视网膜母细胞瘤基因治疗研究进展.pdf

《视网膜母细胞瘤基因治疗研究进展.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《视网膜母细胞瘤基因治疗研究进展.pdf（5页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、视网膜母细胞瘤基因治疗研究进展姚娟 综述 李永平 审校综 述I摘要】 视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，传统的治疗方法主要采取眼球或眼眶内容物摘除术、放射疗法及化学疗法，但均不能明显改善预后，而RB的远期影响往往带来局部的破坏性后果。基因疗法为RB的治疗及预后的改善带来了契机，具有传统方法不可比拟的优势。就基因转染载体、基因导入方式、常用的基因技术(如RNA干扰技术)和治疗靶点等方面对RB基因治疗的研究进展进行综述。【关键词】 视网膜母细胞瘤；基因治疗t BNA干扰中图分类号R 7741Current advance in gene therapy of retinoblas

2、tomaYAO Juan，LI Yong-pingState Key Laboratory of Ophthalmology，Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-senUniversity，Guangzhou 510060，ChinaCorresponding author：LI Yong-ping，Email：yongpinglil961yahoocorncn【Abstract】 Retinoblastoma(RB)is the most common infant eye malignant tumorConventional managementmai

3、nly include enucleation of eyeball，evisceration of orbital tissue，radiotherapy and chemotherapy，but the prognosisis not significantly improved，and its long-term effects ale often devastatingRecent years，the development of genetherapy brings a chance for achieving the goal of treatment RB and improvi

4、ng patientsprognosisThe progress ingene therapy for RB，the vector of gene transfer，the methods of gene delivery and the commonly used technologies(RNA interference)to the therapeutic targets were reviewedKey words】 Retinoblastoma；Gene therapy；RNA interference视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，

5、临床表现主要为白瞳症。传统的治疗方法主要采取眼球或眼眶内容物摘除术、放射疗法及化学疗法，但均不能明显改善预后，且RB的远期影响往往是破坏性的损伤。随着医学的发展，对RB的治疗已从挽救患儿的生命转变为改善患儿的生存质量、尽量保留眼球、保存有用视力。基因治疗的发展为RB治疗及改善RB预后带来了契机。1基因治疗RB的优势基因治疗是伴随着DNA重组技术的成熟而发展起来的分子水平的治疗手段，即通过纠正或补偿患者细胞中的缺陷基因，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗目的的一种生物医学技术。基因治疗RB的优势在于：RB是一种遗传性疾病，鼬基因是研究较广DOI：103760emajissn2095-0160

6、201 101024基金项目：国家自然科学基金项目(30672276)作者单位：510060广州，中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室通信作者：李永平，Email：yongpinglil96iyahoocorncn泛的肿瘤抑制基因之一，被认为是控制细胞增生和分化的关键点2|；眼内相对独立于体循环的微环境降低了转基因载体蔓延的可能性，可最大限度地减少全身不良反应；基因导人后眼部发生的形态学变化也易于观察。2常用基因导入方法2I病毒载体基因导入法211 慢病毒载体慢病毒属逆转录病毒之一，包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(humanimmunode6ciency virus，HIV)、猴免疫

7、缺陷病毒及非灵长类慢病毒，如猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒等。慢病毒在宿主细胞内可以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，经环化后通过病毒整合酶的作用整合到宿主细胞的染色体上，并长期表达。以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需要的基因，代之以治疗基因和选择性标记物，构建慢病毒载体。以HIVI为代表的慢病毒载体可感染非分裂细胞及分裂细胞，具有转移基因片段容量较大、目的基因万方数据生堡塞墅竖壁苤查!至!旦箜!鲞箜!塑坐!垦望QP!璺!：!空!Q!：!：垫：塑!：!表达时间较长、不易诱发宿主免疫反应等优点。慢病毒载体在眼科的应用主要为视网膜下腔注射、

8、玻璃体腔内注射、结膜下注射、前房注射等。视网膜疾病主要采用视网膜下腔注射，也有玻璃体腔内注射转染后的细胞，如视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)和Mailer细胞”。1等。212腺病毒载体腺病毒载体具有宿主范围广、较稳定、易纯化、可大量制备、滴度较高、眼内细胞转染效率较高的优点。缺陷是缺乏靶向性，易造成非靶细胞的感染；同时少数病毒基因表达，可引起眼部组织的免疫应答和细胞毒性反应。对传统腺病毒载体进行改造或修饰，可增强其感染或表达的靶向性，使腺病毒载体增加了一些新的特性。ElB缺失腺病毒H101是采用基因重组技术对人5型腺病毒进行基因重组得到的一种溶瘤腺病毒

9、，主要是去除了人5型腺病毒的El B区55 000和E3区19 000的基因片段，具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。Song等o用溶瘤腺病毒H101治疗RB发现，其在体外及荷瘤裸鼠体内均能有效抑制RB细胞生长。运用人类端粒酶逆转录酶(telomerase reversetranscriptase，TERT)启动子取代野生型腺病毒E1A基因自身的启动子，构建出一种依赖端粒酶的条件复制型增生病毒1。条件复制型腺病毒(conditionallyreplicative adenovirus，CRAd)感染部分肿瘤细胞后，能够在肿瘤细胞内特异性复制。裂解肿瘤细胞后，释放病毒颗粒，感染周嗣的

10、肿瘤细胞，以达到使肿瘤逐步萎缩的目的；但对正常细胞的影响较小，具有靶向和安全性，可作为肿瘤治疗的工具一“0|，又称为溶瘤腺病毒。为了进一步提高CRAds的疗效，目前广泛采用的策略是在CRAds中加入治疗基因，以达到病毒和基因治疗的双重目的。Ji等1研究发现，应用溶瘤腺病毒CRAd介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因，以人TERT为启动子转染RB小鼠模型，结果表明能显著降低裸鼠原位移植模型中人RB细胞的生长速度。研究还发现，人TERT启动子驱动的CRAd复制全部发生在肿瘤细胞而不在视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)细胞，因此该载体在RB基因治疗中的应用较安

11、全。213 腺相关病毒 腺相关病毒(adenoassociatedvirus，AAV)载体能特异性地转染光感受器细胞、RPE细胞和RGCs，基因表达时间较长且无毒性，但转染效率较低，外源性基因携带容量小引。Shih等副研究认为，AAV利于转染RB肿瘤细胞，研究人员采用AAV为载体将干扰素13(interferon B，IFNB)转入肿瘤组织，以改善IFNB的毒性和体循环中半衰期短的问题，发挥其抗肿瘤特性；结合RB原位移植瘤模型发现，玻璃体内注射AAV介导的IFNB能持续、有效地转染视网膜组织，并发挥体内的抗肿瘤作用。眼外组织未检测到载体的扩散，全身不良反应小。214单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒(h

12、erpes simplexvirus，HSV)载体外源性基因携带容量大，但不能整合人视网膜细胞基因组，因而不能长期稳定地表达，同时容易引起眼部的免疫反应、炎症和毒性反应，因此使用较少1“。22非病毒载体基因导入法借助物理或化学的力量穿透细胞膜达到基因转移的目的。常用方法有：DNA直接注射法、显微注射法、电穿孔法、DNA微粒子轰击法、磷酸钙沉淀法、葡聚糖法、脂质体融合法和受体介导法。221 电穿孔法 电穿孔法作为一种新型的非病毒基因转染体系，具有操作简单、安全、转染率不受细胞增生影响等优点，已逐步应用于眼内疾病的基因治疗，显示出良好的发展前景。Souied等纠运用经巩膜的离子电渗疗法导入治疗性质

13、粒DNA，运用绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)指示剂显示目的基因表达于实验小鼠视网膜。王晓莉等刨将RB细胞接种于40只裸鼠皮下建立RB移植瘤模型，实验组以电穿孑L法转入编码可溶性血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)受体Flk1胞外段配体结合结构域的真核表达质粒pC I-sFlkl与编码血管生成素l的受体Tie一2胞外段配体结合结构域pCI-ExTek各15肛g于瘤体，每周1次，而对照组给予生理盐水。治疗后3周，测定肿瘤生长曲线，计算抑瘤率；免疫组织化学法标记血管内皮平滑肌肌动蛋白以观察肿瘤的

14、微血管密度。结果发现实验组可明显抑制肿瘤的生长，抑瘤率为8004；200倍视野下微血管密度为(2669295)个，明显低于对照组的(445l611)个。认为通过电穿孔法转移sFlk一1和ExTek可抑制血管生成，从而抑制RB的生长。222其他非病毒载体导入法 纳米载体以其转染效率高、安全、低毒、无免疫原性的特点受到越来越多的关注o，还有新一代的非病毒载体壳聚糖等。3 基因治疗RB的常用技术一RNA干扰技术RNA干扰现象的发现为基因治疗研究提供了一种新的方法。RNA干扰技术可以针对特异性基因改变其在组织细胞内的表达量，通过阻断基因的表达来万方数据94 生堡塞墅堕型苤查!至!旦蔓；!鲞箜!塑竺!也

15、!垦婴QP!巴!：!翌!：!：!塑!：!研究基因的功能81。RNA干扰作用具有高效性，使外源基因在转录水平上失活的同时诱导内源性基因沉默，使靶基因表达降到很低，甚至完全不表达。RNA干扰还具有高度的特异性，靶基因的一个碱基突变也会导致干扰失败。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)是2种序列特异性转录后基因表达的调节因子，是RNA干扰技术最主要的组成部分。31 siRNAsiRNA是人工体外合成的双链RNA，通过转染进人体内，siRNA技术通过在转录水平调控基因的表达来实现对疾病的治疗。与靶基因保守区域互补的siRNA

16、与基因的转录产物相结合，通过降解靶基因的转录产物可达到下调基因表达的目的。在对RB的基因治疗研究中，聂莉等引运用siRNA技术敲除人RB细胞株SORb50中的survivin基因后，发现干扰组细胞的增生受抑制；流式细胞仪检测出现明显的凋亡峰，发现细胞积聚在G。G。期，G：M期和s期细胞明显减少，同时荧光显微镜下观察到典型的细胞凋亡形态。目前，siRNA技术已广泛应用于RB基因治疗的研究领域，干扰靶点包括与细胞增生、转移、血管生成及耐药性相关的基因，随着干扰靶点的增加其应用将更加广泛。32 miRNAmiRNA是内源性的单链RNA，广泛参与细胞的增生、分化、凋亡、信号转导、器官形成、脂肪代谢、造

17、血、胚胎发育、病毒复制、肿瘤发生发展等多种生物学进程的调控。Yan等【2州研究表明，哺乳动物的视网膜发育过程有多种miRNA参与其中。Decembrini等旧认为视网膜发育时间及细胞增生速率受一系列miRNA的相互作用决定。基于这些研究，尝试预测影响视网膜发育过程中影响mRNA表达的miRNA及确认这些miRNAs对于理解视网膜的发育过程和功能十分重要，因为miRNA失调可能导致视网膜的变性和其他疾病；而对他们的表达进行调控有可能作为今后治疗的工具心引。Zhao等川在RB肿瘤细胞中发现了一组大量表达的miRNA，包括miRNA-494、let-7家族、miRNA一5131、has-miRNA-

18、5132等。尽管这些miRNA在RB形成病理过程中的作用尚未明确，但检测视网膜细胞中这些miRNA的表达量，为早期诊断RB提供了新的方向，而部分参与调节R6基因突变的miRNA可能成为新的基因治疗靶点。肿瘤的发生发展是多种基因突变累积以及相互作用形成基因网络调控的结果。RNA干扰可以针对信号通路的多个基因或者基因簇的共同序列来同时抑制多个基因的表达，使这些基因保持在静息或休眠状态，对于研究肿瘤的发生机制及应用于肿瘤的基因治疗也具有显著优势。目前越来越多与肿瘤发生发展密切相关的高特异性靶基因以及能使外源性治疗基因高效表达的载体已被发现，以RNA干扰技术为核心的基因疗法将成为RB治疗的一种有效手段

19、。作为一个相对免疫豁免的组织，在眼部应用RNA干扰治疗可以有效地沉默眼部基因，从而避免对身体其他部位同种基因的效应，使得眼局部组织的基因敲除高效而安全。4基因治疗RB的靶点41抑癌基因尺6及其转录调控因子在RB形成过程中，抑癌基因R6基因起着重要的作用，舶基因经2次突变而失活，是公认的RB发生的重要分子机制1。Rb蛋白是一种抑癌蛋白，参与细胞周期调控，是硒基因的表达产物。近年来对于RB的遗传学研究发现，RB中缺乏Rb蛋白的表达旧“；在RB缺陷的肿瘤细胞中重建舶基因功能可诱导细胞的生长停滞或衰老及端粒酶活性抑制，从而纠正体细胞癌变。此外，舶基因疗法的优势在于选择性地杀死肿瘤细胞，且对正常体细胞无

20、不良反应，其治疗效果已在体外和免疫小鼠模型中被证实。目前已有临床前期研究报道，舶基因治疗可抑制肿瘤细胞的生长。RB由于尺6基因缺失或失活，核转录调控因子E2F1始终处于活化状态，导致细胞不断增生旧“。此外，在R6基因正常的肿瘤细胞中E2F1的活性也明显增加。王丰等忙驯根据人E2F1基因设计了3段短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，构建RNA干扰表达载体pSilencershE2Fl，瞬时转染人RB细胞株HXORb-44和人肝癌细胞株SMMC7721，检测其对细胞周期的影响，并将转染shE2F1的肿瘤细胞注射到裸鼠眼前房内，连续观察眼内肿瘤细胞的生长情况并拍照记录，体

21、外和体内实验均证实有效抑制人E2F1表达的shRNA可在体内外抑制人RB生长。42肿瘤血管形成RB的发展、转归和肿瘤新生血管的形成密切相关。RB的瘤组织内不仅有丰富的新生血管，且VEGF的表达也增强。因此，以VEGF作为RB治疗的靶点成为研究热点】。Wang等01利用RNA干扰技术抑制RB细胞VEGF基因的表达，发现VEGFsiRNA在体外能明显抑制RB的增生。Jia等旧刈利用人源性RB细胞株SORb50和HXORb44，也观察到VEGFsiRNA对VEGF的抑制效果显著，将SORb50接种到BALBc万方数据生堡塞墅堕登苤查垫!生!旦复丝鲞箜!塑曼!虫垦翌Q21尘!里!：!翌!壁!L!：!：

22、堕!：!裸鼠皮下建立肿瘤模型，通过瘤体内注射抗VEGF的siRNA，隔日注射1次，结果发现局部应用的siRNA同样可显著抑制肿瘤内VEGF的表达，肿瘤生长明娩减慢。治疗15 d时。VEGFsiRNA组较对照组肿瘤体积减小了66。43 RB瘤细胞的分化RB的另一个特点是具有较高的自发退变率，退变率达18一32132。RB的自发退变表现为RB眼球痨和视网膜细胞瘤2种形式。研究发现，RB自发退变患者细胞毒性T淋巴细胞的活性及血清免疫复合物水平增高，表明机体的免疫因素与肿瘤细胞的坏死密切相关。因此RB治疗的研究方向可从诱导分化和免疫治疗人手，如可将控制生长分化的GWll2基因等导入RB瘤细胞内，用基因

23、疗法进行瘤细胞的分化治疗。44细胞凋亡的信号通路形态学观察发现在RB退化区，凋亡细胞多见。因此，蒋宏苏等”引提出细胞凋亡是导致RB自发退行性变的可能机制。细胞凋亡过程受到错综复杂的凋亡信号通路及凋亡相关基因的精细调控，包括B细胞淋巴瘤白血病基因-2(B cell lymphomaleukemia gene，Bcl-2)、Bcl-2相关X基因(Bcl-2 associated x gene，Bax)、Fas及其配体(FasFasL)、肿瘤坏死因子凋亡相关诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand。TRAIL)、p53、

24、原癌基因cmyc、天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)家族等。FasL及TRAIL均属于肿瘤坏死因子一a家族，可以通过各自的受体触发易感细胞凋亡。FasL与其受体Fas的交联作用使TRAIL通过其死亡受体4、5(Death Receptor4，5；DR4，DR5)来活化caspase一8，导致caspase8蛋白水解激活及聚集，启动下游凋亡级联效应。Poulaki等41研究RB细胞株Y79发现，RB细胞表面表达Fas、DR4、DR5，但在caspase8表达缺失的情况下可抵抗DR介导的细胞凋亡；在恢复caspase8的表达后，DR介导的细胞凋亡恢复其敏感性。因此，可通过基因沉默

25、caspase8来诱导肿瘤细胞的凋亡。Dasgupta等p刊研究发现，凋亡信号调节激酶1(apoptosis signalregulating kinase l，ASKI)发挥作用需与Rb结合，Rb蛋白的过表达抑制ASKI诱导的细胞凋亡，此外ASKl的突变体因不能结合Rb蛋白而不能诱导凋亡，因此ASKl必须克服Rb的抗凋亡特性才能发挥效应，认为Rb蛋白具有抗增生和抗凋亡的双重功能。推测Rb作为细胞凋亡和增生之间的联系桥梁可能是通过与不同激酶间的相互作用及占有不同的启动子来实现的。这些研究均为了解基因及其网络样的相互联系在RB发生发展、转归中的作用及后续研究提供了线索。45 巨大型RB儿童巨大型

26、RB目前常采用眼球摘除术治疗，而较小的肿瘤通常采用冷冻或激光手术，从而可保留眼球。假如基因疗法可以使肿瘤体积缩小，那么局部治疗便能够进行。Hurwitz等”刮研究发现，在RB细胞株Y79Rb的体外试验中运用更昔洛韦处理后再体外转导腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因AdV-TK瘤细胞可被杀灭，进一步在免疫缺陷小鼠玻璃体腔内注射RB细胞株Y79Rb建立转移性RB小鼠模型，当这些小鼠体内转染Ad弘豫基因并进行更加昔洛韦球内注射治疗，70的小鼠显示出肉眼可见的瘤体完全消融。与未经处理的对照组相比，治疗组的生存率明显延长，基因疗法可有效地减少小鼠模型的肿瘤负荷。在儿童非转移性巨大型RB中，基因治疗结合

27、局部手术切除，可有效替代眼球摘除术、全身放射治疗和化学治疗。46溶瘤腺病毒结合自杀基因疗法运用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(hexessimplex virus thymidine kinase，HSV-tk)基因导入肿瘤细胞中表达，联合应用更昔洛韦的自杀基因疗法结合人TERT启动子驱动的CRAd也为治疗RB提供了一个新方法。5小结人类基因组计划为破解疾病的致病基因打开了一扇大门，基因治疗为治疗RB及其他疾病提供了新的方法。然而，基因治疗距离真正的临床应用还有一定的距离。随着对疾病发生发展机制的深入研究，对基因及载体的特性、细胞生物学以及体内的免疫反应有更多了解，设计出有效的载体及基因转导策略

28、，制定动物模型以测试这些载体，发展先进方法监测患者情况，进行更加严谨的临床前研究和临床研究，基因治疗将成为更安全、更有效的治疗手段，逐渐缩小与临床应用的距离。参考文献：1】Stellmach V，Grawford SE，Zhou W，et a1Prevention of ischemiainduced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigmentepithelium derived factorJProe Natl Acad Sci USA，2001，98：259325972xu HJRetinoblastoma

29、and tumorsuppressor gene therapyJOphthalmol Clin North Am，2003，16：6216293Parker DG。Brereton HM，Coster DJ，et a1The potential of viral vectormediated gene transfer to prolong corneal allograft survivalJCurrGene Therap。2009。9：33一“万方数据96 堡塞堕堕登盘查丝!生!旦整垫鲞箜!塑曼!兰三P QP!堡尘：!型垫!：!：!：塑!：!4Wei LLGene delivery fo

30、r the treatment of ocular diseasesRUSACrenVec Inc，20025Greenberg KP，GeUer SF，Schaffer DV，et a1Targeted tranageneexpression in Mfiller glia of normal and diseased retinas using lentiviralvectorsJInvest Ophthalmol Via Sci，2007，48：1844一18526Acland GM，Aguirre GD，Ray J，et a1Gene therapy restores vision i

31、n acanine model of childhood blindnessJNat Genet200I。28：92957Song x，Zhou Y，Jia R。et a1Inhibition of retinoblastoma in vitro and inrive with conditionally replicating oncolytie adenovirus H101JInvestOphthalmol Vis Sci，2010，51：2626-26358】Pang XJPurification and application of adenoviral vectors in tum

32、orgene therapyJJ Med Postgraduat，2009。22：1324-13279Kirn D，Martuza RL，Zwiebel JReplicationselective virotherapy forcancer；biological principles，risk management and future directionjNat Med，2001，7：78l一78710Huang Q，Zhang X。Wang H，et a1A novel conditionally replicativeadenovirus vector targeting telomer

33、ase-positive tumor cellsJClinCancer Res200410：143914451 1Ji X，Zhang J，Cheng L，et a1Oncolytic adenovirus delivering herpessimplex virus thymidine kinase suicide gene reduces the growth ofhuman retinoblastoma in an in vivo mouse modelJExp Eye Res，200989：19319912Tsai ML，Chen SL，Chou PI，et a1Inducible a

34、denoassociated virusvector delivered transgene expression in corneal endotheliumJInvestOphthalmol Via Sci，2002，43：751-75813Shih CS，Laurie N，Holzmacher J。et a1AAVmediated local delivery ofinterferon-beta for the treatment of retinoblastoma in preelinieal modelsJNeuromol Med，2009，11：435214Liu X，Bran&C

35、R，Gabeh BT，et a1Herpes simplex virus mediatedgenetransfer to primate ocular tissues【JExp Eye Res，1999，69：38539515Souied EH，Reid SNPiri NI，et a1Non-invasive gene transfer byiontophoresis for therapy of an inherited retinal degenerationJExpEye Res，2008，87：16817516王晓莉，王丰，吴继红，等电穿孔介导质粒DNA导人视网膜母细胞瘤抑制肿瘤生长的

36、实验研究J中华眼科杂志，2005，41：90090417Tamaki YNovel approach for management of age related maculardegeneration antiangiogenic therapy and retinal regenerative therapyJNippon Ganka Gakkai Zasshi，2007，111：232-26818Imamur T，Yokosnk O，Omat M，et a1Proteomic analysis of the TGFbsignaling pathway in pancreatic carci

37、noma cells using stable RNAinterference to silence Smad 4 expressionJBiochem Biophys ResCommun，2004，318：289-29619聂莉，李永平，聂栋，等小干扰RNA技术下调视网膜母细胞瘤细胞株SORb50中Survivin基因表达的研究J中华眼科杂志，2008。44：90691120】Yan N，Ma K，Ma J，et a1Profiling mieroRNAs differentially expressedin rabbit retinaJAdv Exp Med Biol，2010，664：2

38、0320921Decembrini S，Bressan D，Vignali R，et a1MicroRNAs couple cell fateand developmental timing in retinaJProc Nail Acad Sci USA，2009，106：211792118422Arera A，GudurieFuehs J，Harwood L，et a1Prediction of microRNAsaffecting mRNA expression during retinal developmentJBMC DevBiol，201010：I23Zhao JJ。Yang J

39、。Lin J，et a1Identification of microRNAs associatedwith tumorigenes is of retinoblastoma by miRNA microarray analysisJChilds Nervous System，2009。25：1320f24Kandson AG JrMutation and cancer：statistical study of retinoblastomaJPrec Natl Acad Sci USA，197l，68：82082325Kather A，Ferrara A。Nonn Met a1Identifi

40、cation of a naturallyprocessed HLAA 0201 HPV 18E7 T cell epitope by tumor cellmediated in vitrovaecination【JIntern J Cancer，2003，10：345-35326xu HJRetinoblastoma and tumor-suppressor gene therapyJOphthalmol Clin North Am，2003。16：62162927Stanelle J。Stiewe T，Theseling CC，et a1Gene expression changes in

41、response to E2FI aetivationJNucleic Acids Res，2002，30：1859一186728王丰，马家烈，李惠明，等靶向E2FI的shRNA抑制眼内视网膜母细胞瘤生长J乍物化学与生物物理进展，2009，36：58759129Liu WH，Li YZ，Wu VQVascular endothelial growth factor and intraocularnevaswlarixationJIntern J Ophthalmol，20077：1681一168430Wang Q，Liu SExperimental study of retinoblastom

42、a gene therapy usingRNA interference to inhibit VEGF gene expression【JChin J OptomOphthalmol，2007，9：39139431Jia RB，Fan XQ，Wang XL，et a1Inhibition of VEGF expression byplasmid based RNA interference in the retinoblastoma cellsJChin JOphthalmol。200743：49349832李永平，冯官光，易玉珍。国内视网膜母细胞瘤的研究现状及展望J中华眼科杂志，2004，

43、40：21721933蒋宏苏，惠延年，王雨堆，等人视网膜母细胞瘤的细胞凋亡J眼科研究2000，18：512-51434Poulaki V。Mitsiades CS。McMullan C，et a1Human retinoblastoma cellsare resistant to apoptosis induced by death receptors：role of caspase-8gene silencingJInvest Ophthalmol Via Sci，2005，46：358-36635Dasgupta P，Betts V，Rastogi S，et a1Direct bindin

44、g of apoptosis signalregulating kinase 1 to retinoblastoma protein：novel links betweenapoptotic signaling and cell cycle machineryJJ Biol Chem，2004，279：387623876936Hurwitz MY，Marcus KT，ChrvezBarrios P。et a1Suicide gene therapyfor treatment of retinoblastoma in a murine modelJHuman GeneTherap，1999，10

45、：441448(收稿日期：2010-08一II惨回日期：2010一Il-23)(本文编辑：王莉红)镖考碑右编考本刊对免疫组织化学检测技术方法学描述的要求免疫组织化学染色是免疫学与病理学相结合的检测技术，是生物医学的一项重要方法学和实用性很强的研究工具，操作方法简单、敏感性高、特异性强，主要用于研究和观察细胞中某些结构或分子物质及组织细胞间的成分。该技术的应用非常广泛，但目前部分作者的来稿中对该技术的描述不够严谨甚至出现逻辑性错误。为了保证研究论文的学术质量，本刊要求凡是涉及免疫组织化学染色技术的论文在研究方法部分应交代以下相关内容：(1)组织标本来源及取材。(2)标本的固定及处理过程。(3)切片的制作和厚度。(4)载玻片的处理过程。(5)所用的抗原修复方法。(6)一抗的种属来源、抗体名称、工作浓度以及孵育条件。(7)二抗的种属来源、抗体名称、携带的标记及孵育条件。(8)所用的显色剂及方法。(9)对照组的设置。(10)染色结果的评价标准。包括抗原阳性结果在细胞中的定位、阳性染色的颜色等。(11)提供相应的图片。(本刊编辑部)万方数据