植物基因克隆的载体.ppt

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1、第三章第三章基因克隆载体基因克隆载体Vectors载体载体(vector)：在基因工程中，携带目的基因或在基因工程中，携带目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。分子。一、载体的概念一、载体的概念作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内进行复制和表达的核酸分子。进行复制和表达的核酸分子。二、载体的功能二、载体的功能1、运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；2、为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。、为外源基因的

2、扩增或表达提供必要的条件。三、发展概况三、发展概况1.第一阶段（第一阶段（1977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利天然质粒和重组质粒的利用，如用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低长度），建立多克增大载体容量（降低长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。系列载体。3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T

3、7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。按载体性质分按载体性质分四、分类四、分类质粒载体、噬菌体载体和人工染色体质粒载体、噬菌体载体和人工染色体目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大类：类：一是病毒载体系统一是病毒载体系统二是质粒载体系统二是质粒载体系统（1）有复制起点）有复制起点（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点（3）具备合适的筛选标记）具备合适的筛选标记（4）具备合适的拷贝数目）具备合适的拷贝数目（5）分子量要相对较小分子量要相对较小（6）在细胞

4、内稳定性要高在细胞内稳定性要高（7）易分离纯化易分离纯化表示载体必须具备的条件表示载体必须具备的条件五、基因工程载体必须具备的条件五、基因工程载体必须具备的条件第一第一节节 质粒载体一、质粒一、质粒(plasmid)独立于细菌染色体外的独立于细菌染色体外的能独立复制的双链闭合能独立复制的双链闭合环状环状DNA分子分子细菌细菌中发现，偶见于中发现，偶见于链霉菌和酵母链霉菌和酵母比病毒还简单的亚细比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。主细胞则无法繁殖。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒二、质粒的发现和命名二、质粒的发现和命名1946年，年，第一个第一个被发现的细菌质粒是

5、大肠杆菌被发现的细菌质粒是大肠杆菌的的F因子因子，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。远的影响。1957年，日本学者报道了志贺菌年，日本学者报道了志贺菌(Shigella)中中质粒介导抗生素抗性的转移现象。质粒介导抗生素抗性的转移现象。（一）质粒的发现（一）质粒的发现在以后的在以后的2020多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。范围。7070年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己

6、被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。二、质粒的发现和命名二、质粒的发现和命名（一）质粒的发现（一）质粒的发现（二）质粒的命名原则（二）质粒的命名原则 质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。移性或亲和性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特最初发现的质粒均

7、由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如征自行命名，如F因子因子(fertility factor，致育因子致育因子)、R质粒质粒(resistance factor，抗性质粒抗性质粒)和和Col质粒质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒大肠杆菌毒素质粒)等。等。随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏粒的微生物新类群和新质粒被发现，但由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。其规则是：其规则是：质粒的名称一般由质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成三个英文字

8、母及编号组成，第一，第一个字母一律用小写个字母一律用小写p表示表示，后两个字母应大写，可以，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如质粒，如pBR322、pUC18和和pUC19等。等。直至直至1976年年Novick等才提出一个可为质粒研究者等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。普遍接受和遵循的命名原则。（二）质粒的命名原则（二）质粒的命名原则 命名举例命名举例pBR322是最早构建的质

9、粒之一是最早构建的质粒之一“p”表明它是一个质粒表明它是一个质粒“BR”表示最初构建它的两个人的名字首字母：表示最初构建它的两个人的名字首字母：Bolivar和和Rodriguez“322”区别于该实验室构建的其他质粒，如区别于该实验室构建的其他质粒，如pBR325、pBR327等等三、质粒的基本特性三、质粒的基本特性（1）质粒分子较小）质粒分子较小一般为一般为1-200Kb，最大的可达最大的可达1400kb(如苜如苜蓿根瘤菌质粒蓿根瘤菌质粒pRm141a)。（2）编码特性）编码特性表型多样化表型多样化如抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机如抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生

10、毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫合成限制性内切酶或修饰酶、生物固氮和杀虫等。等。3、质粒的存在形式、质粒的存在形式体外理化因子作用下可形成下列形式体外理化因子作用下可形成下列形式l开环开环DNA分子分子(oc-DNA)线性线性DNA分子分子(l-DNA)超螺旋超螺旋DNA分子分子(scDNA)生理条件下：以共价闭合环状生理条件下：以共价闭合环状DNA分子分子(Covalentclosecircular,ccc-DNA)形式存在形式存在三、三、质粒的基本特性质粒的基本特性在变性条件下，质粒可成为单链在变性条件下，质粒

11、可成为单链DNA分子分子（ss-DNA）。）。同一质粒尽管分子同一质粒尽管分子量相同，不同的构量相同，不同的构型电泳迁移率不同：型电泳迁移率不同：scDNA最快、最快、lDNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。（4）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率三、质粒的基本特性三、质粒的基本特性（5）自主复制性）自主复制性 携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制而自主复制 （6）不相容性）不相容性 同一复制系统的不同质粒在同一细菌中同一复制系统的不同质粒在同一细菌中不能

12、相不能相容，容，不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存不同复制系统的质粒在同一细菌中可共存（7）可扩增性）可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类质粒就其复制方式而言分为两类 松弛型复制松弛型复制 严谨型复制严谨型复制（8）可转移性）可转移性 在天然条件下，大多质粒可通过细菌在天然条件下，大多质粒可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内。种宿主内。非结合细菌可通过人工方法进行转化非结合细菌可通过人工方法进行转化（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好友好”的的“借居借居”在宿主细胞中，在宿主细胞中，既不杀伤细胞

13、，对宿主的代谢活动也无影响，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。宿主离开质粒照样的生存下去。（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿作为对宿主细胞的补偿（主细胞的补偿（“交房租交房租”）。）。（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），酶），使宿主获得生存优

14、势，与我们基因工程实验紧密相关使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因。的，如抗生素抗性基因。四、质粒与宿主细胞的关系四、质粒与宿主细胞的关系五、质粒载体的构建五、质粒载体的构建（一）为什么要进行质粒载体的构建？（一）为什么要进行质粒载体的构建？天然质粒载体具有一定的缺陷天然质粒载体具有一定的缺陷天然存在的野生型质粒由于天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，等缺陷，不能满足基因工程中克隆载体的要求，因此往不能满足基因工程中克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行

15、人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。方法：方法：重组，重组，“拼拼接接，挖肉补疮拼拼接接，挖肉补疮”（1）pSC101，第一个用于基因克隆的天然质粒，第一个用于基因克隆的天然质粒，分子长分子长9.1kb。但只有一个。但只有一个EcoRI切点充当克隆切点充当克隆位点，位点，Tetr作为筛选标志。作为筛选标志。分子量大，拷贝数低分子量大，拷贝数低（2）ColE1质粒质粒筛选标志不理想筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。）。colicinE1能杀死不含能杀死不含ColE1质粒的菌，形成质粒的菌，形成“噬噬菌斑菌斑”。

16、唯一的克隆位点唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗突变出抗colicinE1的细胞的细胞.（二）构建质粒克隆载体的基本策略（二）构建质粒克隆载体的基本策略1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。较多的拷贝。2、含有尽可能多的克隆位点。、含有尽可能多的克隆位点。3、含有供选择克隆子的标记基因。、含有供选择克隆子的标记基因。4、构建的质粒克隆载体、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。分子尽可能小。5、根据特殊需要

17、，使构建的质粒克隆载体中组装、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种各种“元件元件”（小（小DNA片断），构建成不同用途的片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。质粒克隆载体。五、质粒载体的构建五、质粒载体的构建（三）质粒克隆载体的设计和构建过程的原则（三）质粒克隆载体的设计和构建过程的原则选择合适的出发质粒（亲本质粒）。选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过

18、程力求简单。的构建过程力求简单。四、常见的人工构建的质粒载体四、常见的人工构建的质粒载体pBR322是是F.Bolivar和和R.L.Rodriguez于于20世纪世纪70年代后期构建出来的，也是第一年代后期构建出来的，也是第一个经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌个经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用广泛。现在已经被许多更质粒载体，应用广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。优良的新型克隆载体所替代。（一）（一）pBR322系列系列pBR322的结构的结构pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因（1）元件来源）元件来源 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来

19、源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。个克隆位点。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载

20、体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡加入氯霉素之后，每个细胞可达加入氯霉素之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb的的DN

21、A在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片断，既除去片断，既除去了了mob识别位点，又增加质粒的拷贝识别位点，又增加质粒的拷贝数。数。（7）PBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉酶切片断（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点。位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。改造改

22、造EcoR I 位点位点（二）（二）pUC系列系列University of California的的J.Messing和和J.Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成。属正选择载体。造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19pUC18/19的结构的结构复制起点：复制起点：来自来自pBR322质粒。质粒。Ampr基因：基因：来自来自pBR322质粒质粒lacZ的启动子：的启动子：来自大肠杆菌来自大肠杆菌lacZ基因基因：大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的-肽链肽链序列，序列，是是LacZ的氨基端片断的氨基端片断

23、多克隆位点：多克隆位点：10个连续的单酶切位个连续的单酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。pUC18/19的结构的结构pUC18/19质粒载体的优点质粒载体的优点更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。选择方便：选择方便：X-gal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。克隆便利：克隆便利：具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。测序方便：测序方便：pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源完全相同，

24、便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序。载体上测序。选择原理选择原理Ampicillin抗性和抗性和lacZ的的 肽互补（蓝白斑）相肽互补（蓝白斑）相结合。结合。蓝白斑筛选蓝白斑筛选X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）是是-半乳糖苷酶的作用底物半乳糖苷酶的作用底物-半乳糖苷酶作用于半乳糖苷酶作用于X-gal显色反应显色反应-半乳糖苷酶能把无色的化合物半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成分解成半乳糖和一个深蓝色的物质半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝诱导物：诱导物：IPTGIPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的

25、类似物。能诱导lac操纵子的启动操纵子的启动转录，使转录，使受体菌基因组中的受体菌基因组中的lacZ的的C端部分端部分和和载载体的体的lacZ 肽肽都表达，从而互补。都表达，从而互补。但载体但载体MCS上插入外源上插入外源DNA后，不能产生后，不能产生 肽！肽！lacZ的的 肽互补肽互补-肽（肽（lacZ基因编码）：基因编码）：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端端的一段氨基酸片断（的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。氨基酸）。lacZ只有在只有在4聚体的状态下才有功能。聚体的状态下才有功能。pUC质粒质粒载体上的载体上的lacZ编码的编码的 肽肽与这个缺与这个缺失突变的失突变的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶

26、“互补互补”，使它能形成，使它能形成4聚体，又能分解聚体，又能分解X-gal，产生蓝色物质。，产生蓝色物质。质粒克隆载体引入与质粒克隆载体引入与lacZ互补的互补的E.coli，在含，在含IPTG和和X-gal的诱导培养基中，的诱导培养基中，菌落呈蓝色菌落呈蓝色。如果在如果在MCS区插入一个外源片断，就会使区插入一个外源片断，就会使lacZ基基因失活，引入因失活，引入lacZ互补的互补的E.coli，肽不能生成，肽不能生成，就无所谓互补，就无所谓互补，在含在含IPTG和和X-gal的诱导培养基的诱导培养基中中X-gal不会被降解，不会被降解，菌落呈白色菌落呈白色。IPTG诱导的结果：蓝白斑筛选

27、诱导的结果：蓝白斑筛选MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑有插入时，不互补，白菌斑通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNA插入。插入。IPTG诱导的结果诱导的结果（三）（三）农杆菌农杆菌Ti质粒表达载体质粒表达载体Ti（tumor-inducingplasmid）质粒：）质粒：根癌农根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段质粒中有一段DNA，称为，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合到植物基因组中，并导致

28、），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤冠瘿瘤的形成。大小因种类而异，在的形成。大小因种类而异，在200-250kb之间。之间。章鱼碱型章鱼碱型农杆碱型农杆碱型农杆菌素型农杆菌素型琥珀碱型琥珀碱型Ti质粒分为质粒分为4个功能区个功能区l T-DNA区区：是根癌农杆菌侵染植物细胞时从是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒质粒上切割下来转移到植物细胞的一段上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码，含有编码植物激素和冠瘿碱植物激素和冠瘿碱的基因的基因 Vir区：区：Vir区上的基因能激活区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌转移，使根癌农杆菌表现出毒性农杆菌表现出毒性 Con区：区：该区段上

29、存在与细菌间接合转移的有关基该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移 Ori区：区：Ori区上的基因调控区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。质粒的自我复制。TiPlasmidT-DNA 区LeftborderRightbordervir区区Ori区区Con区区T-DNA区区Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb。能转移到。能转移到植物细胞内的植物细胞内的DNA片断称为片断称为T-DNA（transfer-DNA）T-DNA左右两端边界各有一个左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列长的正

30、向重复序列(左左边界，右边界边界，右边界)，在不同，在不同Ti质粒中高度保守。质粒中高度保守。边界序列边界序列对对T-DNA转移和整合不可缺少转移和整合不可缺少；已证实；已证实只要保只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中换，仍可转移整合到植物基因组中Ti质粒遗传转化的理质粒遗传转化的理论依据。论依据。T-DNA进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整进入植物细胞后，能以单拷贝或多拷贝形式随机整合到染色体合到染色体DNA上。且上。且T-DNA上的基因能被植物转录系统上的基因能被植物转录系统识别，

31、进行转录。识别，进行转录。在在T-DNA区已鉴定出多种基因区已鉴定出多种基因章鱼碱合成基因（章鱼碱合成基因（ocs）或胭脂碱合成基因）或胭脂碱合成基因（nos）或其他胭脂碱合成基因。）或其他胭脂碱合成基因。细胞分裂素合成基因细胞分裂素合成基因位点位点Shi和和控制植物生长素控制植物生长素合成的基因合成的基因位点位点Roi。在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内在两种基因表达产物的共同作用下，破坏植物内源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发源激素的平衡，干扰植物细胞的正常分裂，引发植物产生肿瘤。植物产生肿瘤。Vir 区区Ti 质粒质粒T-DNA上游的一组基因，表达产物可激上游的一组基因，

32、表达产物可激活活T-DNA向植物细胞转移，引发肿瘤，显示致病向植物细胞转移，引发肿瘤，显示致病性。性。Con区区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因，受宿主含有与农杆菌之间接合转移有关的基因，受宿主合成的冠瘿碱激活，使合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌间转移。质粒在细菌间转移。Ori区区调控调控Ti质粒的自我复制质粒的自我复制Ti质粒介导转化的过程质粒介导转化的过程根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对植物信号物质的感受根癌农杆菌对植物信号物质的感受根癌农杆菌根癌农杆菌TiTi质粒上的质粒上的virvir基因以及染色体上操纵基因以及染色体上操纵子的活化子的活

33、化 virvir区基因被激活，区基因被激活，virDvirD基因编码的核酸内切酶基因编码的核酸内切酶分别将分别将T-DNAT-DNA的的RBRB序列和序列和LBLB序列切出单链切口，序列切出单链切口，释释放出放出T-DNAT-DNA的单链线性拷贝，的单链线性拷贝，T-DNAT-DNA复合体的产生复合体的产生T-DNAT-DNA复合体复合体在在RB序列的引导序列的引导下定向地穿过农杆下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到到植物的染色体基因组中植物的染色体基因组中TiTi质粒介导转化植物细胞示意图质粒介导转化植物细胞示意图天然的基因工程天

34、然的基因工程天然的基因工程天然的基因工程1、Ti质粒是质粒是一种天然的质粒表达载体，一种天然的质粒表达载体，外源外源基因组装在基因组装在T-DNA上，有可能引入植物细上，有可能引入植物细胞。胞。2、转基因的细胞只能分裂，而不能分化成植、转基因的细胞只能分裂，而不能分化成植株，不能达到选育转基因植物的目的。株，不能达到选育转基因植物的目的。3、通过改造、通过改造T-DNA，构建了一系列，构建了一系列Ti质粒表质粒表达载体。达载体。Ti质粒本身存在的缺陷质粒本身存在的缺陷转化细胞在生长过程中会产生转化细胞在生长过程中会产生植物激素植物激素，从而破坏，从而破坏受体激素的平衡，阻碍转化细胞的再生，因此

35、需将受体激素的平衡，阻碍转化细胞的再生，因此需将参与合成植物生长素和细胞分裂素的基因剔除参与合成植物生长素和细胞分裂素的基因剔除冠瘿碱合成基因冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大，因此也可对转基因植物意义不大，因此也可删除删除TiTi质粒质粒分子量过大分子量过大（200200800kb800kb），小一些利于操），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段作，因此可除去不必要的大片段DNADNA需加入大肠杆菌需加入大肠杆菌复制起始位点复制起始位点，以利于在大肠杆菌，以利于在大肠杆菌中的操作和保存中的操作和保存pCAMBIA1300图谱图谱潮霉素抗性潮霉素抗性基因基因左边界左边界右边界右边界复制起点

36、复制起点卡那霉素抗卡那霉素抗性基因性基因穿梭质粒载体穿梭质粒载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。载体。常用的穿梭质粒载体常用的穿梭质粒载体 大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体穿梭质粒穿梭质粒 能在两种不同的生物能在两种不同的生物中复制的载体。例如中复制的载体。例如既能在原核生物既能在原核生物(如大如大肠杆菌肠杆菌)中复制，又能中复制，又能在真

37、核细胞在真核细胞(如酵母如酵母)中复制的载体。中复制的载体。很多很多酵母菌的穿梭载体，酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的鉴定真核生物基因的研究研究 穿梭载体的优点穿梭载体的优点利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。哺乳动物细胞等）进行基因表达。可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。转移基因。TA克隆载体（克隆载体（T载体）载体）由由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，用

38、于公司发展而来的商业性试剂盒，用于PCR产物的克隆和测序。产物的克隆和测序。原理：原理：利用利用Taq酶能够在酶能够在PCR产物的产物的3末端加上一个非模末端加上一个非模板依赖的板依赖的A，而，而T载体是一种带有载体是一种带有3T突出端的载体，在突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物产物直直接插入到质粒载体的多克隆位点（接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。）中。优点：优点：操作最简单，快速和高效，是操作最简单，快速和高效，是Taq聚合酶聚合酶PCR产物产物的最佳克隆方法的最佳克隆方法TA克隆的优点克隆的优点不需使用含限制酶序

39、列的引物不需使用含限制酶序列的引物不需把不需把PCR产物做平端处理产物做平端处理不需在不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。进行克隆。注意事项注意事项1.要获得目的基因的要获得目的基因的TA克隆，克隆，PCR产物的产物的特异性要好。特异性要好。2.PCR产物在产物在TA克隆前要通过纯化。克隆前要通过纯化。3.在在PCR产物回收、纯化过程中防止外来产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。污染。pMD18-T图谱图谱pSK-T载体图谱载体图谱pSK-Tvector两侧的两侧的3端，具有端，具有突出的碱基突出的碱基T，可以和可以和PCR产物产物3末端的末端的A碱基

40、互补，从而大大碱基互补，从而大大提高提高PCR产物的连接、克隆效率。产物的连接、克隆效率。可通过可通过互补的颜色反应来筛选互补的颜色反应来筛选重组子重组子33pUC18-T克隆载体图谱克隆载体图谱pUCm-T克隆载体图谱克隆载体图谱多功能质粒载体多功能质粒载体载体具有多种功能，根据需要载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。基因表达等方面的基因操作。pGEM系列质粒载体就是一类系列质粒载体就是一类多功能载体，如：多功能载体，如：pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM4Z、pSP64、pSP65、pGEM3Zf。pGE

41、M系列载体系列载体 pGEM系列载体是一种与系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分系列十分类似的小分子的质粒载体。子的质粒载体。在其总长度为在其总长度为2743bp的基因组的基因组DNA中，编码有一个中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。列的多克隆位点。此序列结构几乎与此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。克隆载体的完全一样。pGEM3Z载体载体pGEM3Z与与pUC载体非常相似载体非常相似，其不同点：，其不同点：pGEM3Z含有两段额外的短

42、的含有两段额外的短的DNA片段，每一片段，每一段可以作为段可以作为RNA聚合酶的识别位点。聚合酶的识别位点。这两段启动子（噬菌体这两段启动子（噬菌体SP6T7)存在于限制性内存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载载体中加入体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。聚合酶，可以发生转录。合成的合成的RNA可以作为探针使用，或者研究可以作为探针使用，或者研究RNA的的加工过程或者蛋白质的合成。加工过程或者蛋白质的合成。1、克隆载体，全长、克隆载体，全长3.19kb，具有，具有Amp抗性基因和抗性基因和复制起始点复制起始点2、MCS两侧有两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子-可可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点位点3、MCS为于为于lacZ基因内部（插入失活）基因内部（插入失活）蓝白蓝白斑筛选斑筛选4、引入丝状噬菌体、引入丝状噬菌体f1(+)复制起始点复制起始点-可以产生可以产生单链单链DNA，并分泌至上清中，并分泌至上清中，