基因克隆的载体讲稿.ppt

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1、关于基因克隆的载体关于基因克隆的载体第一页，讲稿共八十六页哦第二页，讲稿共八十六页哦 载体（载体（vectorvector）是由在细胞中能够自）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：的载体，必须具备以下几个性能：第三页，讲稿共八十六页哦1 1、分子较小，可携带比较大的片段。、分子较小，可携带比较大的片段。2 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。、能独立于染色体而进行自主复制并且

2、是高效的复制。3 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites multiple cloning sites，MCSMCS）。4 4、有适合的标记，易于选择。、有适合的标记，易于选择。5 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。能是高效的表达。6 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限

3、于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。室内特殊菌种内才可复制等等。第四页，讲稿共八十六页哦功功 能能克隆载体克隆载体:克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断表达载体表达载体:用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体:把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中第五页，讲稿共八十六页哦来源：来源：质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体真核细胞克隆载体第六页，讲稿共八十六页哦质粒*受体细胞结构插入片断举例 E.coli环状 8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等 噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系

4、列，gt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状 10 kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV BAC(Bacterial Artificial Chromosome)E.coli环状300 kbPel oBAC系列PAC(P1-derived Artificial chromosome)E.coli环状100-2000 kbPCYPAC1YAC(Yeast Artificial chromosome)酵母细胞线性染色体100-2000 kbMAC(Mammalian Artificial Chromosome)哺

5、乳类细胞线性染色体 1000 kb病毒载体动物细胞环状SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征载体的种类和特征第七页，讲稿共八十六页哦1.1.质粒（质粒（plasmidplasmid）载体）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNADNA，一般大，一般大小约小约10106 610108 8D D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为

6、良好的载体。体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。第八页，讲稿共八十六页哦质粒（质粒（plasmidplasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA 分子。大小约为分子。大小约为 数千碱基对。常数千碱基对。常 有有1 1 3 3个抗药个抗药 性基因，以利于性基因，以利于 筛选。筛选。第九页，讲稿共八十六页哦质粒载体质粒载体1.1.克隆的质粒载体克隆的质粒载体2.2.允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存

7、。主要是插入，储存。主要是DNADNA水水平上的操作。平上的操作。2.2.基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体3.3.允许外源允许外源DNADNA的插入、储存和表达。的插入、储存和表达。第十页，讲稿共八十六页哦1.11.1质粒的生物学特性：质粒的生物学特性：1 1、质粒质粒DNADNA的构型：的构型：SC SC 型型 共价闭合环形共价闭合环形DNADNA（cccDNAcccDNA）OC OC 型型 开环开环DNADNA（ocDNAocDNA）L L 型型 线性线性DNADNA（cDNAcDNA）2 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：、不同质粒的分子量大小差异相当显著：10106 61010

8、8 8D D 3 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（复制基因（replicatorreplicator）、选择性记号、克隆位点）、选择性记号、克隆位点 第十一页，讲稿共八十六页哦LOCSC第十二页，讲稿共八十六页哦4 4、质粒、质粒DNADNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5 5、质粒、质粒DNADNA的类型：的类型：接合型和非接合型；含大肠杆菌素接合型和非接合型；含大肠杆菌素ColCol质粒和含抗菌质

9、粒和含抗菌 素抗性基因的素抗性基因的R R质粒；质粒；F F因子和因子和FF因子等。因子等。按接合转移功能分类主要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，长生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒第十三页，讲稿共八十六页哦6 6、质粒、质粒DNADNA的复制类型：的复制类型：低拷贝的质粒（低拷贝的质粒（1 13 3）：严紧型复制控制的质粒（接合型）：

10、严紧型复制控制的质粒（接合型）高拷贝的质粒（高拷贝的质粒（10601060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）7 7、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性的不相容性:是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干质粒的不亲合性

11、分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。扰造成的。第十四页，讲稿共八十六页哦第十五页，讲稿共八十六页哦1.2 1.2 质粒质粒DNADNA的分离与纯化的分离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法 2 2、碱变性法、碱变性法 第十六页，讲稿共八十六页哦1.2.11.2.1氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法1、质粒DNA占总DNA的1%2%；2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，

12、EB含量越高，密度会越低。第十七页，讲稿共八十六页哦流程：流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促进大肠杆）来促进大肠杆菌的细胞裂解。菌的细胞裂解。将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链的碱基中去。链的碱基中去。在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。第十八页，讲稿共八十六页哦第十九页，讲稿共八十六页哦第二十页，讲稿共八十六页哦1.2.21.2.2碱变性法：碱变性法：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体

13、DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在PH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA第二十一页，讲稿共八十六页哦流程：流程：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖，

14、葡萄糖，25mM Tris-HCl 25mM Tris-HCl PH=8.0,10mM EDTAPH=8.0,10mM EDTA，4 45mg5mg溶菌酶）静置溶菌酶）静置5 5分钟；分钟；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）缓缓混匀置室）缓缓混匀置室温温5 5分钟。分钟。6565度水浴一段时间会加强染色体度水浴一段时间会加强染色体DNADNA的变性作用。的变性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3M醋酸钠，振荡后，冰浴醋酸钠，振荡后，冰浴5 5分钟。分钟。5

15、5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNADNA第二十二页，讲稿共八十六页哦1.2.3 1.2.3 影响质粒影响质粒DNADNA产量的因素：产量的因素：1 1）、寄主菌株的遗传背景）、寄主菌株的遗传背景 使用使用endAendA基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施：选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶酸内切酶 的表达；的表达；在纯化质粒在纯化质粒DNADNA的过程中，用加热法的过程中，用加热法核酸内

16、切酶核酸内切酶使失活；使失活；采用最佳的实验流程，减少采用最佳的实验流程，减少核酸内切酶核酸内切酶的污染并在纯化了质的污染并在纯化了质粒粒DNADNA之后，迅速除去污染的核酸酶。之后，迅速除去污染的核酸酶。第二十三页，讲稿共八十六页哦 2 2）、质粒的）、质粒的拷贝数拷贝数及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA会引起质粒拷贝数的下会引起质粒拷贝数的下降。降。第二十四页，讲稿共八十六页哦1.3 1.3 质粒载体的构建与类型质粒载体的构建与类型 天然质粒：天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。质粒。在大肠

17、杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有有EolE1EolE1、RSF2124RSF2124和和pSC101pSC101等，但存在一定的局限性。等，但存在一定的局限性。第二十五页，讲稿共八十六页哦 第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101pSC101，它含有一，它含有一个个EcoREcoR酶切位点，一个四环素抗性选择记号（酶切位点，一个四环素抗性选择记号（TetTetr r ），插入外源片断后不影响其复制功能，），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插量较大

18、，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。入失活技术选择重组分子。第二十六页，讲稿共八十六页哦 ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoRl中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆但对大肠杆菌素菌素E1E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。第二十七页，讲稿共八十六页哦1.4 1.4 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件(1)(1)、具有复制起点；、具有复制起点；自我增值的基本条件，一般具自我增值的基本条件，一般具一个一个复制子。复制子

19、。(2)(2)、具有抗菌素抗性；、具有抗菌素抗性；理想的质粒载体具有理想的质粒载体具有两种两种抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。(3)(3)、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切单一单一位点（位点（CMSCMS）；）；(4)(4)、具有较小的分子量和较高的拷贝数。、具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化给受低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因第二十

20、八页，讲稿共八十六页哦 以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp）第二十九页，讲稿共八十六页哦 1.4.1.质粒载体的选择记号质粒载体的选择记号 新陈代谢特性；新陈代谢特性；对大肠杆菌素对大肠杆菌素E1E1的免疫性；的免疫性；抗菌素抗性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因；大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。第三十页，讲稿共八

21、十六页哦1.5 1.5 不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。编码基因等。第三十一页，讲稿共八十六页哦

22、(1)(1)失控的质粒载体失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。ExampleExample：pBEU1pBEU1和和pBEU2pBEU2质粒，在质粒，在3030度下，每个寄主细胞只含有适量的度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过拷贝数，当培养温度超过3535度时，质粒的复制将失去控制，每个度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续蛋白质的合成可按正常的速率持续2 23 3小时。最后得到超量小时。最后

23、得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒的质粒DNADNA占细胞总占细胞总DNADNA的的50%50%。第三十二页，讲稿共八十六页哦(2)(2)插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 将外源将外源DNADNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。机会。ExampleExample：在在pBR329pBR329质粒载体的质粒载体的EcoR1EcoR1位点插入外

24、源片断，会使氯霉素位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。第三十三页，讲稿共八十六页哦(3)(3)正选择的质粒载体正选择的质粒载体 正向选择：正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。并可赋予寄主细胞相应的表型。第三十四页，讲稿共八十六页哦ExampleExampl

25、e：质粒质粒pKN80pKN80有来自有来自MuMu噬菌体噬菌体DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片断，编码的片断，编码一种致死功能的一种致死功能的kilkil基因。基因。该质粒在该质粒在MuMu噬菌体的溶源菌噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。株中是致死的。在在HindHind 或或Hpa Hpa 位点插入位点插入外源外源DNADNA片断后，会产生具片断后，会产生具AmpAmpr r表型的表型的MuMu噬菌体的非溶源噬菌体的非溶源的转化子菌株的转化子菌株第三十五页，讲稿共八十六页哦正向选择质粒载体的条件限制：正向选择质粒载体的条件限制：1

26、1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基、需要特殊的寄主菌株或选择培养基 2 2、可使用的克隆位点少、可使用的克隆位点少 3 3、假阳性水平高、假阳性水平高 4 4、不能够调节插入序列表达活性、不能够调节插入序列表达活性第三十六页，讲稿共八十六页哦 (4)表达型的质粒载体表达型的质粒载体表达载体：表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。克隆载体。第三十七页，讲稿共八十六页哦主要包括：主要包括：大肠杆菌的

27、启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。因。待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。效的转录。第三十八页，讲稿共八十六页哦 第三十九页，讲稿共八十六页哦1.6 1.6 重要的大肠杆菌质粒载体重

28、要的大肠杆菌质粒载体 1 1、pSC101pSC101质粒载体；质粒载体；2 2、ColE ColE 质粒载体；质粒载体；3 3、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体；4 4、pUCpUC质粒载体；质粒载体；5 5、其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体第四十页，讲稿共八十六页哦1.6.1 pSC1011.6.1 pSC101质粒载体质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有体。平均每个寄主细胞仅有1 12 2个拷贝；分子量个拷贝；分子量9.09kb9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（，编码有一个四环素

29、抗性基因（tettetr r ）。）。有有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、Sma Sma 7 7种核酸内切限制酶。其中在种核酸内切限制酶。其中在HindHind 、BamH BamH、Sma Sma 3 3个位点克隆外源个位点克隆外源DNADNA，都，都会导致会导致tettetr r 基因失活。基因失活。是第一个真核生物的克隆载体是第一个真核生物的克隆载体第四十一页，讲稿共八十六页哦第四十二页，讲稿共八十六页哦Example1:应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质

30、粒p1258,编码若干种能在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶EcoR 切割成4段。第四十三页，讲稿共八十六页哦第四十四页，讲稿共八十六页哦Example2:Example2:应用应用pSC101pSC101质粒作基因克隆载体质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNADNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6第四十五页，讲稿共八十六页哦第四十六页，讲稿共八十六页哦1.6.2 ColE1.6.2 Co

31、lE1 1 质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。第四十七页，讲稿共八十六页哦第四十八页，讲稿共八十六页哦 用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性：1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便；2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。第四十九页，讲稿共八十六页哦1.6.3 pBR3221.6.3 pBR322质粒载体质粒载体 “P”P”表示是一种质粒；表示是一种质粒；“BR”BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母表示两位

32、主要构建者姓氏的头一个字母“F.BilivarF.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;R.L.Rodriguez”;“322”“322”表示实验编号。表示实验编号。第五十页，讲稿共八十六页哦第五十一页，讲稿共八十六页哦pBR322pBR322的构建：的构建：为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）（克服质粒的结合转移能力

33、）第五十二页，讲稿共八十六页哦第五十三页，讲稿共八十六页哦pBR322pBR322的结构来源的结构来源第五十四页，讲稿共八十六页哦pBR322pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点：1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识

34、别位点，第五十五页，讲稿共八十六页哦Example:a.在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps sTets s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr r菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。第五十六页，讲稿共八十六页哦B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第五十七页，讲稿共八十六页哦 b.在Ps

35、t或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr r基因的失活，产生Amps sTetr r表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr r表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr r的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps s菌落无此反应。第五十八页，讲稿共八十六页哦 具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。第五十九页，讲稿共八十六页哦 pB

36、R322pBR322质粒载体的改良质粒载体的改良 为了更加实用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进行了改良，得到质粒进行了改良，得到许多许多pBR322pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。第六十页，讲稿共八十六页哦应用应用pBR322pBR322质粒作为基因克隆载体质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因水稻叶绿体光诱导基因psbApsbA的结构分析的结构分析 基因psbA编码的蛋白质，与光合作用系统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津结

37、合的能力，推测是三维结构发生了改变；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了25%和40%。第六十一页，讲稿共八十六页哦 通过对基因psbA的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbA基因。首先将水稻叶绿体DNA，用EcoR内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为1.82.5kb之间的DNA片断。再与经过EcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR32

38、2质粒DNA连接。然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成Ampr转化子菌落群体。用经32p标记的玉米psdADNA探针作菌落杂交，从1000多个菌落中筛选出8个阳性克隆。第六十二页，讲稿共八十六页哦 对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%第六十三页，讲稿共八十六页哦1.6.4 pUC1.6.4 pUC质粒载体质粒载体 人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在

39、其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。第六十四页，讲稿共八十六页哦 一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：系列的质粒载体，包括以下四个部分：1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。3、大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因；4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。第六十五页，讲稿共八十六页哦Am

40、proripUC18(3 kb)MCS(Multiple cloning sites,多科隆位点）Lac promoterlacZ第六十六页，讲稿共八十六页哦pUCpUC质粒载体的形体图质粒载体的形体图第六十七页，讲稿共八十六页哦pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第六十八页，讲稿共八十六页哦第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与

41、-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第六十九页，讲稿共八十六页哦1.6.51.6.5其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体第七十页，讲稿共八十六页哦（1 1）丧失迁移功能的质粒载体）丧失迁移功能的质粒载体第一,拥有较高水平的拷贝数,平均每个大肠杆菌寄主细胞可达3045份;第二,失去了bom位点，即便在共存的F质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。第七十一页，讲稿共八十六页哦第七十二页，讲稿共八十六页

42、哦（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体 pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。第七十三页，讲稿共八十六页哦第七十四页，讲稿共八十六页哦pGEM-11第七十五页，讲稿共八十六页哦 现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体RNA聚合酶启动子的简单的质粒载体，它们都是由pUC系列载体派生而来的。噬菌体的RNA聚合酶，所合成的RNA转录本除了可作为杂交探针

43、之外，在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入m7GpppG，能形成5的帽子结构，进行有效的蛋白质合成。第七十六页，讲稿共八十六页哦第七十七页，讲稿共八十六页哦（3）穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。第七十八页，讲稿共八十六页哦早期发现的大肠杆菌早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌大肠杆菌-牛乳头瘤病毒牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出

44、适用的大肠杆菌迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿植物细胞穿梭载体。梭载体。第七十九页，讲稿共八十六页哦第八十页，讲稿共八十六页哦1.6.5质粒载体的稳定性问题1、质粒载体不稳定性的类型 结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。第八十一页，讲稿共八十六页哦结构的不稳定性结构的不稳定性 DNA的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。1、质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。2、寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性

45、。第八十二页，讲稿共八十六页哦分离的不稳定性分离的不稳定性 细胞分裂过程中发生的质粒细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配不平均的分配，也是导致质粒，也是导致质粒不稳定性的重要原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配所不稳定性的重要原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配所造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分离的不稳定性。造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分离的不稳定性。第八十三页，讲稿共八十六页哦 要使质粒能够稳定的遗传，必须保证平均每个世代质粒最少复制一次；并且，细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分配 到两个子细胞中去。主动分配：主动分配：a.平均分配机理：使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝b.配对位点分配机理：只有一半数目的质粒呈主动分配，其余是随机分配的。随机分配：随机分配：细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。第八十四页，讲稿共八十六页哦影响质粒载体稳定性的主要因素：影响质粒载体稳定性的主要因素：1、新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷；外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用2、拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响。差度：差度：不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差异程度，可影响质粒载体丢失的速率。差度越大稳定性越差；差度越小稳定性越高。第八十五页，讲稿共八十六页哦感谢大家观看第八十六页，讲稿共八十六页哦