菌落总数测定.pdf

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1、-菌落总数的测定菌落总数的测定根底知识：根底知识：菌落是指细菌细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计一样的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数是指在一定条件下如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等每gmL检测样品所生长出来的细菌的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。菌落总数测定

2、是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。菌落总数测定的卫生学意义：菌落总数测定的卫生学意义：食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。细菌在平板计数琼脂上的菌落特征蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：方法来源：GB 4789.2-2016

3、食品平安国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定1 1、范围、范围本标准规定了食品中菌落总数Aerobic plate count的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2 2、术语和定义、术语和定义菌落总数菌落总数 aerobicplatecountaerobicplatecount食品检样经过处理，在一定条件下如培养基、培养温度和培养时间等培养后，所得每g gmLmL检样中形成的微生物菌落总数。3 3、设备和材料、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：361。3.2 冰箱：25。.z.-3.3 恒温水浴箱：461。3.4 天平：感量为 0

4、.1g。3.5无菌袋无菌袋。3.6 无菌吸管：1mL具 0.01mL 刻度、10mL具 0.1mL 刻度。3.7 无菌培养皿：直径 90mm。3.8 放大镜或/和菌落计数器。4 4、培养基和试剂、培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基按照称取 23.5g 培养基溶于 1000mL 蒸馏水的比例进展配置，分装到锥形瓶，121高压灭菌 15min。4.20.85%0.85%无菌生理盐水无菌生理盐水称取 8.5g 氯化钠溶于 1000mL 蒸馏水。一般用 1000mL 锥形瓶配置，称取 6.8g 的氯化钠，参加 800mL 蒸馏水，121高压灭菌 15min。5 5、检验程序、检验程序菌落总数的检验

5、程序见下列图。6 6、操作步骤、操作步骤6.16.1 样品的稀释样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取 25g 样品置无菌袋内，参加 225mL 灭菌生理盐水，拧紧振摇无菌袋使其混合均匀，制成 110 的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取 25mL 样品置盛有 225mL 生理盐水的无菌锥形瓶瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠中，充分混匀，制成 110 的样品匀液。6.1.3 用 1mL 无菌吸管吸取 110 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9mL 生理盐水的无菌试管中 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面，振摇试管使其混合均匀，制成 1100 的样品匀液。6.1.4 按 6.1.3 操作

6、，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1mL 无菌吸管。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液液体样品可包括原液，在进展 10 倍递增稀释时，吸取 1mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1mL 空白稀释液参加两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6 及时将 15mL20mL 冷却至 46的平板计数琼脂培养基可放置于 461恒温水浴箱中保温倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.26.2 培养培养6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361 培养 48h2h。.z.-6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基

7、外表弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂外表覆盖一薄层琼脂培养基约 4mL，凝固后翻转平板，按 6.2.1 条件进展培养。6.36.3 菌落计数菌落计数6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位colony-formingunits，CFU表示。6.3.2 选取菌落数在 30CFU300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平

8、板作为该稀释度的菌落数；假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 7、结果与报告、结果与报告7.17.1 菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法7.1.1 假设只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 gmL样品中菌落总数结果。7.1.2 假设有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按照以下公式计算：N=C/n1+0.1n2d式中：N：样品中菌落数；C：平板含适宜范围菌落

9、数的平板菌落数之和；n1：第一稀释度低稀释倍数平板个数；n2：第二稀释度高稀释倍数平板个数；d：稀释因子第一稀释度。例如：稀释度菌落数CFU1100第一稀释度232，24411000第二稀释度33，35N=C/n1+0.1n2d=232+244+33+35/2+0.1*2*10-2=544/0.022=24727上述数据按 7.2.2 数字修约后，表示为 25000 或 2.5*1047.1.3 假设所有稀释度的平板上菌落数均大于 300CFU，则对稀释度最高的平板进展计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数。7.1.4 假设所有稀释度的平板上菌落数均小于 30CFU，

10、则应按稀释度最低的平均菌落数乘.z.-以稀释倍数计算。7.1.5 假设所有稀释度包括液体样品原液平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 假设所有稀释度的平板菌落数均不在 30-300CFU 之间，其中一局部小于 30CFU 或大于 300CFU，则以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.27.2 菌落总数的报告菌落总数的报告7.2.1 菌落数小于 100CFU 以内时，按四舍五入原则修约，以整数整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于 100CFU 时，第 3 位数字采用四舍五入原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用

11、10 的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3 假设所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4 假设空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。7.2.5 称重取样以 CFU/gCFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mLCFU/mL 为单位报告。考前须知：1、所有操作必须在酒精灯周围进展，按照无菌取样的要求进展。2、每个样品从开场稀释到倾注最后一个平板的时间不得超过 15min，目的是为了防止细菌增殖及产生片状菌落，时间长了样液可能由于枯燥而贴在平板上，倾注培养基后不易摇开，容易产生片状菌落，影响计数。3、检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，

12、然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。4、培养基倾注的温度一般 35-45左右，温度过高容易杀死细菌，太低琼脂已开场凝固容易造成细菌生长不均匀，影响计数。5、厚度：直径9cm 的平皿一般要求 1520mL 培养基，假设培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长。6、培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂外表枯燥，尽量防止菌落蔓延生长，影响计数。7、检样稀释液有时带有食品颗粒，为防止与细菌发生混淆，可以作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于 4冰箱放置，以便在计数时用作对照。另外也可以在已熔化而保温在 46水浴内的平板计数琼脂中，按 100ml 加 1ml0.5%氯化三苯基四氮唑TTC水溶液，TTC 作为菌落指示剂，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。.z.