实验室标准操作规程SOP.pdf

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1、实验室标准操作程序（SOP）版版号：第一版号：第一版编编制：制：审审核：核：批批准：准：受控状态：受控状态：发放编号：发放编号：持持 有有 人：人：发布日期发布日期: 2007: 2007 年年 0808 月月 0808 日日实施日期实施日期: 2007: 2007 年年 0808 月月 0808 日日更 改 一 览 表实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 2 页 共 31 页序号更改时间更改章节号更改单号备 注00.00.目录章节页数标题烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01

2、第 3 页 共 31 页0102030405060708091011细菌总数的检验大肠菌群、大肠杆菌的检验金黄色葡萄球菌的检验沙门氏菌的检验副溶血性弧菌的检验霍乱弧菌的检验单核细胞增生李斯特氏菌的检验志贺氏菌的检验霉菌的检验表面样品的检验水的检验45567891011121301.01. 出口食品细菌总数的检验方法出口食品细菌总数的检验方法1.仪器和设备11 恒温培养箱：361烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 4 页 共 31 页12 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 均质器1. 5 冰箱：0-4和-15-

3、2016 试管:18150mm17 锥形瓶:500ml 250ml18 平皿：直径为 90mm19 灭菌吸管110 灭菌均质杯111 酒精棉112 天平:感量 0.1g2培养基的制备2.1生理盐水:称氯化钠 8.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸 9ml， 121高压灭菌。2.2 平板计数琼脂称平板计数琼脂 23.5g 加入 1000.0ml 蒸馏水中，煮沸溶解，分装锥形瓶内，121高压灭菌。3.操作程序3.1 样品稀释以无菌操作取 25g 样品放入装有 225ml 生理盐水的灭菌均质杯内，均质 1 分 30 秒，制成 1：10 的样品匀液用灭菌吸管吸取 1ml

4、 样液放入 9ml 生理盐水中，摇匀。从试管中吸取 1ml 样液分别注入两个平皿内，制成 10 倍的样品稀释液，依次类推（10-2、10-3）平板计数琼脂（恒温 451）分别倒 12-15ml 平板计数琼脂入各平皿待琼脂凝固后将平皿翻转立即将平皿内的样液和琼脂充分混合将平皿旋转，注意倾注时间不宜太长立即放进 361的恒温培养箱内培养 482h3.2 培养4.计算如下表（备注：25-250 个菌落为合适范围，菌落成链状明显的计为一个菌落，不明显的不计数，平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的，即报告为蔓延菌落。 ）烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验

5、室标准操作程序XH2-019-01第 5 页 共 31 页样品号12345678910菌落数1：101：1001：100023816021218023626022728018001440多不可计24523多不可计27820000000多不可计25521多不可计22540多不可计21018多不可计24028多不可计26030多不可计23028多不可计多不可计523多不可计多不可计487多不可计24535多不可计230蔓延菌落平皿菌落数2.3103个/g2.5103个/g1.6102个/g2.6104个/g10 个/g2.7104个/g2.3104个/g2.7104个/g5.1105个/g2.91

6、04个/g烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 6 页 共 31 页02.02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1 仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴箱：44.5113 高压灭菌锅14 均质器15 试管:18150mm、18180mm16 锥形瓶:500ml 250ml17 平皿：直径为 90mm18 灭菌均质杯19 灭菌吸管110 酒精棉111 天平：感量 0.1g1.12 冰箱：0-4和-15-201.13 显微镜2培养基的制备2.1 月桂

7、基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤称 35.6g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中， 加热煮沸充分溶解， 分装于有倒立的小发酵管的18180mm 试管中，每管 10ml，于 121高压灭菌 15min。2.2 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）称 40g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18180mm 试管中，每管 10ml，121高压灭菌 15min。2.3EC 肉汤称 37g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18180mm 试管中，每管吸 8ml，121高压灭菌 15min。2.4 伊红美蓝琼脂（EMB）称 37

8、.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶， 121高压灭菌 15min。摇匀冷却至 45倾注平皿。2.5 营养琼脂称 33g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中， 加热煮沸充分溶解， 121高压灭菌 15min。 制成斜面备用。2.6 生理盐水称氯化钠 8.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，分装锥形瓶和 18150mm 试管内，121高压灭菌 15min。2.7 成品生化管2.7.1 色氨酸肉汤 2.7.2 MR-VP 2.7.3 Koser氏枸橼酸盐琼脂 2.7.4 革兰氏染色试剂盒 2.7.5 Kovacs氏靛基质试剂 2.7.6 甲基红指示剂 2.7

9、.7 V-P 试剂甲液和乙液3.操作步骤3.1 样品的稀释和培养放入装有225ml生理均质 1 分 30 秒，制用灭菌吸管吸取 1ml以无菌操作取25g样盐水的无菌均质杯成 1：10 的样品匀液均质好的样液品烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 7 页 共 31 页放入 9ml 生理盐水中，摇匀前3支LST中分别注入 1ml均质好的先注入另一支9ml生理盐水中摇匀作为十倍的连续稀释度的样品稀从9ml生理盐水中吸取 1ml 稀释液，接着吸取1ml样品稀释液分别注入中间 3 支LST 中，作为百倍的连续稀释度的稀释液再从

10、9ml生理盐水中吸取 1ml 稀释液分 别 注 入 后 三 支LST 中作为千倍的连续稀释度的稀释液将LST放入361培养箱培养 482h3.2 大肠菌群的测定培养后观察导管内是否有气泡产生未产气报告为阴性 ,产气者进一步实验将所有产气管用接种环接到 BGLB 中3.3 大肠杆菌的测定放入 361培养箱培养 482h查 MPN 表报告大肠菌群的 MPN 值同时将所有 LST 培养物接种到 EC 肉汤放入 44.51的水浴箱内培养 482h注意水浴箱的水面应高于肉汤管液面如产气将培养物接种于 EMB 平板放入 361培养箱培养 482h未产气报告阴性查MPN 表观察平板有无黑色中心、有无光泽菌落

11、如有菌落挑两个典型的接种营养斜面361培养 1824h3.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。3.4.1加 kovacs 氏靛基质上层出现红色为阳色氨酸肉汤 361两滴性反应培养 242h 后3.4.2无菌操作移取培养加 5-萘酚乙醇40KOH溶液0.2mlMR-VP 培养基 36物1ml至灭菌试管中溶液 0.6ml，和少许肌酸结晶1培养 482h烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 8 页 共 31 页振摇试管后静置 2 h剩余 MR-VP 再培养如变红为阳性，变黄出现红色为阳性48h 滴加 5d 甲基

12、红为阴性3.4.3Koser 氏枸橼酸盐琼361培养 96h 记脂录有无生长3.4.4革兰氏染色取 18h 斜面培养物大肠杆菌为革兰作革兰氏染色氏阴性3.4.5 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质MRVP枸橼酸盐鉴定（型别）典型大肠杆菌非典型大肠杆菌3.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为或，再根据 LST 肉汤阳性管数查 MPN 表，报告每克样品中大肠杆菌MPN 值。1g 样品中最近似值(MPN)表使用三管法,接种量分别为 0.1g,0.01g,0.001g阳性管数0.10.010.001MPN阳性管数0.10.010.001MPN00020

13、09.130013201140026202200039203260103210150116.1211200129.22122701312213340206.2220210219.322128022122223502316223420309.4230290311323136032162324403319233531003.6300231017.230139102113026410315303951107.3310431111131175烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 9 页 共 31 页1111111111112

14、22233332301230123151911152024162024293333333333112222333323012301231201609315021029024046011001100备注： 1.上表采用 3 个稀释度（0.1g、0.01g 和 0.001g）每个稀释度3 管。 2.如检样量改用1g、 0.1g和0.01g时， 表内数字相应降低10倍； 如改位0.01g、 0.001g和0.0001g时，表内数字相应增加 10 倍，其余类推。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 10

15、页 共 31 页03.03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 均质器15 试管:18150mm 18180mm16 锥形瓶:500ml 250ml17 平皿：直径为 90mm18 灭菌吸管19 灭菌均质杯110 酒精棉111 天平:感量 0.1g112 冰箱：0-4和-15-202培养基的制备2.1 生理盐水称氯化钠 8.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，分装锥形瓶和18150mm 试管内，每管吸9ml,121高压灭菌15min。2.2 胰蛋白胨大豆肉汤称大豆肉汤 30

16、g 和氯化钠 95g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18180mm 试管内，每管吸 10ml,121高压灭菌 15min。2.3Baird-parker 培养基称 6.3g 溶于 95ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内， 121高压灭菌 15min。冷却至50，加入 1 瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml 无菌生理盐水溶解）混匀。倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱 0-4。2.4 普通肉汤培养基称 18g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装 18180mm 试管，每管吸 10ml，121高压灭菌 15min。2.5 冻干血浆（凝固酶

17、试验）每支安瓶中加入 0.5ml 灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入0.3ml 待检液，于376 h 培养，观察判定结果。3.操作步骤3.1 样品的稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯均质 1 分 30 秒，制成 1：10 的样品匀液用灭菌吸管吸取 1ml均质好的样液先放入 9ml 生理盐前 3 支大豆肉汤分作为十倍的连续稀水中，摇匀释度的样品稀释液别吸 1ml 均质好的烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 11 页 共 31 页从 9ml 生理盐水中先注入另一支 9ml接着吸取 1m

18、l 样品分别注入中间 3 支吸取 1ml 稀释液，生理盐水中摇匀稀释液大豆肉汤中，作为百倍的连续稀再从9ml生理盐水中分别注入后三支大作为千倍的连续稀释度的稀释液吸取 1ml 稀释液豆肉汤中释度的稀释液放入 361培养从各管接 1 环划线放入 361培养再从每一平板上挑箱培养 482h于Baird-parker箱培养 482h取 1 个可疑菌落移种到肉汤培养基取肉汤培养物 0.3ml于灭菌试管内充分观察6h是否有凝块，中，36培养 24h和 0.5ml 凝固酶试验混合，36培养完全凝固为阳性备注：金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker 琼脂平板上呈圆形， 表面光滑、凸起、湿润，直径

19、 23mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围饶以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。 有时可见到不分解脂肪的菌株， 除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同，从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。3.2 报告结果查 MPN 表，报告金黄色葡萄球菌MPN/g。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 12 页 共 31 页04.04.出口食品沙门氏菌属的检验方法出口食品沙门氏菌属的检验方法

20、1仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 均质器1. 5 冰箱：0-4和-15-2016 试管:18150mm 12 mm100 mm17 锥形瓶:500ml 250ml18 平皿：直径为 90mm19 灭菌吸管110 灭菌均质杯111 酒精棉112 天平:感量 0.1g2培养基的制备21 亚硒酸胱氨酸增菌液（SC）称取 23g 于 1 升蒸馏水中在无菌容器中溶解，定量分装备用。22 亚硫酸铋琼脂（BS）称取 49.6g 于 1 升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55，摇匀，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，平板为橙黄色。23 胆硫乳琼脂称取

21、64.3g 于 1 升蒸馏水中，浸泡15 分钟，煮沸至完全溶解，冷却至55，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，新制备的培养基为玉白色不透明，24 三糖铁（TSI）称取 65g 于 1 升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm100 mm，每管约 24ml，11515分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。25 尿素酶琼脂基础（U）称取 2.21g 于 95ml 蒸馏水中， 加热煮沸至完全溶解， 12115 分钟高压灭菌， 冷却至 55灭菌加入 40尿素溶液 5ml，混匀，分装灭菌试管12 mm100 mm，每管 23ml， 制成斜面备用。实验与判断：大量接种于 37培养 242

22、h，强阳性反应为深红色，弱阳性为粉红色，阴性为黄色或不变色。26 赖氨酸脱羧酶培养基（LD）称取 1.9g 于 100ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm100 mm，每管11.5ml， ，12115 分钟高压灭菌备用。试验与判断：大量接种于37培养 242h，阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。27 吲哚培养基（I）称取 1.6g 于 100ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm100 mm，每管 11.5ml，12115 分钟高压灭菌。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 13 页

23、共 31 页271 试验接种于 37培养 242h，滴加柯凡克试剂 0.1ml。272 判断阳性反应出现红色环；阴性为黄棕色环。28V-P半固体琼脂（VP）生化管试验：接种后于 37培养 242h，将甲液 0.2ml(约 6 滴)加入试管中，摇匀，再加乙液 0.1ml（约 3 滴） ，再摇匀。判断：阳性反应立即或在15min 内呈现红色，阴性为铜色。阴性结果在1h 后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。29 丙二酸钠生化管（M）试验与判断：接种大量幼嫩试菌，于 37培养 242h，阳性反应为普蓝色；阴性不变色。210 卫矛醇半固体（D）试验与判断：穿刺接种待试菌，于

24、37培养 242h，阳性反应为黄色阴性不变色3操作程序3.1 分离培养在装有225ml无菌水于 37培养 242h划线接种BS和DHL再加入 25g 样品（无中加上 5.2gSC琼脂平板各一个菌操作）于 37培养 24每个平板至少挑取分别接种 LD 和 U接种后不须灭菌接48h管，种针， 直接接种TSI2 个典型或可疑菌于 37培养 242h挑取菌落后的琼脂至少保留 24h，以备平板,应置于 48必要时复查。沙门氏菌落特征琼脂平板BS 琼脂DHL 琼脂沙门氏菌落特征棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，有些菌株呈灰绿色，周围培养基不变或微变暗无色半透明有黑色中心或几乎全为

25、黑色，有些菌株无色半透明32 按下表进行试验与判断：TSI 和 LD 培养基筛选产气初步判断可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属非沙门氏菌属非沙门氏菌属TSI 琼脂斜面KKAK底层AAAK硫化氢（）（）（）/LD 培养基/（）（）（）/注：K产碱；阳性反应； （）少见反应；A产酸；阴性反应；/阳性或阴性反应。TSI 和 U 琼脂筛选TSI 琼脂斜面底层产气硫化氢初步判断U 琼脂烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 14 页 共 31 页KKAKAAAK（）（）（）/（）（）（）/可疑沙门氏菌属非沙门氏菌属非沙门氏菌属非沙门氏

26、菌属注：K产碱；阳性反应； （）少见反应；A产酸；阴性反应；/阳性或阴性反应。4生化试验41 将符合可疑沙门氏菌属特征的TSI 琼脂培养物，按下表进行生化试验。序号123456生化项目U 试验V-P试验LD 试验吲哚试验丙二酸钠试验卫矛醇试验沙门氏反应d注：阳性反应；阴性反应；d反应不定。42 所有生化试管均于 37培养 242h。43 生化试管结果符合沙门氏菌属特性按血清学试验进行。44 血清学试验441 检查培养物有无自凝性在洁净的玻片上加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的 浑浊悬液，将玻片轻轻摇动 3060s，在黑色背景下观察反应（最好用放大镜观察） 。如菌体彼

27、此相凝集成明显或比较显小颗粒状物，即认为有自凝性，反之无自凝性。442 检查“O”抗原对无自凝性的培物，按 3.4.1 的程度进行试验,但以多价“O”血清代替生理盐水,在 2min 判断结果.如为阳性结果以单价“O”血清进行分群试验.如为阴性结果,必要时,可结合生化试验结果按“Vi”抗原进行试验,再以多价和单价“O”血清进行试验.443 检查“Vi”抗原按 3.4.1 的程序进行,但以“Vi” 血清代替生理盐水。5报告结果：51 报告阳性结果：发现沙门氏菌。52 报告阴性结果：未发现沙门氏菌。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-0

28、19-01XH2-019-01第 15 页 共 31 页06.06.出口食品霍乱弧菌的检验方法出口食品霍乱弧菌的检验方法1仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 拍打式均质器15 菌落计数器16 试管:18150mm 12 mm100 mm17 锥形瓶:500ml 250ml18 平皿：直径为 90mm19 灭菌盒和枪头110 灭菌袋111 酒精棉112 天平:感量 0.1g1.13 冰箱：0-4和-15-202培养基的制备21 碱性蛋白胨水称取 15g 干粉于 1000.0ml 蒸馏水中，加热溶解，分装，12110min 高压灭菌。22 硫代硫酸钠、柠

29、檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）称取 89.1g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至 55倾注平板备用。23 三糖铁（TSI）称取 65g 于 1 升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm100 mm，每管约 24ml，11515分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。24 霍乱双糖铁琼脂（KIA）称取 64.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热溶解，分装。12115 分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。25T1N1琼脂称取 35g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，12115 分钟高压灭菌。倾注平板备用。在上项成分中改变氯化钠的含量

30、，去除琼脂可制成T1N0和 T1N3肉汤。26 精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）称取 58g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，12115 分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。27 O/F 实验用培养基（HLGB）称取 45.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中， 加热煮沸至完全溶解， 分装， 每管 3ml （有的加矿物油覆盖） 121烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 16 页 共 31 页15 分钟高压灭菌备用。28 赖氨酸脱羧酶肉汤生化管29MR-VP 肉汤生化管3.1 样品的分离培养和

31、初步鉴定:均质 1 分 30 秒，制成 1：10 的样品匀液用灭菌枪头吸取 1ml均质好的样液以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌袋内，361培养 1824h接种 TCBS 琼脂,36划线接种于T1N1琼脂放入9ml碱性蛋白胨1培养 1218h361培养 1218h水中以无菌白色滤纸沾滴加氧化酶试剂进用接种环取氧化酶0.5去氧胆酸钠液T1N1琼脂表面培养物行氧化酶试验阳性培养物滴中进行粘丝试验以接种针取氧化酶接种 TSI 、KIA 和穿刺底层并划线斜在取氧化酶和粘丝和粘丝试验阳性物AGS，面试验阳性培养物接种 T1N0和 T1N3肉将 TSI 、 KIA、 AGS、于36 1

32、 培 养1824h汤T1N0、T1N3肉汤注： 霍乱弧菌菌落特征形状大， 光滑， 黄色， 稍平， 具有不透明中心和半透明的边缘。霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应斜面霍乱弧菌KIA底层斜面A(K少见)底层AT1N0T1N3TSI斜面A底层a注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。霍乱菌属细菌在 TSI、 KIA、 AGS 中不产 H2S， 也不产气。 一些气单胞菌属菌株可能产气。32 确认试验以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T1N3培养物，分别接种到以下培养基：Hugh-Leifson 葡萄糖肉汤（HLGB） ，361培养 1824h。ONPG 胨水，361培养 1h3h 或 24h。赖氨酸脱羧

33、酶肉汤，361培养 2496h。阿拉伯糖肉汤，361培养 24h。O/129 试验用培养基，361培养 1824h。霍乱弧菌的生化反应表生化项目TCBS生化性状Y生化项目D-甘露糖生化性状烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 17 页 共 31 页AGSNacl 03681042生长蔗糖D-纤维二糖乳糖阿拉伯糖Ka氧化酶 ONPGV-P精氨酸双水解酶赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶抑菌试验10ugO/129150 ugO/129明胶酶尿素酶vSS注：Y-黄色；K-碱性；-80或更多的菌株阳性；-80或更多的菌株阴性；v-依据

34、种或菌株的可变反应；S-敏感；AGS-精氨酸-葡萄糖斜面。所有试验均不产 H2S 和气体。4血清学凝集试验41 自分离培养基上挑取可疑菌落与 O1群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在 10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。5 报告结果霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；TSI：斜面产酸/底层产酸，不产气，不产H2S；Hugh-Leifson 试验：葡萄糖发酵阳性；氧化酶：阳性；精氨酸脱羧酶试验：阴性；赖氨酸脱羧酶试验：阳性；42生长：阳性；嗜盐性试验：0Nacl(有的非 O1群霍乱弧菌不生长)3Nacl6

35、Nacl蔗糖发酵：阳性；ONPG 试验：阳性；阿拉伯糖发酵：阴性O/129 抑菌试验：10ug 敏感；150ug 敏感；血清学试验：O1群、O139 群、非 O1群。最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血清群别、血清型别和生物型别。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 18 页 共 31 页口07.07.出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法1仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 均质器1. 5 冰箱：0-4和

36、-15-2016 试管:18150mm 12 mm100 mm17 锥形瓶:500ml 250ml18 平皿：直径为 90mm19 灭菌吸管110 灭菌均质杯111 酒精棉112 天平:感量 0.1g2培养基的制备21 含 0.6酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）称取 3.6g 药品溶入 100ml 蒸馏水中， 水浴加热 30min， 分装试管， 121高压灭菌 15min， 冷却后 04冰箱保存备用。2.2 含 0.6酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）称取 4.7g 药品溶入 100ml 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，冷却50左右倒平板，待琼脂凝固后，放入 04冰箱保存备用。

37、2.3 Fraser 肉汤增菌液（FB1、FB2）FB1：称取12.38g 药品溶入 225ml 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，冷却至50左右加入 FB1添加剂1 和添加剂 2 各 1 支备用。FB2：称取 1.1g 药品溶入 20ml 蒸馏水中，水浴加热 30min，分装试管，121高压灭菌 15min，冷却至50左右加入 FB2添加剂 1 和添加剂 2 各 1 支备用。2.4 PALCAM 琼脂称取 6.61g 药品溶入 100ml 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，冷却至 50左右加入 PALCAM 添加剂 1和添加剂 2 各 0.4ml，倒平板，待琼脂凝固后，放入04冰箱保

38、存备用。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 19 页 共 31 页2.5 OXA 琼脂称取 5.85g 药品溶入 100ml 蒸馏水中，121高压灭菌 15min，冷却至 50左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素 E 各 1 支，倒平板，待琼脂凝固后，放入04冰箱保存备用。2.6 7羊血琼脂2.7 SIM 动力培养基称取 3.0g 药品溶入 100ml 蒸馏水中，水浴加热 30min，分装试管，121高压灭菌 15min，制成高层斜面，冷却后 04冰箱保存备用。2.8 硝酸盐培养基2.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水2.10

39、 糖发酵培养基2.11 过氧化氢酶试验3.操作程序3.1 样品的培养和分离称取 25g 样品放入吸取 1ml 培养物， 加301培养 251h301培养 251h225ml FB1培养基中入 FB1增菌液中，二次增菌前增菌32 生化鉴定取 11环划线分离于32OXA 和 PALCAM 平板典型运动镜检呈短棒杆菌，见有轻微旋转翻滚322挑取可疑菌落，接种TSA-YE 琼脂平板取菌落于载玻片上，35培养 24h用 0.85灭菌生理盐水制成悬浊液，压上盖玻片，于显微镜下观察菌落呈短杆状革兰氏阳性革兰氏染色25g 样品以无菌操作取323过氧化氢酶试验324溶血试验325蓝色菌落检验3251去菌落于洁净

40、载玻片上，将羊血琼脂平板划分为 25 个小格，转 种 典 型 菌 于TSB-YET 肉汤中，30培养 24h，每格刺种 1 个菌落，30培养 2848h，菌落呈 -型溶血环滴加1滴3的H2O2溶液，菌落呈过氧化氢酶阳性反应室温（2025）培在半固体试管内呈取培养物穿刺接种动力试验养 48h 至 7 天，典型伞状生长。SIM 半固体培养基，烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 20 页 共 31 页3252取培养物接种硝酸盐肉汤中，35培养 5 天，加入甲液 0.2ml 再加入乙液 0.2ml， 混匀，硝酸盐还原试验2

41、min 内呈红色为阳性3253MR-VP 试验加 5 -萘酚溶液0.5ml，3254出现红色为MR阳性三糖铁试验反应。3255糖发酵试验取 培 养 物 接 种MR-VP 肉汤中，35培养 48h，取1ml培养物于洁净试管中，再加入 4氢氧化钾溶液 0.2ml,摇匀，取培养物接种于三糖铁琼脂，取培养物分别接种于 0.5葡萄糖、呈红色为 VP 阳性,剩余培养物继续培养48h,加甲基红1d,35培养 5 天，斜面和底层产酸，不产硫化氢。麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，35培养 2448h,阴性继续培养到第 5天，3256结果分别是（）35培养 5 天，呈阴性反应，斜面无取培养物穿刺接种

42、尿素酶试验颜色变化。尿素酶琼脂斜面上，烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 21 页 共 31 页李斯特菌菌种鉴别特征蓝色菌菌名落单 核细胞增生李斯特氏菌绵 羊李斯特氏菌英 诺克李典型运动过氧化氢酶硝酸盐还原MR-三 糖VP铁 试试验验 /糖发酵利用葡萄糖麦芽糖七叶苷甘露醇Vb鼠李子木糖革兰氏染色溶血试验动力试验尿素酶试验产酸， 不 产H2S /产酸， 不 产H2S /产酸， 不 产H2SVb烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 22 页

43、共 31 页斯特氏菌威 尔斯李斯特氏菌西 尔李斯特氏菌格 氏李斯特氏菌 /产酸， 不 产H2SVb /产酸， 不 产H2S /产酸， 不 产H2S注：单核李斯特氏菌在OXA 和 PALCAM平板上的典型菌落呈黑色，直径2mm3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。4报告结果：报告检出或未检出单核增生李斯特氏菌。烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 23 页 共 31 页08.出口食品志贺氏菌的检验方法出口食品志贺氏菌的检验方法1仪器和设备11 恒温培养箱：36112 恒温水浴

44、箱：45113 高压灭菌锅14 均质器1. 5 冰箱：0-4和-15-2016 试管:18150mm 12 mm100 mm17 锥形瓶:500ml 250ml18 平皿：直径为 90mm19 灭菌吸管110 灭菌均质杯111 酒精棉112 天平:感量 0.1g1.13 冰箱：0-4和-15-202培养基的制备21 GN 增菌液22 HE 琼脂23 SS 琼脂24 麦康剀琼脂25 伊红美蓝琼脂26 三糖铁琼脂27 葡萄糖半固体28 半固体管29 葡萄糖胺琼脂210 尿素琼脂311 西蒙氏柠檬酸盐琼脂312 氰化钾（KCN）培养基313 氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸、及对照培养基烟台新

45、海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01第 24 页 共 31 页314 糖发酵管315 5乳糖发酵管316 蛋白胨水、靛基质试剂317 志贺氏菌属诊断血清4检验程序41 分离和培养称取 25g 样品放入于 36培养 6h8h225ml GN 增菌液取增菌液 1 环划线接种 HE 和 SS平板一个菌落呈现无色透明挑取平板上的可疑伊红美蓝平板一个，另取1环划线接种于不发酵乳糖的菌落菌落36培养 18h24h麦康凯平板或接种三糖铁琼脂和36培养 18h24h葡萄糖半固体各1管观察结果42 血清学分型和进一步的生化试验421 血清学分

46、型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果由于 K 抗原的存在而不出现凝集， 应将菌液煮沸后再检查； 如果呈现凝集， 则 A1、 A2B 群多价和 D 群血清分别试验。如系 B 群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见下表。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4 种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3 分别检查，并进一步用115 各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌312 型多价血清及各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原型和

47、亚型1a1b2a2b3a3b4a4b5a5b6X 变体Y 变体型抗原IIIIIIIIIIIIIVIVVVVI群抗原1，2，4，5，91，2，4，5，91，3，41，7，8，91，6，7，8，91，3，4，61， （3，4）1，3，4，61，3，41，5，7，91，2， （4）1，7，8，91，3，4在群因子血清中的凝集3，467，8（）（）注：凝集；不凝集； （）有或无。422 进一步的生化试验烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 25 页 共 31 页在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，

48、即：葡萄糖胺，西蒙氏柠檬酸盐。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，PH7.2 尿素，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13 型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养基均为阴性结果。 必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验， 应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。 生化反应不符合的菌株， 即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集， 仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏 6 型的生化特性与 A 群或 C群相似，见下表：志贺氏菌属四个群的生化特性生化群B

49、群：福氏志贺氏菌C 群：鲍氏志贺氏菌D 群：宋内氏志贺氏菌5乳糖/（）甘露醇棉子糖甘油（）（）d靛基质/（）/A 群：痢疾志贺氏菌注：阳性；阴性；/多数阴性， （）迟缓阳性；d 有不同生化型。43 结果报告综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。09.09. 出口食品霉菌的检验方法出口食品霉菌的检验方法1。仪器和设备11 霉菌培养箱：36112 恒温水浴箱：45113 高压灭菌锅14 均质器15 试管:18150mm16 锥形瓶:500ml 250ml17 平皿：直径为 90mm18 灭菌吸管19 灭菌均质杯110 酒精棉111 天平:感量 0.1g112 冰箱：0-4和-15-202培

50、养基的制备21 孟加拉红培养基称取 31.6g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中， 加热煮沸至完全溶解， 分装。 12120min 高压灭菌。22 生理盐水:称氯化钠 8.5g 溶于 1000.0ml 蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸 9ml， 121高压灭菌。3.操作程序3.1 样品稀释和培养以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯均质 1 分 30 秒，制成 1：10 的样品匀液用灭菌吸管吸取 1ml样液烟台新海水产食品有限公司 2007年 08 月 08 日发布第 0 次修改实验室标准操作程序XH2-019-01XH2-019-01第 26 页 共 31 页放入