温州医学院 临床免疫学检验系列 (20).ppt

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1、第十五章流式细胞仪分析技术及应用,温州医科大学检验医学院林向阳,内容提要,流式细胞仪的原理数据的显示与分析流式细胞仪免疫分析的技术要点流式细胞术在免疫学检查中的应用,流式细胞分析仪,基本概念,流式细胞仪(FlowCytometer)是集激光技术，计算机技术，细胞荧光化学染色技术，单抗技术等为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry，FCM)一种能快速、精确对单个细胞（生物颗粒）的理化和生物学特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,第一节流式细胞仪的原理,工作原理,液流系统：单细胞流技术流动室鞘液样本流SAMPLE单细胞悬液5

2、*1051*106个/ml光学系统：单细胞照明技术光源:激光(常用氩离子气体激光器488nm)光束成形系统数据处理系统：单细胞检测技术光电倍增管（PMT)A/D转换计算机细胞分选,一、基本结构,液流系统示意图,光学系统示意图,细胞在液柱中与激光束相交时向周围方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关。主要分为前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定,前向散射光（ForwardScatter）,FS的强度与细胞的大小有关FS常被用于设阈以排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰。,侧向散射光（SideScatter）,SS的强度与细胞内部结构的形态学信息，特别是细胞浆中的颗粒

3、性成分有关。,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色。选择不同的单抗及荧光染料就可同时测定一个细胞上的多个不同抗原的特征。,三、荧光的测量,4ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5,荧光补偿,荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(

4、RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PeCy7488755免疫荧光深红,常用荧光染料的特性,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,四、分选基本原理,分选速度分选纯度分选得率,分选的技术要求,参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术,第二节数据的显示与分析,FS：反映细胞的大小SS：反映细胞的内部结构复杂程度FL：反映细胞被染上的荧光数量多少,一、参数,单参数直方图,二、数据的显示方式,单参数直方图,双参数散点图,双参数散点图,等高线

5、显示图,三参数直方图,假三维等高图,当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,多参数分析,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。在线设门和离线设门,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+,如十字门分析时，就可以由四个区域构成，

6、即G=D1+D2+D3+D4。,Region设置,免疫检测样本制备标记染色免疫胶乳颗粒技术的应用质量控制,第三节流式细胞仪免疫分析的技术要点,外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞或溶血培养细胞的样品制备：蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落洗涤尼龙网过滤新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法、酶处理法、化学试剂处理法、表面活性剂处理法,一、免疫检测样品制备,单细胞悬液的保存：深低温保存法乙醇或甲醇保存法甲醛或多聚甲醛固定法,荧光染色：荧光染料标记的抗体与细胞抗原成分特异结合的过程。方法：间接免疫荧光染色：间接免疫荧光标记方法有信号放大作用，但其非特异干扰信号也较强。直接免疫荧光染色：常用细胞表面标

7、志的染色分析。,二、荧光染色,液相芯片利用免疫胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和FCM检测技术实现对多种可溶性物质的分析。,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,流式微球陈列,单细胞悬液内不能有团块及过多的细胞碎片细胞悬液最适密度为0.5106-1.5106个/ml可选择不同的分离方法。温度25-37，pH7.0-7.2尽快检测。,四、流式细胞免疫学技术的质量控制,（一）单细胞悬液制备的质控,温度：荧光淬灭，20pH：FITC对PH敏感染料浓度固定剂：1-4%的多聚甲醛,（二）免疫荧光染色的质控,光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态。Flow-checkCV:2%-3%PMT（光电倍增管）校

8、准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准:保证计数的准确性。绝对计数校准品,（三）仪器操作的质控,同型对照：即免疫荧光染色中的阴性对照，选用同源性标记相同荧光素的非特异性免疫球蛋白。非特异性荧光染色全程质量控制：样本染色、溶血、洗涤、仪器质控、和上机检测全过程。,（四）免疫检测的质控,全血质控品,流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。,第四节免疫学检验中的应用,T淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+T);Tc(CD3+CD8+T)B

9、淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+),一、淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验：CTL和靶细胞共同体外培养，对靶细胞的杀伤作用死细胞与活细胞比例，PI能渗透到死细胞致核染色细胞内细胞因子测定：对CD3+CD4+T细胞内IFN-和IL-4来区分Th1和Th2,二、淋巴细胞功能分析,1分离细胞2刺激培养3细胞破膜与固定4染色与分析,基本步骤,三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免

10、疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变,MDR(+)表示对化疗药物耐药P糖蛋白（P-gp）：跨膜分子，泵出进入胞内的多种抗癌药物。,四、肿瘤耐药相关蛋白分析,五、AIDS病检测中的应用,CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例,绝对计数值相对计数值表达强度,流式细胞仪检测结果显示,CD4+T细胞,总T细胞,艾滋病人CD4细胞,HLA-B27可出现在58%97%的强直性脊椎炎(As)患者,六、自身免疫病相关HLA抗原分析,流式细胞术的交叉配型（FCXM）群体反应性抗体（PRA）检测,七、移植免疫中的应用,思考题,流式细胞仪的分析检测原理是什么？流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。细胞分选的基本原理。FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？如何进行FCM分析检测样品的制备？流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？流式细胞术有哪些临床应用价值？,