温州医学院 临床免疫学检验系列 (23).ppt

《温州医学院 临床免疫学检验系列 (23).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《温州医学院 临床免疫学检验系列 (23).ppt（59页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第十八章免疫自动化仪器分析及应用,温州医科大学检验医学院张文辉,免疫检验自动化（automationofimmunoassays)是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。,自动化分析技术,自动化免疫比浊分析技术荧光免疫自动分析技术化学发光自动免疫分析酶联免疫分析技术,第一节自动化免疫浊度分析系统,一、免疫透射比浊法,1959年Schultze,1967年Ritchie,1977年sternberg,1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。,（二）仪器工作过程,2.将待测标本和标准抗原溶液（5个

2、浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。,3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。,（三）方法评价,优点:灵敏度较单扩高，重复性好，操作简便，结果准确,不足:抗体用量较大；溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。,用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2m），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著

3、变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。,二、免疫胶乳比浊法,（一）原理：,（二）方法评价,本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的RF可与IgGFc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。,三、免疫散射比浊法,(一)原理,II042（dn/dc)2Mc(1+cos)N24,I：与入射光成角处散射光强度；：入射光的波长；I0：入射光的强度；dn/dc：校正因子，

4、反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M：颗粒分子量；c：浓度；N：阿佛加德指数；：颗粒到检测器的距离；：散射光与入射光的夹角（散射夹角）。,45,Debye散射,定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。,(二)定时散射比浊法（fixedtimenephelometry）,定时散射比浊法测定原理示意图,5ul样本,7.

5、5秒,(1)抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定,45ul样本,(1)抗原抗体预反应阶段(2)反应阶段(3)信号检测,2分钟,6分钟（2+4分钟）,预反应阶段,反应阶段,BNProSpec全自动特定蛋白分析仪,速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅12min即可完成。,(三)速率散射比浊法（ratenephelometry）,抗原浓度递增,散射光峰值,峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图,A,B,C,D,

6、F,G,H,I,仪器测定技术要点,开启机器，进行定标反应阶段抗原过量检测,反应时间（秒）,0,60,85,散射率,抗体过量,抗原过量,第二峰值信号,抗原过量检测,第一次峰值信号,加标准抗原,(三)方法评价,散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。,1.抗原抗体比例2.抗体的质量3.增浊剂的使用,（一）免疫比浊分析的影响因素,四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用,4.伪浊度5.入射光光源和波长6.结果报告中的计量单位7.标准曲线制备与质量控制,临床应用,免疫

7、比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。,第二节自动化学发光免疫分析系统,自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。,一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪,抗原抗体结合洗涤

8、、分离加入氧化剂发光信号检测,ACS：180SE和ACSCENTAUR化学发光免疫分析仪,ACS：180SE,ACSCENTAUR,ci8200,i2000sr,酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。,二、酶联发光免疫分析仪,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪,VitrosECi全自动增强化学发光酶免分析仪,强生公司,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分

9、析仪,Access全自动酶标记化学发光免疫分析仪,UniCelDxI800,IMMULITE2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统,（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪,AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪,日本东曹的AIA-1800型全自动酶标记荧光免疫分析仪,三、电化学发光免疫分析仪,电化学发光免疫测定工作示意图,ELECSYS2010型全自动电化学发光免疫分析仪,ModularAnalyticsE模块170型,可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。,四、在临床免疫检测中的

10、应用,第三节自动化荧光免疫分析系统,荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。,一、时间分辨荧光免疫分析仪,（二）仪器测定技术要点,抗原抗体结合加入Eu3+螯合抗体加入酸性增强液4.信号检测,autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统,.美国EG&GWallac公司,1.TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防

11、尘。2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异，应选择应用。,（四）注意事项,二、荧光偏振免疫分析仪,偏振光和偏振荧光发生示意图,荧光偏振免疫测定工作原理示意图,1.抗原抗体反应2.偏振荧光强度测定,（二）仪器测定技术要点,1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等因素。2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成分。,（三）注意事项,第四节自动化酶联免疫分析系统,根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通常将全自动

12、酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。,条形码识别系统样本架和加样系统试剂架温育系统液路系统洗板系统酶标板读数仪自动装载传递系统计算机管理和信息系统,（一）仪器组成和性能,回溯到90年代初期。全自动酶免分析系统基本特征是单/双针加样系统与酶标板处理系统一体化，多数孵育位置少于4块板。加标本将占用较长时间（单针每板需15分钟，三块板通常需45分钟完

13、成加标本工作）。,全自动酶免分析系统的发展,目前，市场上出现的酶免工作站主要有：酶免样本处理系统酶免后处理系统全自动酶免一体机酶免连体机。,全自动酶免分析系统的发展,（二）仪器评价,第五节免疫自动化仪器分析选择与应用,一、免疫自动化仪器分析选择原则实验室空间和气候条件免疫自动化仪器检测项目的性能指标实验室项目检测速度要求和设备配置实验室检测项目的经济效益因素二、免疫自动化仪器分析应用,1.什么是免疫检验自动化？应用哪些技术？优点是什么？2.免疫浊度分析的原理是什么？有哪些临床应用？3.免疫胶乳比浊法和免疫散射比浊法的原理是什么？4.定时散射比浊法和速率散射比浊法的测定原理，其抗原过量检测有什么不同点？5.免疫比浊分析的影响因素有哪些？6.吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪技术要点是什么？7.酶联发光免疫分析仪的原理，有哪几种类型？各有什么特点？8.电化学发光免疫分析仪测定的技术要点是什么？9.时间分辨荧光免疫分析仪测定的技术要点是什么？注意事项有哪些？10.全自动酶免分析仪的组成成分有哪些？优点是什么？,思考题,