菌落总数测定.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流菌落总数测定.精品文档.菌落总数的测定基础知识：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每g（mL）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类

2、，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。菌落总数测定的卫生学意义： 食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。细菌在平板计数琼脂上的菌落特征 蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：GB 4789

3、.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定1、范围本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2、术语和定义菌落总数 aerobic plate count食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。3、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：361。3.2 冰箱：25。3.3 恒温水浴箱：461。3.4 天平：感量为0.1g。3.5 无菌袋。3.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度

4、）、10mL（具0.1mL刻度）。3.7 无菌培养皿：直径90mm。3.8 放大镜或/和菌落计数器。4、培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基按照称取23.5g培养基溶于1000mL蒸馏水的比例进行配置，分装到锥形瓶，121高压灭菌15min。4.2 0.85%无菌生理盐水称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水。一般用1000mL锥形瓶配置，称取6.8g的氯化钠，加入800mL蒸馏水，121高压灭菌15min。5、检验程序菌落总数的检验程序见下图。6、操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置无菌袋内，加入225mL灭菌生理盐水，拧紧振摇无菌袋使其混合均匀，制成

5、110的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成110的样品匀液。6.1.3用1mL无菌吸管吸取110样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管使其混合均匀，制成1100的样品匀液。6.1.4 按6.1.3操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每

6、个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。6.3 菌落计数6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming u

7、nits，CFU）表示。6.3.2 选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7、结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数

8、在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按照以下公式计算：N=C/（n1+0.1n2）d式中：N：样品中菌落数；C：平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1：第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2：第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d：稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1100（第一稀释度）11000（第二稀释度）菌落数（CFU）232，24433，35N=C/（n1+0.1n2）d=（232+244+33+35）/2+（0.1*2）*10-2=544/0

9、.022=24727上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5*1047.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数。7.1.4若所有稀释度的平板上菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2

10、菌落总数的报告7.2.1菌落数小于100CFU以内时，按四舍五入原则修约，以整数报告。7.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。7.2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。注意事项：1、所有操作必须在酒精灯周围进行，按照无菌取样的要求进行。2、每个样品从开始稀释到倾注最后一个平板的时间不得超过15min，目的是为了防止

11、细菌增殖及产生片状菌落，时间长了样液可能由于干燥而贴在平板上，倾注培养基后不易摇开，容易产生片状菌落，影响计数。3、检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。4、培养基倾注的温度一般35-45左右，温度过高容易杀死细菌，太低琼脂已开始凝固容易造成细菌生长不均匀，影响计数。5、厚度：直径9cm的平皿一般要求1520mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长。6、培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。7、检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌发生混淆，可以作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4冰箱放置，以便在计数时用作对照。另外也可以在已熔化而保温在46水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）水溶液，TTC作为菌落指示剂，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。