茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达-王瑾.pdf

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1、安徽农业大学 硕士学位论文 茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关 酶基因差异表达 姓名：王瑾 申请学位级别：硕士 专业：茶学 指导教师：张正竹 2011-06 I 摘 要 茶树叶片中的单萜烯醇和芳香族醇等挥发性组分主要是以糖苷形式存在，且以樱草 糖苷和葡萄糖苷为主。与这类糖苷的合成与水解相关的酶类主要有 -樱草糖苷酶、 -木 糖苷酶、 -葡萄糖苷酶、 -葡萄糖苷酶和 -葡萄糖基转移酶。糖苷水解释放出的挥 发性苷元，不仅是茶叶香气的物质基础，更参与茶树对病虫害的防御反应。研究茶树叶 片中由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶基因表达差异，将开阔我 们认识 茶树与 环境 关 系 的 新视

2、野 ，为 进一步揭示 茶树 抗 病性 机理提供依据 ， 也 为 改善 茶叶香气 品 质 提供理论 基 础。 咖啡碱作 为茶叶中 嘌呤 类 生 物 碱 的主 体 成分，因 其具 有 重 要的 药理作用而一直被人 们 关 注 。 然而咖啡碱 与茶树 生理抗 性 方面 的研究 却鲜 有 报道 。 现已 有研究表 明 ， 咖啡碱 作 为 一种 有 效 的 抑 菌物质， 能 有 效抑制 茶树 常见致 病菌的 生长 ， 可能 参与茶树 抵抗 病菌 侵染的防御反应。研究真菌侵染 下 茶树叶片中 咖啡碱 合成相关酶基因表达差异，有 利于 探明咖啡碱抑 菌 机理 ， 进一步丰富 茶树 抗 病性 理论 。 本文利

3、用实时荧光定量 PCR（ qRT-PCR）技术 ， 选用 GAPDH为参 照 基因，研究 了 真菌侵染 前后 茶树叶片内源糖苷酶基因和 咖啡碱 合成相关酶基因的表达水 平 差异，以 及 利用高效液 相 色谱法检 测 了 真菌侵染 后 不 同阶段 茶树叶片中 咖啡碱 含 量 的 变化 。主要 结 果如 下 ： 内源糖苷酶的 实时定量 PCR结果 表 明 ， -樱草糖苷酶、 -葡萄糖苷酶、 -葡萄糖 苷酶、 -葡萄糖基转移酶的表达水 平 在 供 试 的 3个 茶树 品种 中 变化趋势 基 本一致 ， 均 有不 同程度 的 诱导上调 。这 些 关 键 酶基因的表达 上调 可能 预 示 着 更 多 糖

4、苷类香气 前体 的 积累 和更 大 量 挥发性苷元的释放， 可能 对 增强 茶树 抗 病性有 一定 的 帮助 。基因的 诱导上 调多 发 生 在染病 初期 ， 也提示 轻度 侵染 可能 刺激 茶叶糖苷类香气 前体 的 积累 和挥发性苷 元的释放。 咖啡碱 合成相关酶的 实时定量 PCR结果 表 明 ， TCS1、 sAMS、 TIDH在 3个 供 试 茶 树 品种 中的表达 趋势 基 本一致 ， TCS1上调幅度显著 ， sAMS上调较 为 明 显 ， TIDH则无 明 显上调变化 。 TCS1基因在 咖啡碱生 物合成 途径 中 负责 后 两 步 甲 基 化 ， 即催化 7-甲 基 黄 嘌呤

5、可可碱 咖啡碱 这 两 步 甲 基 化 反应， sAMS则 是 活化甲硫氨酸 为 腺 苷 甲硫氨酸 ， 为 甲 基 化 反应 提供 甲 基 来 源，这 些 关 键 酶基因的表达水 平 上调 ， 预 示 着 咖啡碱生 物合成 增加 的 可能 性。 咖啡碱液 相 检 测结果 表 明 ， 舒 茶 早 、 多 抗 香 2个 品种 中 咖啡碱 含 量 有相 似起伏变化 ， 均 表 现 为在染病 初期先降低 ，中 期增加 ， 后 期又降低 的 趋势 。 没 有发 现 基因水 平 上 表达 差异与 生 化 水 平 上含 量 变化 的 一致 性，分 析 原因 可能 是， 从 基因表达 到 咖啡碱 相关酶的 活

6、 性 变化 ， 再到 咖啡碱生 物合成， 需 要 一系 列复杂 的 过程 。 咖啡碱 最终含 量 是茶树 代谢 II 过程 中 多 种 因 素综 合 影响 的 结果 。 关键词 ： 茶 ,病原真菌 ,糖苷酶 ,咖啡碱 ,实时荧光定量 PCR,表达差异分 析 III Abstract Glycosides are the main form of the volatiles such as monoterpene alcohols and aromatic alcohols in tea leaves, and most of glycosides are primeverosides and

7、glucosides. Enzymes responsible for biosynthesis and hydrolysis of glycosides mainly include -Primeverosidase, -Xylosidase, -Glucosidase , -Glucosidase and -Glucosyltransferase. The volatile aglycones released from glycosides hydrolysis are not only the material base of tea aroma, but also participa

8、te in the tea plant defense reaction to disease and pests. The analysis of differential gene expression of endogenous glycosidases induced by pathogenic fungi infection in tea leaves can widen our horizon of interactions between tea plant and nature, and support the further study of tea resistance m

9、echanism. It also provides the valuable theory that will be a great help to improvement of tea aromatic quality. As the main constituent of purine alkaloids in tea plant, caffeine attracts close attention because of its pharmacological effects. However, the study of interactions between caffeine and

10、 physiological resistance is really rare. Now it is reported that caffeine, as an effective fungistatic material, can inhibit the growth of common pathogens and play a role in tea plant defense reaction to disease. The analysis of differential gene expression of caffeine biosynthesis enzymes induced

11、 by pathogenic fungi infection in tea leaves can ascertain the caffeine s fungistatic mechanism and develop the resistance theory further. In this paper, differential gene expression of endogenous glycosidases and caffeine biosynthesis enzymes induced by pathogenic fungi infection in tea leaves were

12、 studied, using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) technology with GAPDH used as a reference gene. And changes of tea caffeine content at different stages of fungal infection were detected by high performance liquid chromatography. The main results are as follows. Results of real time

13、 quantitative PCR of endogenous glycosidases showed that the gene expression levels of -Primeverosidase, -Glucosidase , -Glucosidase and -glucosyltransferase had consistent trends in three cultivars and got up-regulation to varying degrees. Up-regulations of these key genes probably mean accumulatio

14、n more glycosidic aroma precursors release a lot more volatile aglycones, and it will be helpful for strengthen disease resistance of tea plant. And up-regulations usually occurred in the early stage of infection indicated that mild infection might stimulate the accumulation of precursors and releas

15、e of aglycones. Results of real time quantitative PCR of caffeine biosynthesis enzymes showed that TCS1, sAMS, TIDH had the consistent trend in three varieties. The up-regulation of TCS1 was significant and sAMS was also obvious, while TIDH had no significant change. TCS1 is IV responsible for last

16、two steps of methylation of caffeine biosynthesis, catalyzing from 7-methylxanthine to theobromine, from theobromine to caffeine. sAMS can activate methionine into adenosylmethionine, and the latter is the sole source of methyl. Up-regulations of these key genes probably mean biosynthesis and accumu

17、lation of more caffeine. Results of HPLC of caffeine showed that the caffeine content of two varieties shuchazao and duokangxiang had similar ups and downs. They appeared to be lower in the early stage, growth in middle stage and then drop again in the later stage. No consistent relations between th

18、e differential expression and the content of caffeine was observed, because it is a complicated process from gene expression to enzymatic activity, and then to caffeine biosynthesis. The final content of caffeine in tea plant is affected by many factors in the metabolic process. Key words: tea, path

19、ogenic fungi, glycosidase, caffeine, real-time fluorescence quantitative PCR, analysis of differential gene expression 1 1 文献综述 近年 来 ，病虫害 诱导 的 植 物 抗 性 越 来 越 成为 人们 关 注 的 焦点 。 植 物在 其生长 发 育 过 程 中， 除 了 经受非 生 物 环境 的 突 然 变 故之外 ， 还会遭受 病原 微 生 物、 植食 性 昆 虫 及其 它 侵 占 性 植 物等 多 种生 物因 素 的侵 袭 。 面 对这 些 生 物 威胁 ， 植 物

20、虽 不 能 像动 物 那般 可 移 动 躲避逆 境 ， 但 也 不 会坐 以 待毙 ， 而 是在病、虫等的 入 侵 诱导 下 形成 了能 够 识 别胁迫信号 并产 生 防御反应的 复杂 体系 1 ，这是 植 物与病原 微 生 物、 植食 性 昆 虫等在 长 期 协 同 进 化 过程 中相 互适 应、相 互 选 择 的 结果 。 逆 境 中 植 物 向周围 环境 释放 某 种 化 学 物质以 影响 邻 近植 物 生长 发 育 的 现 象 ， 早期 被 人们 称 之 为 化 感 作用 ， 植 物 所 释放的 化 学 物质 被 称 为 化 感 物质。 高 等 植 物中的 化 感 物质 一 般 为 植

21、 物 次 生 代谢 物， 大 致 包括酚 类、萜类、糖和糖苷类、 生 物 碱 和 非 蛋白 氨 基 酸 。 现已 证 明 ， 化 感 作用 不仅存在 于 植 物与 植 物 之 间 ， 而 且存在 于 植 物与 微 生 物 之 间 2 。 据 研究， 昆 虫 具 有 识 别 寄 主 植 物的 能 力 ， 而 影响 昆 虫 选 择 寄 主的因 素 有 很 多 ， 如 植 物形 态 特 征 、 植 物 化 学 成分、 各 种环境 因 子 等， 但 起 主要 作用 的是 植 物释放的 化 学 信号 即 次 生 代谢 物。在 正 常 情 况 下 ， 未 受 到 损伤 的 植 物释放出的挥发性 化 合物

22、较 少 ，这 可能 是 一种 生 态策略 ， 可 以 躲避植食 性 昆 虫等的侵害 3 。 一 旦 植 物 遭受植食 性 昆 虫 取食 或 机 械损伤 等，将 会 释放出 大 量 次 生 挥发性物质，这 些 挥发性 次 生 物质有的 能 够 抑制 昆 虫 继续 取食 ， 有的 能 够 引 诱 昆 虫 天敌 定 位 被 侵害的 植 株 4 。 同 时 ， 植食 性 昆 虫等 诱导 植 物 产 生 的挥发 性 次 生 物质，有 可能作 为 植 物 之 间 的 通 讯 信号 ， 使邻 近植 株 产 生 防御反应 3 。 植 物对病原物的 抗 性， 一方面 是 依 靠 植 物 自身某 些结 构屏障 来

23、 实现 ， 如 角 质 层 、 蜡 质 层 、木质 素 和 特 殊 的气 孔 结 构 ，以 及 分 泌某 些 小 分 子 抑制 物， 如 植 保 素 、 毒 性 酚 类等 5 ；另 一方面 是在病原菌 入 侵 诱导 下抗 性基因发挥 作用而 表 现 出 某 些 抗 病反应 6 。 大 量 研究表 明 ， 植 物 抗 性基因在 植 物病害防御 过程起着 非 常重 要的 作用 ， 植 物 体 在 遭受 病原 物 入 侵 时 产 生 的 诱导 防御反应 多 是由 植 物 体 内 特 异 抗 病基因 介 导 完 成 1 。对 植 物内源 抗 病基因的 挖掘 ，有 利于 深 入 研究病原物与 寄 主 植

24、 物 之 间 的 互 作 关 系 ，为更 深刻 揭示 植 物 抗 性 机理提供依据 ，以 此 制定 更为有 效 的 植 物病害防 治措施 。 茶树 作 为 多 年 生 植 物， 生长 过程 也 会遭受 寒 害、 旱 害、病虫害等 多 种 逆 境 ，要 使 茶 树 能 够 抵 御 逆 境而 存 活 ， 加强 栽 培 管 理 措施 以 强化 农业 防 治只 是 辅 助 手 段 ， 最 根 本 的 办 法 还 必须 是 提高 茶树 品种本 身 的 抗 性， 即 利用 自身 的 遗传 因 素来 抵 御 自 然 胁迫 。 杨亚军 等 人 7 指 出， 选 育 抗 病虫 品种 、 利用品种 自身 的 抗

25、性 来 抵 御病虫害的侵 袭 是将 来 茶树 育 种 的 重 要 方 向 。将茶树病害研究 深 入 到 分 子 生 物 学领域 ， 借 助 分 子 生 物 学 技术 ， 挖掘 茶 树内源 抗 性基因，研究 抗 性基因的表达与 抗 性 强 弱 之 间 的关 系 ，是相关研究 工 作 者 的主 要 方 向之 一 8 。 2 1.1 茶树中糖苷类物质研究进展 糖苷 也 称 为 配 糖 体 ，是糖 或 糖的 衍 生 物 通 过 糖的 端 基 碳 原 子 与 另 一 非 糖物质 （常 称 为 配 基 或 苷元 ） 键 合 而 成的 化 合物。糖苷类物质 广泛 分 布 于 植 物的 根 、 茎 、叶、 花

26、 和 果 。 茶树 （ Camellia sinensis）， 山 茶 科 多 年 生常 绿 木 本 植 物。茶树叶片中 含 有 多 种 挥发性物 质，这 些 挥发性物质以不 同 浓 度 比例 组合形成 了 茶叶 各 种 特 殊 的香 型 。 迄今 为 止 ，茶叶 中 已 分 离 鉴 定 的芳香物质 约 有 700种 ， 包括 醇类、 酮 类、 酸 类、 醛 类、 酯 类、内 酯 类、 酚 类、 过 氧 化 物类、 含硫化 合物类等 9 。 据 有关 数 据 指 出， 春季 茶 鲜 叶的挥发 油 中，萜 类物质 占总 挥发 油 的 51.26%， 夏季 占 17.52% 10 ，这 种 以芳

27、樟 醇、香叶醇为 代 表的萜类物 质，对茶叶香气有 着 至 关 重 要的 影响 ，在 一定 程度上 决 定了 茶叶的香气 品 质。 茶树叶片中不仅 含 有 游 离 态 单萜烯醇和芳香族醇，更存在 丰富 的以单萜烯醇和芳香 族醇为苷元的糖苷类物质，我 们 称 之 为 键 合 态 香气 前体 。挥发性 化 合物以 键 合 态 糖 苷的形式存在，这 种现 象 于 蕨 类 植 物、 裸 子 植 物、单 子 叶 植 物、 双 子 叶 植 物中 都 是 广泛 存在的 11 。 1974年 ， 法 国 Cordonnier和 Bayonove首 次 提 出葡萄中 可能 存在 键 合 态 的萜 烯类 化 合物

28、，且 它 们可能 是以糖苷形式存在 10 。 1982年 Williams等研究葡萄中单萜类 前体 化 合物的水解， 证 实了 葡萄中香叶醇、芳 樟 醇、 橙花 醇、 苯 甲 醇、 苯乙 醇等葡萄糖 苷的存在 12 。糖苷类 化 合物的存在， 一方面可能 是有 利于其 在 植 物 体 内的 运输 ， 另 一方 面可能 是以 一种 低 毒或 脱 毒 的形式 避 免 其 苷元对 植 物 自身 的 毒 害 13 。 茶叶糖苷类香气 前体 的研究 始 于 20世纪 80年 代初 。 验 证 糖苷类香气 前体 存在的 最 根 本 办 法 是 从 茶叶中分 离 得 到 这类物质 14 。 1991年 Ya

29、no 15 首 次 分 离 出 苯 甲 醇 -D-葡萄 糖苷 并 对 其进 行 了 结 构 鉴 定 。 1993年 Guo WF等 16 研究 乌龙 茶香气形成 机理时 ， 从 水 仙 种 茶 鲜 叶中分 离并 鉴 定 得 到 香叶醇的 一种前体 物 香叶基 - -樱草糖苷 （ 即 香叶基 -6-O- -D-吡喃 木糖 - -D-吡喃 葡糖苷 ） ，这是 首 次 从 茶叶中分 离 发 现 二 糖苷形式的茶叶香 气 前体 。在 此 研究基础 上 ， 他 们 又从 其 他 品种 茶 鲜 叶中分 离 得 到 芳 樟 醇、 2-苯乙 醇、水 杨 酸甲 酯 、芳 樟 醇 氧 化 物等的 二 糖苷形式的香

30、气 前体 17 。 1994年 游 小 青 等 18 对茶叶 键 合 态 和 游 离 态 香气 特 征 物质 进 行 了 研究， 提 出茶叶中香气 前体 物质 向 游 离 态 香气转 化 的 潜 力 ， 可用 键 合 态 香气与 游 离 态 香气的 比值 （ 记 为 b/f） 来 衡 量 ， 该 研究发 现 槠 叶 种鲜 叶中萜烯醇类 化 合物的 b/f值 均大 于 1， 证 明了 萜烯醇类的 键 合 态 含 量 远远 高于 游 离 态 含 量 ， 其 中香叶醇、芳 樟 醇、芳 樟 醇 氧 化 物 I的 b/f值 分 别 高 达 16.83、 10.32、 12.33； 另 外 ， 鲜 叶中的

31、 其 他 香气成分 如 顺 -3-己 烯醇、水 杨 酸甲 酯 、 2-苯乙 醇等的 b/f值 也 均大 于 1，这 说 明 茶 鲜 叶有 着 极 大 的释香 潜 力 。 大 量 研究 已 证 实 ，茶叶主要香气组分单萜烯醇类和芳香醇类 化 合物在茶 鲜 叶中主要 是以糖苷形式存在 19 。这 些 醇类苷元与糖 结 合以 后 ，水 溶 性 增大 、 稳 定 性 增强 ，且 生 物 活 性 降低 或 消失 9 。 目 前 ， 已 经 从 茶叶中分 离 鉴 定了 多 种 单萜烯醇糖苷和芳香族醇糖苷， 基 本 上 都 是 二 糖苷和单糖苷， 二 糖苷以 -樱草糖苷为主，单糖苷以 -葡萄糖苷为主，且 3

32、 -樱草糖苷 含 量 远远 高于 -葡萄糖苷 含 量 20-22 。由 于 多 方面 条件 的 限 制 ， 早期 有关茶叶 香气的研究主要 集 中 于 香气 提 取 方法 、香气组分 鉴 定 以 及 加 工 过程 香气组分的 变化 等 方 面 ，对香气形成 机理 的研究 则 相对 甚 少 。 随 着 微 量 分 析 技术 如 红 外 光谱 、气相 色谱 、 液 相 色谱 、质 谱及 核磁共振 等的 普 及 ， 越 来 越 多 的糖苷类香气 前体 从 茶叶中 被 分 离 鉴 定 出 来 ，茶叶香气研究内 容 才得 以不 断 深 化 和 拓宽 23 。茶叶糖苷类香气 前体 的相关研究，为 进一步

33、研究 利用 这类 潜 在的香气源 改善 香气 品 质 提供了理论依据 。 1.2 茶树内源糖苷酶研究概况 茶叶香气 前体 的研究 推 动 着 相应糖苷酶的研究。 1981年 Takeo等 24 通 过 机 械 破碎 茶 树 幼嫩 新 稍获 取 其 匀浆 物， 去 除 易 挥发物 后 向 其 中 添 加 外 源 -葡萄糖苷酶，在 40 培 养 30min后 发 现 有 大 量 香气物质 产 生 ， 当 向 反应 体系 中 加 入 Hg 2+ 和 -葡萄糖苷酶的 特 异性 抑制 剂 葡萄糖 酸 -1,4-内 酯 后 ，发 现 香气物质释放 停 止 ，由 此 推 测 茶叶香气物质的 产 生 与内源的

34、 -葡萄糖苷酶有关。这是研究茶叶香气释放相关酶的 起 始 。 1987年 Fisher 25 用 外 源 -葡萄糖苷酶 及 果 胶 酯 酶水解 红 、 绿 茶 时 产 生 大 量 香气物质， 该 结果 进一步 说 明 -葡萄糖苷酶 能 促 使 茶叶香气物质的释放。 Yano 等 26 以对 硝 基 苯 - -D-葡萄糖苷为 底 物， 与茶叶 粗 酶 提 取 物 共 同 培养 ， 测 出 每 100 g茶 鲜 叶中 含 有 20.8个活 力 单 位 的 -葡萄糖苷 酶。这 一 结果 的 得 出不仅 支持 了 Takeo的 推 论 ， 也 首 次证 实了 茶叶中存在参与茶叶香气 释放的 -葡萄糖苷

35、酶。 1994年 Morita等 27 将茶 鲜 叶中 提 取 制 备 的 粗 糖苷分 别 与 四 种 酶 剂 （ -葡萄糖苷酶， -葡萄糖苷酶，糖苷酶 粗 提 物， 丙 酮 粉 ） 共 同 培养 ， 结果显 示 ， - 葡萄糖苷酶 处 理时 几乎 没 有香气物质 产 生 ， -葡萄糖苷酶 处 理时 有 大 量 的香气物质 产 生 ， 用 糖苷酶和 鲜 叶 丙 酮 粉 处 理时 ，释放的香气物质 却 远远 高于 -葡萄糖苷酶 处 理时 所 释放的香气物质， 四 种 释放 效 果 以 丙 酮 粉 最 高 。 结果 表 明 ， -葡萄糖苷是茶叶香气 前 驱 体 的主要存在形式 之 一 ，茶叶香气

36、前体 中 除 了 -葡萄糖苷形式 外 ， 还 有 其 他 形式的单糖 苷、 二 糖苷 或 寡聚 糖苷等形式存在，且相应的内源酶 也具 有 多 样 性。 茶叶香气 前体 含 量 在 嫩 叶中 含 量 较 高 ， 随 着 叶 龄 的 增加 而 逐渐 降低 ，糖苷酶 活 性 也 是 随 着 叶 龄 的 增加 而 逐渐 变 弱 。 另 外 ，糖苷酶 活 性 还 存在 品种 、 季 节 、 加 工 过程 等差异。 夏 涛 等 28 研究 了 红 茶 萎凋 发 酵 过程 中 -葡萄糖苷酶的 活 性 变化 ， 张秀云 等 29 对 福鼎 大 白 茶和 槠 叶 种用 不 同 的 做 青 工 艺 研究 做 青

37、过程 中 -葡萄糖苷酶 活 性的 变化 进 行 了 研究， 骆耀 平 等 30 对 毛蟹 、水 仙 和 龙 井 43等 7个 品种 茶树 新 稍 的 -葡萄糖苷酶 活 性 进 行 了 测 定 ， 张秀云 等 31 对不 同 季 节 的 槠 叶 种鲜 叶的 -葡萄糖苷酶 活 性 进 行 了 研究， 张 正 竹 等 14 研究 了 槠 叶 种 茶 鲜 叶中糖苷类香气 前体 在不 同 季 节 和 绿 茶 加 工 过程 中的 消 长 规律 ， 董尚 胜 等 32 发 现 不 同 的 栽 培 措施 也 对茶树中 -葡萄糖苷酶 活 性 也 有 很 大影响 。以 上 -葡萄 糖苷酶 活 性的研究，为 品种

38、的 培育 以 及 适 制 性 提供了理论 参 考 。 -樱草糖苷酶是茶 鲜 叶中的 一种重 要的糖苷酶， 能 专 一 性水解樱草糖的香气 前体 ， 4 与 乌龙 茶、 红 茶 制作 过程 中 花 香 型 香气的形成 密切 相关。 1995年 Guo等 33 从 薮北 种 茶 鲜 叶中 提 取并 鉴 定了 -樱草糖苷酶， 确 定 该 酶为糖苷类香气 前体 水解 产 生 醇 系 香气 过程 中的关 键 酶 ； 1997年 Matsumura等 34 证 明 茶树叶片中的糖苷主要以樱草糖苷形式存在 ； 1997年 Ogawa等 35 从 茶叶中 纯 化 得 到 -樱草糖苷酶， 并 对 其 性质 进

39、行 了 研究 ； 2001年 Ma SJ等 36 为 了 研究樱草糖苷酶的 底 物 特 异性，合成 了 苯乙 醇的 9种 二 糖苷和 1种 单糖 苷，研究发 现 樱草糖苷酶对 底 物的 配 基 并 无 明 显 特 异性， 特 异性主要是 针 对糖苷的樱草 糖基 部 分 （ 6-O- -D-吡喃 木糖 - -D-吡喃 葡萄糖 ），且水解 模 式研究表 明 ， 该 酶 可 水解樱 草糖苷 生 成 二 糖和相应的 配 基， 而 保 留 二 糖内 部 化 学 键 。 2002年 Mizutani等 37 从 薮北 种 茶 鲜 叶中分 离 纯 化 得 到 -樱草糖苷酶， 测 得该 酶的分 子 量 为 6

40、1 kD并 获得 其 氨 基 酸 序 列 ，将 该 酶基因转 入 大 肠杆 菌 进 行 表达，表达 产 物的水解 特 性 再 次证 明 -樱草糖苷酶 能 有 选 择 地 识 别 樱草糖苷 作 为 底 物， 而 且 作用于 樱草糖与 配 基 之 间 的糖苷 键 。 有关茶叶中内源糖苷酶分 子 生 物 学 方面 的研究 目 前也 有 一定 程度 的开 展 ，这 些 研究 成 果 为 后 期 糖苷酶的相关研究 奠 定了 基础。 李 远 华 38 成 功 完 成 了 -葡萄糖苷酶的 体 外 表 达，且表达 产 物 具 有 正 常生 物 学 活 性。 同 时 他 还 采 用 原 位 杂 交 技术 对茶树

41、 -葡萄糖苷酶 基因 mRNA的表达 进 行 了 研究 39 ， 结果 表 明 ， -葡萄糖苷酶主要在茶树叶片的 栅栏 组 织 、叶主 脉 的 薄壁 组 织 进 行 表达，不 同 品种 之 间 的表达 位 置 基 本一致 ， 但 表达 信号 强 弱 有 季 节 差异，表 现 为 春稍 秋 稍 夏稍 。 赵丽萍 等 人 40 采 用实时定量 PCR之 绝 对 定量 的 方法 ， 检 测 了 龙 井 43新 稍 不 同 叶 位 的 -葡萄糖苷酶基因表达水 平 差异，这 进一步 说 明 -葡萄糖苷酶的表达在茶树不 同 叶 位 的叶片中存在差异。 1.3糖苷类物质在茶树防御体系中的作用 正 常 茶 鲜

42、 叶中，这 些键 合 态 香气 前体 与内源糖苷酶在叶 细胞 中 被 区 室 化 而 相 安 无 事 。在 特 定 条件 （ 采 摘 、 机 械损伤 、 昆 虫 取食 、病菌侵染等 ）下 ，内源糖苷酶与香气 前 体 相 遇 而 发 生作用 ，糖苷类香气 前体被 内源糖苷酶水解，释放出挥发性醇 系 苷元， 从 而 表 现 出香 味 、 抗 病虫等 生 命 特 征 。 乌龙 茶在 萎凋 、 摇 青 过程 中因 机 械损伤 和水分 缺 失 等 逆 境而 产 生 特 殊 的香气物质，有 可能 是 植 物对 外 界 条件 的 一种 应 答 反应。 产 于 我 国 台湾 省 新 竹 、 北埔 、 苗粟 一

43、 带 、 享 有 “东 方 美 人 ” 之 美誉 的 桠风 茶， 风 味 独 特 ， 尤 其 是 其 香 气 具 有 浓 郁 的 茉莉 花 香、 熟 果 香和 蜜 糖香，研究 41 发 现 产 生其高 香的原因主要在 于 ， 每 年 5月 至 7月 茶树 嫩 梢 上 的茶 小 绿 叶 蝉 聚 集 侵染茶树， 受 侵染 之 后 的茶 芽 采 摘 后 ， 按 照 传 统 的 加 工工 艺 加 工 出 来 的 乌龙 茶 却 风 味 极 佳 ，成为 乌龙 茶中 之 极 品 。 作 为茶树 次 生 代谢 物质的挥发物， 它 在茶树叶片中的合成和水解 也 伴 随 着 相应 生理 功 能 的 实现 。茶树有

44、 可能 在 外 在物 理 或 化 学 因 素 的 诱导 下 强化 糖苷类物质的 生 物合成和 积累 ， 通 过 水解释放挥发物 来 实现 自身 与 环境 的 交 流 42 。在 植 物 -害虫 -天敌 三级营 养 关 系 中， 植食 性 昆 虫 取食 诱导 植 物 产 生 挥发性 化 合物 常常 成为引 诱 昆 虫 天敌 的 重 要 机制 。 5 陈宗懋 等 43 以茶树和 三 种 主要害虫茶 尺蠖 、茶 蚜 、 假眼 小 绿 叶 蝉 及其 天敌 为对 象 ，研究 茶树 -害虫 -天敌间 的 化 学 信 息联 系 ， 结果 表 明 害虫对 寄 主的 定 位 依 赖 于 茶树 芽 稍 的挥发 物

45、， 如 顺 -3-己 烯醇、芳 樟 醇等，这 些化 合物对害虫 具 有 强 引 诱 力 和 电 生理 反应， 但 是对 天敌 仅有 弱 的 活 性 ； 但 是害虫侵害茶树以 后 ，茶树 体 内 代谢 发 生了 变化 ，释放出 特 异性 互 利 素 ， 它 们 在 10 -6 10 -9 g/mL低 浓 度 下 对 各自天敌 具 有 强 引 诱活 性和 电 生理 反应， 但 对 害虫仅 具 有 弱 活 性 或 无活 性。害虫 口腔 分 泌 物中的酶类是 诱导 特 异性 互 利 素 形成的引发 子 。 近年 来 ，香 精 油 的 抗 菌 活 性 也 受 到 了 广泛 关 注 。 美 国 佛罗里 达

46、 大 学 的研究 人 员 发 现 44 ，香 精 油 对 黑 曲 霉 、 尖镰孢 菌、 脂状 青 霉 和 毛 霉软腐 菌的 生长 都 有 抑制作用 ，有 可能 作 为 新一 代 环境 友好 型 农 药 ， 用于 防 治 多 种 植 物病害。 从 樱 桃 叶中分 离 得 到 的 多 种 糖苷 经 酶 促 水解 所 释放出的 苯 甲 醛 、 苯 甲 醇、 苯乙 醇、香 豆 素 等苷元， 被 证 实具 有 一定 的 抗 真菌 活 性 45 。香 精 油 中萜烯醇类 如 芳 樟 醇、香叶醇等对 革兰氏阳 性菌、 革兰氏阴 性菌 及 某 些 真菌 也 有 一定 的 抑制作用 46 。 大 量文 献 研究

47、 并 报道了 香 精 油 组分对 一 些 细 菌、真菌 的 抗 性，这类 具 有芳香气 味 、挥发性的 植 物 次 生 代谢 物质，在 民 间 用药 、 食 品 调 味 料 、 食 品 防 腐 剂 以 及 香 料 行 业 等 都 有 很广泛 的应 用 47 。 茶叶中的糖苷类物质 作 为香气 前体也 参与 植 物的防御 体系 。 张 正 竹 等 48 从 茶 鲜 叶中 提 取 粗 糖苷 后用 茶叶 粗 酶 处 理 ，分 析 茶叶主要的挥发物组分对茶 云 纹 叶 枯 病 致 病菌的 抑 制作用 。气相 色谱 结果 表 明 ， 顺 -3-己 烯醇、芳 樟 醇 氧 化 物、芳 樟 醇、 甲 基水 杨

48、 酸 、香叶 醇、 苯 甲 醇和 苯乙 醇是水解 后 挥发性苷元的主要成分，且挥发性苷元的 含 量 远 高于 相应 的 游 离 态 香气 ； 抑 菌 结果 表 明 ，香叶醇、芳 樟 醇、 甲 基水 杨 酸 、 苯 甲 醇和 苯乙 醇 均 对茶 云 纹 叶 枯 病 致 病菌表 现 出 显著 的 抑 菌 活 性， 其 中香叶醇 抑制作用 最强 ， 而 顺 -3-己 烯醇和 芳 樟 醇 氧 化 物的 抑 菌 活 性 稍 弱 。 试 验 中茶 鲜 叶中 制 备 糖苷类香气 前体 对茶 云 纹 叶 枯 病 致 病菌 也 表 现 出 显著 抑制 活 性。由 此 推断 ， 作 为茶树 自身 防御 体系 之 一 ，糖苷类香气 前体 合成 并 贮 存与叶片中， 当 遭受 云 纹 叶 枯 病等 致 病菌侵染 时 ， 可被 内源和 外 源糖苷酶水解， 释放出挥发性苷元， 从 而 表 现 出 抗 病性。 1.4咖啡碱抑菌作用及其生物合成关键酶研究进展 咖啡碱 ，茶树叶片内 含 量 最多 的 一 类 嘌呤 类 生 物 碱 ， 约 占 茶叶 干 重 的 2%4% 9 ， 随 茶树 生长 条件 及品种 差异 而 有 所 不 同 。 据 有关 资 料 指 出， 咖啡碱 最早 发 现于 茶和 咖啡 两 种 植 物中 49 。 目 前已 发 现 的 含 咖啡碱