基因克隆的质粒载体.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流基因克隆的质粒载体.精品文档.基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质

2、粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。第一节 质粒的一般生物学特性一、质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，

3、称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。二、质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质

4、粒的最重要的编码特性之一。三、质粒DNA的转移（1）质粒的类型革兰阴性细菌的质粒可以分成接合型和非接合型的两种类群。接合型的质粒（conjugative plasmid），又叫自我转移的质粒。它们除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。非接合型的质粒（non-conjugative plasmid），亦叫不能自我转移的质粒。它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配骊和接合转移的基因，因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。（2）F质粒又叫F因子，即致育因子（fertility factor）的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表

5、性的单拷贝的接合型质粒。 F质粒有三种不同的存在方式：（i）F+细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。（ii）F细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或DN区段。（iii）Hfr细胞（高频重组细胞）：以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F-细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对。我们

6、称这种过种为细菌的接合作用（conjugation）。配对之后F-受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能相发寄主染色体发生高频转移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变参展F+或F细胞。质粒的主要类型见表4-1。（3）质粒DNA的接合转移细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。但是，大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的“表面排斥”蛋白质，使此种细

7、胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。质粒DNA的转移 F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞如图4-4。四、质粒DNA的迁移作用非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自多转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程

8、，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基因（mobilization gene）编码的核酸酶。mob基因和bom基因参与ColE1质粒的迁移作用这个结论，是根据图4-5的实验结果作出的。相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供经所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。图4-5（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录

9、，其产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。图4-5（b）中的细胞同时含有F和ColE1两种质粒。F因子能够导致性须的合成，为其DNA转移提供了转移装置，因此ColE1可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColE1的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明，mob-突变是隐性的，mob基因编码

10、一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。图4-5（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。图4-5（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。五、质粒DNA的复制类型根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有13份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒（stringent plasm

11、id）；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达1060份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒（relaxed plasmid）。质粒拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。表4-3列举了若干种通用的质粒复制基因的特性。表4-2列举了若干种通用质粒复制基因的特性。六、质粒的不亲和性（1）质粒的不亲和性现象所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀

12、释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒（图4-6）。不亲和群（incompatibility group），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。（2）质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制法动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓

13、度遏蛋白质的条条件下，它的复制反应便会继续进行。由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制一、质粒DNA复制的多样性不同质粒DNA的复制在如下几个方面存多样性：（i）对寄生酶的依赖性 （ii）DNA聚合酶的利用 （iii）复制的方向性 （iv）复制的终止（v）复制型 二ColE1质粒DNA复制的启动ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键

14、因素RNAI和RNA两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。其中RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。因此，从本质上讲，ColE1质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理控制的。根据这种模型，细胞中RNA分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，RNA的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。三、质粒复制控制的分子

15、模型目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：其一是自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model），其二是抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（negative feedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型如图4-7所示。它认为质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作

16、用方式有两种途径：一种是通过同质粒DNA的复制起点（oir）结合，直接地抑制质粒DNA的复制；另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。（2）自体阻遏蛋白质模型在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白质模型（图4-8）。这个模型对质粒DNA复制控制机理有两种解释：1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用

17、，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Arr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制图4-8（a）。2. Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制图4-8（b）。第三节 质粒DNA的分离与纯化应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得批量的纯化的质粒DNA分子。我们通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌细胞裂解的，绝大部分的染色体

18、DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，这样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到了比较清亮的裂解液。目前已发展出了许多种方法，可用来从清亮裂解液中纯化质粒DNA。一、氯化铯密度梯度离心法在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子量较小、结构紧密，因此仍能保持完整的状态。氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这一差别建立的纯化质粒DNA的经典技术。当将含有溴化乙锭（EtBr）的氯化铯（CsCl）溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会通过在碱基对之间的嵌入作用而结合成DNA分子链上，并因

19、此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，例如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合相当大量的EtBr分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子， EtBr分子的结合数量相对较少。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的（图4-9）。图4-10表明了分离纯化质粒DNA的程序。二、碱变性法这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。通过加热，尤其是在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，

20、连接DNA互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH值更会迅速地复性，复性迅速而准确。线性的染色体DNA分子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确。它们聚集形成的网状结构，通过离心分离便会与变性的蛋白质及RNA一道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒cccDNA则可用酒精沉淀法收集。三、微量碱变性法微量碱变性法具有简单快速、经济实惠的优点，是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒DNA的方法，现将其操作程序及其原理简述如下：第一步，取1.5毫升含有质粒的

21、大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀，并用100微升冰冷的溶液I50mM葡萄糖，25Mm Tris-HCl（Ph8.0），10Mm EDTA，45mg溶菌酶/mL重新悬浮。将反应混合物在室温下静置5分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的pH值有很大的依赖关系， TrisHCl缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸（EDTA），可抑制酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。第二步，加入200微升冰冷的溶液0.2N NaOH, 1.0%SDS，缓缓混匀后，置室温下5分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA

22、。在高pH值（12.012.5）的反应体系中，则会使线性缺口的质粒DNA以及线性的染色体DNA片段被选择性地变性，而共价闭合环状的质粒DNA则不会受影响。第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体DNA复性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复合物形式沉淀出来，从而使质粒DNA得到纯化。第四步，将上述离心所得的主

23、要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。按照这种方法制备的质粒DNA，其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。四、影响质粒DNA产量的因素（1）寄主菌株的遗传背景大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的重要条件之下。为此一般建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质

24、粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。（2）质粒的拷贝数及分子大小细菌培养物中质粒DNA之理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出（表4-3）。质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。 第四节 质粒载体的构建及类型一、天然质粒用作隆载体的局限性天然质粒一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1RSF2124和pSC101等。鉴于于然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性，科学工作者便在其基础上进行了修饰改造，首先

25、发展出了一批低分子量、高拷贝、多选择记号的质粒载体。二、质粒载体必须具备的基本条件现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：(i)具有复制起点；(ii)具有抗菌素抗生基因；（iii）具若干限制酶单一识别位点；（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 三质粒载体的选择记号在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。但绝大多灵敏的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号。基因克隆实验中常用的几种抗菌素的作用方式及其抗性机理列于表4-4。四、不同类型的质粒载体（1）

26、高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后，每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到10003000个之多。如果加入高浓度的尿核苷，质粒DNA又可进一步扩增23倍。（2）低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。这类质粒载体的一个普遍性问题是，由于它们体积小、拷贝数低，与此相

27、应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNA就很困难。（3）失控的质粒载体失控的质粒载体（runaway plasmid vectors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。这种质粒载体在30下，每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数，而当培养温度超过35时，质粒的复制便失去了控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续23小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了

28、存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。（4）插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。（5）正选择的质粒载体正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提

29、高了选择的敏感性。（6）表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。第五节 重要的大肠杆菌质粒载体一、pBR322质粒载体pBR322质粒是目前在基因克隆中广泛使用的一种大肠杆菌质粒载体。（1）pBR322质粒载

30、体的构建在pBR322质粒载体的构建过程中（图4-12）的一个重要目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点，同时还要设法使质粒同存在任何易位子统统失去功能。易位子的转移（即易位）有可能导致选择记号的丧失，甚至也有可能使克隆的DNA片段丧失或重排。构建pBR322质粒的还必须通过体内易位或体外重组加入可选择的抗药性记号。图4-13表示了质粒载体的形体结构。（2）pBR322质粒载体的优点pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pBR322质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（

31、tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒Pmb1的DNA复制起点（ori）（图4-14）。pBR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：第一，具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分子为4 363bp。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA的插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15），可以有效的检测重组体质粒。第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝。这就为重组DNA的制备提供了极大的方便。二、pUC质粒载体

32、 pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。（1） pUC质粒载体的结构一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能（

33、图4-16）。（2）pUC质粒载体的优点第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bP，pUC18为2686bP。 pUC8质粒平均每个细胞即可达500700个拷贝。第二，适用于组织化学方法检测重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的:acZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。第三，具有多克隆位点MCS区段 pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DN片

34、段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核着酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。第六节 质粒载体的稳定性问题一、质粒载体不稳定性的类型质粒的不稳定性（plasrnid instability）中包括分离的不稳定性（segregational instability）和结构的不稳定性（structural instability）两个方面。前者是指，在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DN拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；而后者

35、则主要是指，由转位作用和重组作用所引起的质粒DN的重排与缺失。（1）结构的不稳定性DNA的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性的原因。（2）分离的不稳定性在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因。我们将这种起因于质粒的缺陷性分配（defective Partitioning）所造成的质粒的丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性。在细胞分裂过程中，质粒拷贝分配到子细胞的途径可分成主动分配（active Partition）和随机分配（random distribution）两种不同的方式。已经提出了两种关于主动分配的机理：其一是平均分配（equipartition

36、）机理，它使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝图4-17（a）；其二是配对位点分配（pair-partition）机理，它认为只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定性。随机分配，它是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的图417（b）。由此产生的分离频率（segregation frequency），即形成无质粒细胞的频率相当低，因此在一般情况下通过随机分配质粒亦能够得到稳定的遗传。二、影响质粒载体稳定性的主要因素（1）新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应含有质粒载体的寄主细胞重了代谢的负荷，降低了生长的

37、速度。因此，尽管在细胞分裂过程中，因随机分配而产生无质粒载体细胞的机率相当低，但由于这些细胞生长速度快，经过初始的缓慢累积之后，最终便会取代具质粒载体的细胞，成为培养物中的优势群体。（2）拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度（variance），可影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定性的原因之一。具低差度分布（low variance distribution）特性的质粒载体相当稳定，而具有高差度分布（high variance distribution）特性的质粒载体，稳定性则较差。（3）寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体（plasmidoligomer），它同样是造成质粒载体不稳定性的原因之一。决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要的因素：其一是质粒DN分子间的重组频率，其二是含质粒寡聚体细胞的生长速率。重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖，即所谓的二聚体灾难（dimer catastrophe）。