105%，包装，包装范围在范围在1023kb噬噬菌菌体体克克隆隆载载体体是是基基因因工工程程中中一一类类很很有有价价值值的克隆载体，具有很多优点：的克隆载体，具有很多优点：其分子遗传学背景十分清楚；其分子遗传学背景十分清楚；载载体体容容量量较较大大，一一般般质质粒粒载载体体只只能能容容纳纳10多多个个kb，而而噬噬菌菌体体载载体体却却能能容容纳纳大大约约23kb的的外源外源DNA片段；片段；n n由由由由于于于

48、于 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体头头头头部部部部组组组组装装装装时时时时容容容容纳纳纳纳 DNA DNA 的的的的量量量量是是是是固固固固定定定定的的的的，因因因因此此此此插插插插入入入入外外外外源源源源 DNA DNA 长长长长度度度度必必必必须须须须控控控控制制制制在在在在使使使使重重重重组组组组 DNA DNA 为为为为野野野野生生生生型型型型 DNA DNA 长长长长度度度度的的的的 75%105%75%105%之之之之间间间间，否否否否则则则则难难难难以以以以正常组装。正常组装。正常组装。正常组装。具具有有较较高高的的感感染染效效率率，其其感感染染宿宿主主细细胞胞的的效效率率几几乎乎可可

49、达达100%，而而质质粒粒DNA的的转转化化率率却只却只0.1%。backback第三节第三节 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（Cosmid vector）n n1978年年，J.collins和和B.Hohn等等人人发发展展出出的的一一种人工载体种人工载体n n 带有带有cos位点的质粒载体位点的质粒载体n n 4-6kb，带带有有选选择择标标记记，在在构构建建cDNA文文库库中很有用。中很有用。n n 可携带大的外源可携带大的外源DNA片段，克隆片段，克隆45kb基因。基因。一、柯斯质粒载体的构建一、柯斯质粒载体的构建 cosmid载载体体：也也称称粘粘粒粒、柯柯斯斯载载体体。这这是是一一类类

50、用用于于克克隆隆大大片片段段DNA的的载载体体，它它是是由由噬噬菌菌体体的的cos（cohesive）末末端端及及质质粒粒（plasmid）重组而成的载体。重组而成的载体。cosmid载载体体带带有有质质粒粒的的复复制制起起点点、克克隆隆位位点、选择性标记点、选择性标记 噬噬菌菌体体用用于于包包装装的的cos末末端端等等，因因此此该该载载体体在在体体外外重重组组后后，可可利利用用噬噬菌菌体体体体外外包包装装的的特特性性进进行行体体外外包包装装，利利用用噬噬菌菌体体感感染染的的方方式式将将重重组组DNA导导入入受受体体细细胞胞。但但它它不不会会产产生生子子代代噬噬菌菌体体，而而是是以以质质粒粒D