温州医学院 临床免疫学检验系列 (6).ppt

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1、1,第五章凝集反应和沉淀反应,温州医科大学检验医学院吕建祎,2,第一节凝集反应的特点第二节直接凝集反应和间接凝集反应第三节抗球蛋白参与的血凝试验第四节沉淀反应的特点第五节液体内沉淀反应和凝胶内沉淀反应第六节免疫电泳技术第七节凝集反应和沉淀反应的应用,内容提要,3,1896年，肥达试验（Widaltest）1897年，Kraus发现肉眼可见的沉淀反应,免疫测定技术,4,凝集反应是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。,可定性或半定量,第一节凝集反应的特点,Y,5,反应阶段：抗原抗体的特异

2、性结合，快，需数秒或数分钟出现肉眼可见的凝集现象，慢，数分钟或数小时反应特点：IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗体,凝集反应,6,可见反应形成,7,一、直接凝集反应(directagglutination)：颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象,常用的凝集试验有玻片法和试管法,第二节直接凝集反应和间接凝集反应,8,（一）玻片凝集试验,方法评价:定性试验简便和快速敏感度低,临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定,9,在试管内颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。,（二）试管凝集试验,方法评价：半定

3、量试验简便、快速敏感度低可有假阳性,临床应用：肥达试验外-斐试验,10,试管凝集试验,11,试管凝集试验,12,二、间接凝集反应(indirectagglutination):将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面，然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象,13,载体种类：RBC（醛化）聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）,14,(一)正向间接凝集试验(二)反向间接凝集试验(三)间接凝集抑制试验(四)协同凝集试验,间接凝集反应的类型,15,注：用抗原致敏载体-检测抗体,正向间接凝集试验,16,反向间接凝集试验,注：用特异性抗体致敏载体-检测抗原,17,间接凝集抑制试验,用抗原致

4、敏载体-检测抗原,不出现凝集物,18,尿液（HCG？）,抗HCG抗体,HCG致敏乳胶,结果判断,不凝集,凝集,+,阴性,阳性,19,三、间接血凝试验,红细胞作为载体，需要醛化，长期保存且不溶血,20,反向间接血凝试验：抗体致敏载体测定抗原,21,血凝试验强度,注：以+凝集的孔为滴度终点,22,自身红细胞凝集试验,RBC为未经致敏的受检者新鲜红细胞，试剂：抗人O型红细胞的单克隆抗体,临床应用：HIV检测HBV检测,23,四、胶乳凝集试验,致敏于胶乳颗粒,24,25,五、明胶凝集试验,将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉眼可见的粉红

5、色凝集,26,抗球蛋白试验是抗球蛋白参与的间接血凝试验，又称Coombs试验,直接Coombs试验间接Coombs试验,第三节抗球蛋白参与的血凝试验,27,（一）直接Coombs试验,应用：检测新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源性溶血等疾病的RBC上不完全抗体,检测红细胞上不完全抗体,抗球蛋白抗体,全血操作,28,（二）间接Coombs试验,应用：检测母体Rh(D)抗体和因RBC不相容的输血所产生的血型抗体；也可用专一特异性抗球蛋白血清分析与RBC结合的不完全抗体的Ig亚类,检测血清中的游离的不完全抗体,29,沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗

6、体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。,液体内沉淀试验环状沉淀反应絮状沉淀反应免疫浊度分析,第四节沉淀反应的特点,凝胶内沉淀试验免疫扩散试验免疫电泳技术,30,环状沉淀试验絮状沉淀试验免疫浊度测定,单向扩散试验双向扩散试验,对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳交叉免疫电泳自动化免疫电泳,液体内沉淀试验,免疫扩散试验,免疫电泳技术,凝胶内沉淀试验,31,第五节液体内沉淀试验和凝胶内沉淀试验,32,一、液体内沉淀试验,（一）环状沉淀反应（二）絮状沉淀反应,（三）免疫浊度测定,33,可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀

7、线或沉淀环常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶,二、凝胶内沉淀试验,34,原理：先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域中形成可见的沉淀环。沉淀环直径与抗原含量呈正相关,（一）单向免疫扩散试验(平板法),35,倾注平板打孔加样放置372448h观察沉淀环,单向扩散试验（平板法）,36,影响因素：抗体质量标准曲线，质控血清结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分,单向扩散试验上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清,单向扩散试验（平板法）,37,原理：将抗原抗

8、体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。,技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在35mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒371824h后，观察孔周围是否出现沉淀环。,鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一,（二）双向扩散试验（平板法）,38,1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计,2.抗原或抗体相对分子量的估计,双向扩散试验的应用,39,3.分析抗原的性质,A表明抗体与两个抗原中的相同表位结合形成沉淀，但不能说明两个抗原完全相同B两条沉淀线交叉，说明两个抗原完全不同C两条沉淀线相切，提示两个抗原中

9、间有部分相同,A,B,C,40,4.抗体效价的滴定,5.鉴定抗原或抗体纯度,41,第六节免疫电泳技术,42,优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。,电泳分析,沉淀反应,抗原抗体反应的高度特异性,电泳技术的高分辨率、快速、微量,免疫电泳技术,直流电场,43,通电,蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动,抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动,一、对流免疫电泳,44,结果分析：无沉淀线出现则表明无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度抗原，反之，则是抗体浓度抗原浓度。,对流免疫电泳,45,-,+,二、火箭免

10、疫电泳,注：只能测定ug/ml以上的含量,单向免疫扩散电泳,定量检测技术,Ab,Ag,46,原理：区带电泳双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散。,技术要点：制备琼脂板打孔，加样于孔内，电泳23mA/cm，0.51h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散。,三、免疫电泳,47,免疫电泳示意图,M:患者，N:健康地照,应用：待测样品成分的种类和性质分析,48,原理,区带电泳沉淀反应,四、免疫固定电泳,根据血清蛋白质的电荷不同琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分离，然后将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链的抗血清加于凝胶表面的泳道上，

11、固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散沉淀，洗去游离的抗体，染色。可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型,49,左图为IgG型,中图为IgG型，右为正常,免疫固定电泳示意图,50,分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。,应用,最常用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等；临床最常用于M蛋白的鉴定。,优点,免疫固定电泳,51,五、交叉免疫电泳,六、自动化免疫电泳,52,第七节凝集反应和沉淀反应的应用,53,一、凝集反应的临床应用,抗原的检测反向间接凝集试验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。抗体的检测血型鉴

12、定及交叉配血检测各种病原微生物感染后产生的抗体检测自身免疫性疾病的抗体,54,1.经典的沉淀反应可用于抗原抗体性质、效价、纯度及相对分子量和浓度的分析。2.免疫浊度主要用于血液、体液中蛋白质的测定。3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于M蛋白的鉴定与分型。,二、沉淀反应的临床应用,55,总结,凝集反应直接凝集反应和间接凝集反应原理抗球蛋白试验又称为Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。双向免疫扩散试验的原理,56,免疫浊度测定原理为：可溶性抗原与相应抗体特异结合，两者在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应液出现浊度。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定,