视网膜母细胞瘤基因治疗的研究进展.pdf

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1、378Ha rtenett ME Pediatric retinawilliams 8Lwilkins，2005：425428中华眼底病杂志2007年9月第23卷第5期 Chin J Ocul Fundus Dis，september 2007，Vol 23，No536 Akabane N， Yamamoto S， Tsukahara I， et a1 sugicaloutcomes in juvenile retinal detachment Jpn J 0phthalmol，2001，45：40941137 Yokoyama T，Kato T，Minamoto A，et a1Charact

2、eristics andsurgicaI outcomes of pediatric retinal detachment Eye，2004，视网膜母细胞瘤基因治疗的研究进展季迅达黄倩18：88989238 cheng sN C，Hwang JF，Yang TcPediatric rh89matog。nousretinal detachment in TaiwanRetina，2006，26：410一414【摘要】近年来视网膜母细胞瘤(RB)的综合治疗越来越受到重视。肿瘤基因治疗虽然在治疗基因的靶向性、可控性及高效表达等诸多方面还有待深入研究，却已显示了其良好的应用前景。随着上述方面的完善，基

3、因治疗将会作为RB治疗的组成部分，发挥重要作用。现就RB基因治疗的研究现状、存在的问题和发展方向作一综述。【关键词】视网膜母细胞瘤治疗；基因，视网膜母细胞瘤；基因表达调控，肿瘤基因，肿瘤抑制；综述文献中图分类号：R7741基因治疗不仅为遗传性疾病、也为恶性肿瘤的治疗开辟了新的篇章。眼球因为其特殊的部位和结构，不仅易于制成肿瘤原位模型，并可凭借多种非侵人性技术进行疗效观察和评估，作为肿瘤基因治疗的靶器官，具有独特的优势。视网膜母细胞瘤(RB)基因治疗研究已有十余年，并取得了可喜的研究成果。现就近几年RB基因治疗研究的现状、存在的问题和将来的发展方向作一综述。1 RB基因治疗的研究现状RB是婴幼儿

4、最常见的眼内恶性肿瘤。随着RB治疗理念的改变，其治疗的发展趋势是尽量避免眼球摘除，而采用保守治疗，如化学减容疗法、放射治疗、激光光凝、经瞳孔温热疗法(TTT)等。但上述各种方法均有其各自不足之处。基因治疗的出现，为RB的治疗开辟了新的途径。11自杀基因治疗自杀基因又称前体药物酶转化基因。将其导入肿瘤细胞后，所编码的产物可将本身对哺乳动物细胞无毒或低毒的前体药物在肿瘤细胞内代谢为细胞毒性药物，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用1。通常这类基因还有旁观者效应，即表达自杀基因的肿瘤细胞的周围未转染基因的肿瘤细胞也会因为毒性药物的扩散而被杀死1。Hayashi等23将单纯疱疹病毒一胸苷激酶自杀基因(HSVTK

5、)导入Y79细胞，建立Y79一TK细胞。他们将10Y79一TK和90未经感染的亲代Y79混合培养，并用前体药物更昔洛韦(GCV)处理5 d后，发现有50的细胞死亡。当两者按1：1混合，给予GCV后，可将90的肿瘤细胞杀死。这种强大的旁观者效应明显提高了基因治疗的抗癌效力。基金项目：国家高技术研究发展计划“973”项目(2004CB518804)作者单位：200080上海交通大学附属第一人民医院中心实验室通讯作者：黄倩：Email：qhuangsjtueducn(收稿日期：2006一0614)(本文编辑：韦纯义)自杀基因已在很多肿瘤的研究中显示了良好的应用前景3“。在RB基因治疗方面的研究主要针

6、对玻璃体腔内种植的RB。有报道小鼠玻璃体腔内RB经瘤内单次注射携带TK基因的重组腺病毒(Ad)一TK联合GcV治疗，1周后70的治疗眼其肿瘤完全消退，且生存期较对照组显著延长5。该研究还发现玻璃体腔内注射Ad，其感染主要局限于肿瘤组织，而眼部其他组织中仅非常少量的光感受器细胞、MnIler细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞被感染，这与视网膜下注射Ad后较多的RPE细胞和部分视网膜神经细胞被感染的情况完全不同6J。最近，ChevezBarrios等7在I期临床试验中，对8例双眼RB患儿的活动性玻璃体腔播撒肿瘤，行玻璃体腔注射AdTK联合GCV治疗，结果显示病毒滴度在1108 yp时，可见注射部位

7、附近的肿瘤播撒灶消退；滴度110”vp时，玻璃体腔肿瘤播撤灶有明显的消退或钙化。这些患者仅出现轻至中度炎症反应，且所有患者的血液、尿液和鼻部分泌物均未发现Ad。可见自杀基因对玻璃体腔播散的RB肿瘤的治疗是比较安全和有效的。玻璃体腔内肿瘤基因治疗的安全性较前房内、视网膜或视网膜下肿瘤可能要高。因为玻璃体腔中网状结构的生物多聚物对肿瘤内注射后渗漏的基因传递载体起部分阻隔作用89，减少了其对眼内正常组织的转染和毒性作用。Kimura等”1将含有不同玻璃体量的逆转录病毒上清液去感染成纤维细胞，实验发现玻璃体显著地降低了病毒的转导效率，并且成剂量依赖关系。当玻璃体浓度为100时，其转导效率仅为无玻璃体组

8、的25。尽管如此，限制自杀基因治疗临床应用的最主要障碍仍然是它对眼内正常组织的毒副作用。除了RB肿瘤治疗外，Malecaze等11还应用AdTK联合GCV系统来预防晶状体超声乳化术后后囊膜混浊。但实验发现AdTK联合GCV组有较明显的角膜内皮细胞毒性反应。尽管该毒副作用可能与很多因素有关，如炎症反应等，但角膜内皮细胞感染AdTK后，其内自杀基因的表达可能会是一个重万方数据生堡眼底病杂志2007年9月第23卷第5期 chin J ocul Fundus Dis，September 2007，Vol 23，No5要的因素。因此，将来自杀基因治疗的一个重要发展方向是靶向性传递自杀基因至靶细胞，或应用

9、可控性调控元件限制自杀基因在靶细胞中表达，如应用端粒酶启动子、缺氧反应元件等调控自杀基因，使其在肿瘤细胞内特异表达，而在正常细胞中不表达，因而在给予前体药物之后，可以对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用，明显减轻副作用。12 RB基因替代疗法RB基因是第一个被确认的抑癌基因，它的发现、分子克隆和鉴定是现代癌症研究的一个里程碑。RB蛋白对细胞周期的调控起关键性作用1“。实验研究显示，用正常的RB基因替代肿瘤细胞中缺陷的RB基因可抑制肿瘤细胞生长，使细胞周期休止于G。一G，期同时还可抑制肿瘤细胞端粒酶活性，从而导致肿瘤细胞的死亡1。有报道应用脂质体将RB基因导人裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤内。外源RB基因的导

10、入可诱导RB细胞凋亡1“。还有研究显示去除了N末端112个氨基酸残基后的pRB94比全长的野生型pRBllo具有更强的抗肿瘤作用1钆16。这可能与前者具有更长的半衰期及有效保持低磷酸化的活性状态有关。Xu等】5在RB基因缺失的膀胱癌裸鼠肿瘤模型内注射AdpRB94和AdpRBllo后发现，AdpRBllo仅减慢肿瘤的生长，而AdpRB94却可以使肿瘤停止生长，且35的肿瘤显示缩小。以上实验结果为RB基因替代疗法治疗RB提供了很好的基础。目前已有较多的研究提示肿瘤细胞端粒酶活性的降低可增加其对放疗的敏感性1”。因此，RB基因替代疗法除了本身具有抗肿瘤作用外，还可以通过抑制肿瘤细胞端粒酶活性，而对

11、放射治疗起增敏作用。但基因替代疗法的一个显著缺点是治疗基因的作用仅限于被转染的细胞，不像自杀基因那样有很强的旁观者效应。所以如何通过改进基因传递载体，提高其对肿瘤细胞的转染效率，是增强其疗效的关键。13溶瘤性单纯疱疹病毒(HSV)基因治疗应用基因工程技术删除HSV基因组中非必需的神经毒性基因了345基因或核糖核苷酸还原酶基因而形成的突变株，可选择性地在快速分裂的肿瘤细胞中复制，导致肿瘤细胞裂解性死亡】8。目前已有多项临床试验利用该病毒的突变株对多种肿瘤进行治疗，并获得一定效果1“。近几年，陆续有动物实验报道它在RB治疗中的疗效2022。研究结果提示RB动物模型的选择与其疗效密切相关，例如HsV

12、突变株对免疫功能正常的LH盯Ag转基因小鼠的白发性RB的疗效有限2 02“。有报道将去除了核糖核苷酸还原酶基因的突变株hrR3和去除了7345基因的突变株RE6注射入该模型小鼠的玻璃体腔后，溶瘤病毒仅局限在肿瘤组织的局灶处，并不能在肿瘤内进行有效的复制和扩散，从而直接影响了其抗肿瘤效果2“21。体外实验也显示它们不能在小鼠RB细胞中复制。Kogishi等221在体外将少量的(MOI为O1)HsV突变株hrR3感染人源性的RB细胞(Y79)，3 d后70的瘤细胞被转导；5 d后，仅13的瘤细胞存活。提示hrR3可在Y79细胞中复制且有溶瘤细胞作用。将hrR3注射到裸鼠皮下Y79移植瘤内后，分别于

13、第2、3、4周观察，见实验组肿瘤体积明显缩小。说明HsV突变株在人来源的RB细胞中能很好的复制，从而发挥其溶瘤细胞的的作用。根据目前已有的实验结果，HSV突变株在眼内应用是比较安全的。Brandt等z列将HSV突变株ICP6缺失的缺失型379HsV突变体注射人小鼠玻璃体腔后，仅发现短暂的(2月内)轻度玻璃体和视网膜炎症，未发现病毒在眼内复制。视网膜组织未能检测到病毒抗原。Liu等24在灵长类短尾猴前房和玻璃体腔注射hrR3后，发现病毒虽可感染眼内部分组织细胞，如小梁网细胞、RPE细胞等，以及引起眼内不同程度的炎症反应等，但却未导致明显的细胞毒性损伤。14抗血管生成基因治疗抗肿瘤血管生成基因治疗

14、是将能够抑制新生血管生成的基因导入肿瘤或其周围组织内，通过抑制新生血管生成基因的表达，使肿瘤组织在较长期内处于相对缺血的微环境中，从而达到治疗肿瘤的目的2“。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一个非常重要的促血管生成因子，在众多血管调控因子中，VEGF是惟一能特异作用于血管内皮细胞的有丝分裂素。可刺激内皮细胞增生，直接或间接参与肿瘤血管生成的诸多环节，并可增加血管的通透性2“。VEGF在RB组织内的高含量已被多项研究证实。Kvanta等”对10个RB眼的肿瘤组织的石蜡切片行VEGF检测，发现其中9个眼的肿瘤组织中有VEGF mRNA的高表达。因此，以VEGF作为治疗靶点来治疗RB，将会有一定的

15、效果。Jia等凹8采用裸鼠皮下RB移植瘤模型，将针对VEGF的小干涉性RNA注射到肿瘤内，隔天治疗一次，发现肿瘤生长明显减慢。半月后治疗组肿瘤组织内的微血管密度显著减少，肿瘤体积也仅为对照组的13以下。但是，从理论上讲，单纯依靠抗新生血管基因治疗还是难以彻底根除肿瘤。因为当肿瘤体积缩小到一定程度时，幸存的肿瘤细胞对血管的依赖性减弱，它们可从组织间液中获取营养；再者，肿瘤血管形成是由众多调控因素参与的复杂过程。针对一、两种调控因素的基因治疗还是很难完全抑制肿瘤的血管形成的。因此，抗肿瘤新生血管基因治疗需要与化学药物治疗、放射治疗及手术等手段联合应用发挥作用。2存在的问题及发展方向21眼内基因治疗

16、安全性有待进一步提高眼内组织结构精密，各组织密切联系又各司其职，缺一不可。因此，最大程度地减少对眼内正常组织的损伤是眼内基因治疗的前提。眼肿瘤内注射是治疗基因传递载体体内导人的最主要途径，注射时如何更为准确地定位于眼肿瘤内，减少注射后基因传递载体的渗漏，及防止穿刺引起的肿瘤转移，仍有待于显微技术的进一步发展。而提高眼内基因治疗安全性的关键还是在于实现治疗基因的精密调控和靶向性传递，以及减轻基因传递载体本身对正常细胞的毒性，包括其诱导的免疫反应等。目前眼内RB基因治疗尚未展开上述方面的研究。22单纯基因治疗向与其它方法联合治疗的方向发展基因治疗在肿瘤动物模型上疗效显著，但其临床疗效并不令人满意。

17、随着RB治疗理念的改进，综合治疗是一发展趋势。所以应该关注如何最大程度地发挥基因治疗作为辅助或协同治疗手段的作用。例如：1、Egr一1基因启动子经电离辐射后，可诱导下游基因表达。因此，该启动子调控治疗基因联合放疗，既能实现治疗基因靶向性表达，又可降低照射剂量，减少对正常组织的损伤。该系统已在另一项其他类型的肿瘤的临床试验中显示了较好的安全性z“。因此，有必要将两者联合对RB的治疗作一尝试性研究。有研究表明热休克蛋白(HSP)启动子调控万方数据380 生竺垦塞堕茎查!生!旦笙!鲞篁!塑里!Q!兰!型!望!：皇!堡竺!竺!塑!：!：型!：!自杀基因表达联合肿瘤局部加热，不仅可以特异性调控自杀基因在

18、肿瘤组织内表达还能增强自杀基因的效力3。该启动子的活性在4145时最强。TTT治疗眼内肿瘤时可使瘤体内温度升至该水平。因此，有理由相信HSP启动子调控治疗基因联合TTT将会有较好的抗RB效果。Anzai等3嵋研究发现。视网膜激光光凝或光动力疗法(PDT)可提高治疗部位Ad的转导效率，延长目的基因的表达时间。因此，基因治疗联合PDT或激光光凝，是否会相互增强各自的抗RB疗效也值得期待。23分子显像在RB基因治疗中的应用分子显像是优化基因治疗的关键之一。利用肿瘤的分子显像，可以推断治疗基因表达的部位、水平和持续时间，可在活体内无创地实时观察肿瘤细胞生长、瘤体形成过程，实现肿瘤细胞侵袭和迁移的可视化

19、，从而更为有效地评价基因治疗的疗效。分子显像在全身肿瘤研究中的应用已有较多报道，但在眼肿瘤中的应用才刚刚起步。最近，Notting等3纠将脉络膜黑色素瘤细胞转染荧光素酶基因后，植入眼内造成脉络膜黑色素瘤原位瘤模型，利用活体生物荧光成像技术实时观察肿瘤的原位生长情况。实验显示肿瘤光信号强度和体积有非常好的相关性(R=O996)，并且该项技术可检测出的最小肿瘤体积仅为05mm3，提示了该项技术在眼肿瘤研究中的良好前景。因此，不难想象分子显像的应用将有助于优化RB的基因治疗。随着分子生物学和肿瘤发病机制的深入研究。基因治疗将向靶向性、精密调控和高效表达方面发展和完善，基因治疗在肿瘤治疗中的地位将会愈

20、加重要。综合治疗将是RB治疗的发展趋势。因此，基因治疗若能协同或增强化学药物治疗、放射治疗、激光光凝、PDT、TTT等的疗效，将会在RB的治疗中起重要作用。3参考文献12345678910Dachs GU，Tupper JTozer GMFrom bench to bedside forgenedirected enzyme prodrug therapy of cancer AnticanceDruzs，2005，16；349359Hayashi N， Ido E， 0htsuki Y， et aI An experimentalappljcation of gene therapy for

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