乙型肝炎基因治疗的研究进展.pdf

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1、478 中华肝脏病杂志2008年6月第16卷第6期CbJn J Hepatol，June 2008，V0116，No6乙型肝炎基因治疗的研究进展徐东平张玲霞【关键词】 肝炎病毒，乙型；Gene therapy for hepatitis B工缸基因疗法XU Dong-pingZHANG Ling-Key wordsHepatitis B virus； Gene therapyFi璐t authorS address Viral Hepatitis Research Laboratory,302 Hospital of PLABeUmg 10003 9，ChinaEmail：xudongpin9

2、302sinacom基因治疗是指通过基因水平的操纵达到治疗或预防疾病的疗法，分体内疗法和体外疗法。前者是将外源基因直接导人人体发挥作用；后者足在体外将基冈转入载体细胞，通常是患者的自体细胞，然后籽这些细胞输入患者体内发挥作用。基因治疗技术的发展，为慢性乙型肝炎的抗病毒治疗开辟了。一个新的途径，目前已有多项针对乙型病毒性肝炎的临床试验项目获得批准，其中2005年我国批准了用于治疗乙型肝炎的DNA疫苗进入I期临床试验。现将有关进展综述如下。一、基因治疗的临床研究进展概述自1990年美国批准了世界上第一例基因治疗人体实验以来，至2007年9月，已有1300多项人类基冈治疗临床验证项目获得批准，其中I

3、期80l项、I期258项、II期205项，期13项、期32项；批准项目数位于前5位的国家分别是美国(864项)、英国(150项)、德国(74项)，加拿大(54项)和瑞士(42项)。治疗的疾病以癌症为丰(871项)，另外还有心血管疾病(119项)、单基因遗传病(109项)、感染性疾病(85项)、神经疾病(20项)、眼病(12项)等。感染性疾病包括HIVAIDs、破伤风，EB病毒感染，巨细胞病毒感染、腺病毒(adenovirus，ADV)感染、乙脑、流感、丙型肝炎和乙型肝炎。根据目的基因的属性，可分为抗原类(203)、细胞因子类(189)、肿瘤抑制物类(120)、生长因子类(82)、自杀基因类(8

4、2)、缺陷基因类(79)、受体类(51)、标记基冈类(41)、复制抑制物类(37)和其他类(117)“1。我围复旦大学于1991年12月施行了首例血发病B的转基因治疗，2003年我国批准了世界上第一种基因治疗药物p53 ADV注射液，用于治疗头颈部恶性肿瘤。目前，经我国国家食品药品监督管理局批准进行临床试验的基因治疗项目有1 7项【引。二、乙型病毒性肝炎的基因治疗1反义核酸：为人工合成的互补于靶mRNA的dsDNA或RNA片段，可形成mRNA-DNA或mRNA RNA杂交双作者单位：100039北京，解放军第ZO二医院病毒性肝炎研究室 徐东平男，47岁，研究员。Email：xudongpin9

5、302sinacom继续教育园地链，从而抑制或封闭靶基因的表达。为防止体内核酸酶降解，通常对其进行硫代磷酸化和甲基化修饰。针对HBV的反义寡核苷酸在细胞和实验动物体内显示出一定的抗病毒作用。2核酶：是一类分子结构简单、相对分子质量小、具有酶催化活性的RNA分子，其重要作用之一是催化RNA特殊序列的切割、断裂反应。徐东平等【31构建了针对HBV前S基因的3靶位核酶，并证实其在体外能同时有效切割所针对的3个靶序列。Pan等【41设计了一种具有自剪切活性3核酶盒结构(tripleribozyme cassette)，表明通过尾静脉注射脂质体包裹的核酶2周后，HBV转基因小鼠肝脏的病毒DNA降低80以

6、上，11BcAg阳性肝细胞显著减少。Weinberg等【，J采用多靶位自剪切核酶技术，可有效释放出各个核酶单体切割靶序列、降低转染表达HBV基因的Ituh7肝癌细胞系的HBsAg水平。然而核酶在体内环境中相对脆弱，化学修饰虽可增强稳定性却降低了酶活性，而且生理环境的2价阳离子浓度低于核酶发挥最大效能的所需浓度，限制了其体内应用效果。3脱氧核酶：为具有特定结构和酶催化活性的DNA分子，主要催化RNA切割反应，其巾一种1023DNAzyme的脱氧核酶构型切割位点序列简单，为研究常用。Hou等【61设计了一种针对HBV C基因mRNA的脱氧核酶，对靶序列具有很高的亲和力和切割活性j Hou等1还设计

7、了针对HBVX基冈inRNA的脱氧核酶，与带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因的HBV X基因重组质粒一起j乓转染人AD293细胞，结果表明报告基冈的表达量下降了约60，HBxEGFP mRNA表达量下降了80以上。Wo等构建了针对HBV S和C基因mRNA的脱氧核酶，可有效降低2215细胞HBsAg和HBeAg表达量，抑制率达90以上，明显优于针对相同靶序列的反义核酸。然而脱氧核酶的应用还需提高其在体内的稳定性和高效导入靶细胞。4小分子干扰RNA(siRNA)与RNA干扰：通过siRNA进行的RNA干扰是一种由双链R

8、NA引发的序列特异性基因沉默机制，具有特异高效的特点，只引起同源mRNA的降解，数量远远少于mRNA的双链RNA就能完全抑制基因表达，是当前病毒性肝炎基因治疗研究领域的一个热点。已有许多相关研究报道证明siRNA可以有效抑制HBV复制和抗原表达，例如在2215细胞和HBV转基因小鼠模型中19 i01。siRNA针对的靶位包括HBV的X、C、S、P、前C、polyA、DRl、DR2等基冈编码或调控序列的转录RNA，这些siRNA分别通过非病毒载体(如脂质体、半乳糖化脂质体等)、病毒类载体(如ADV、腺相关病毒、逆转录病毒、杆状病毒等)、静脉水动力转染等途径进入细胞或万方数据中华肝脏病杂志2008

9、年6月第16卷第6期Chin J Hepatol，June 2008，V0116，No6体内。目前RNA干扰治疗病毒性肝炎已开始进入I临床研究，美国Nucleonics公司研制的一种抗HBV的RNA干扰疗法已获准进入I期I临床试验1。RNA干扰应用的主要问题是克服病毒变异对siRNA与靶序列特异性结合的影响以及提高转基因的效率和安全陛。5DNA疫苗：DNA疫苗实际上是一种抗原基因重组质粒，接种后使目的基因通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导免疫应答。与传统疫苗相比，DNA疫苗的一个重要优势在于既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫。Zhao等【121应用基因枪将舣质粒DNA疫苗(分别编码HBV

10、前S2S蛋白和人白细胞介素一2)接种恒河猴，观察到可有效诱导特异性T淋巴细胞反应。Payette等n3】将HBV S基因与免疫激动剂CpG基序融合构建的DNA疫苗免疫了2只黑猩猩，使动物在接受HBV感染时很快产生抗一IfBs。Li等1141报告用HBV S基因融合分枝结核杆菌HSP70基因构建的DNA疫苗，可以有效诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和抗体，清除ttBV转基因小鼠的循环HBsAg并抑制病毒复制。Babiuk等】将HBV DNA疫苗用基因枪一次性免疫绵羊诱导产生了持续性抗体反应，时间长达25周，并可产生免疫回忆反应。Zeira等”研建立了一种新的毫微微秒激光脉冲转基因方法，可将

11、目的基因高效转入皮内，一次性接种HBVSDNA疫苗可使小鼠持续产生抗一HBs和细胞免疫反应，时间长达210 d以七，可保护小鼠免受具有复制能力的HBV质粒攻击。在临床研究方面，ManciniBourgine等【17一引总结了HBV-前S2S DNA疫苗治疗慢性乙型肝炎的I期临床试验结果，经过4次肌肉注射治疗(每次1 mg，前3次间隔2个月，最后1次间隔4个月)，10例受试患者均可很好耐受，且均不同程度地诱导出特异性T淋巴细胞反应，其巾5例HBVDNA降低，l例tlBV DNA阴转，2例检出抗一S2抗体并出现抗一HBe血清学转换。2005年我国批准了第一个治疗慢性乙型肝炎的DNA疫苗进行I期临床

12、试验，该疫苗由解放军第45 8医院研制，为双质粒DNA疫苗，2个质粒分别是pcDNAS2一S(表达preS2一S抗原)和pcFP(表达白细胞介素2和干扰素v)，I期临床试验结果表明其安全且有一定抗病毒疗效，目前已获准进行1I期临床试验。DNA疫苗存在的主要J口J题有以下两点：(1)目标蛋白表达水平往往较低，诱导的特异性免疫应答强度不够，需提高抗原表达水平、研发有效安全的佐剂、优化接种途径和方式。(2)HBV病毒变异使抗原表位产生较大差异，病毒蛋白中还可能含有免疫抑制性表位，需要在表位的鉴定、筛选、组合及改造上做进一步研究。6抗原基因修饰的树突状细胞(DC)疫苗：DC是人体内抗原加工提呈能力最强

13、的专职抗原提呈细胞，慢性HBV感染者的DC对HBV抗原刺激的反应性降低与HBV慢性化机制相关。通过用细胞冈子活化和抗原致敏DC，可以激发机体打破免疫耐受状态，被称为治疗性DC疫苗疗法。将HBV抗原基因转导(转染)DC，使病毒抗原在DC内表达并通过内源途径获得加工提呈，能更有效地诱导机体的细胞免疫应答。Qiu等f191用ADV体外介导HBsAg转导小鼠DC，输入小鼠后可诱导HBsAg特异性CTL，抑制表达HBsAg的B16恶性黑色素瘤的移植生长。Yang等【201用ADV体外介导479HBsAg转导人CD34+细胞来源的DC，使目的基因得到稳定表达，将转基因DC与T淋巴细胞共培养可诱导特异性CT

14、L，有效杀伤表达HBSAg的肿瘤细胞。Huang等【211比较了HBsAg基l大l修饰的DC疫苗、HBsAg蛋白致敏的DC疫苗与HBsAg基因重组DNA疫苗的效能，表明前者可最有效地在小鼠体内诱导ThlTcl型细胞免疫反应，活化特异性CTL，并抑制HBV转基因小鼠的病毒复制和HBsAg表达，但诱导抗一IIBs的水平低于DNA疫苗。7抗病毒细胞因子转基因表达：Dumortier等221构建了干扰素Y基因蕈组的带有四环素调控系统和肝脏特异性启动子的ADV，以使目的基因可在肝细胞可调控地定向表达；将重组ADV感染HBV转基因小鼠后，用强力霉素启动使插入基因表达量较未启动前的水平高出1 000倍以上；

15、转基因干扰素Y表达使ttBV转基因小鼠肝细胞内的HBV复制得到显著抑制，但不能消除HBV转录体(transcripts)。Oh等123报告给小鼠肌肉注射经阳离子聚乙烯亚胺聚合物包裹的白细胞介素2质粒可显著增强ttBV S基因重组DNA疫苗的免疫效果，诱导高水平的抗一HBs，延长抗体产生持续时问。8特异性抗体转基因表达：采用转基因方法在肝细胞内表达保护性抗体以发挥抗病毒作用。由于完整抗体分子较大，通常仅将编码决定抗体特异性的可变区基因作为目的基因。陆荫英等幢41将筛选到的抗HBs单链可变区抗体基因经逆转录病毒载体介导转入2215细胞，使HBsAg、HBeAg表达量显著下降，其中细胞上清液中HBs

16、Ag在第14天已转为阴性。Jin等251通过转基因在动物细胞内表达抗HBV X单链可变区抗体，显著抑制了x蛋白介导的细胞转化作用，包括软琼脂集落形成数和裸鼠成瘤能力，但对HBV复制并无显著抑制。9淋巴细胞特异性T淋巴细胞受体(T lymphocytereceptor，TCR)转基因表达：慢性乙型肝炎患者由于免疫耐受缺少清除病毒所需的特异性CTL。CTL的特异性由TCR基冈决定，采用转基因表达TCR可使经CD3抗体活化的CD8+T淋巴细胞转化为特异洼CTI。在抗病毒研究方面，应用这种TCR转基因表达技术，可使CD8+T淋巴细胞转变为HIV和HCV抗原特异性CTL，抑制靶细胞内病毒复制26 2引。

17、目前，国内外一些实验室正在进行HBV特异性CTI。的TCR转基因表达研究。然而清除病毒感染需要多特异性CTL的作用，这是TCR转基因方法用于慢性乙型肝炎治疗所面临的问题。总之，乙型肝炎的基因治疗研究已取得很大进展，但尚需解决提高目的基因表达效率、增强基因治疗靶向性、提高安全性、实现对目的基因转录表达的监测与调控以及解决病毒序列异质性带来的困扰等问题。未来基因治疗有望与抗病毒药物治疗、免疫治疗一起成为乙型肝炎治疗的有效手段。参考文献【1】Edelstein ML，Abedi M喂，Wixon JGene therapy clinical mals world-wide to 2007一all u

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