二、口蹄疫防治技术规范.doc

《二、口蹄疫防治技术规范.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《二、口蹄疫防治技术规范.doc（54页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、64二、口蹄疫防治技术规范二、口蹄疫防治技术规范口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。为预防、控制和扑灭口蹄疫，依据中华人民共和国动物防疫法、重大动物疫情应急条例、 国家突发重大动物疫情应急预案等法律法规，制定本技术规范。1 1 适用范围适用范围本规范规定了口蹄疫疫情确认、疫情处置、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程序、技术标准及保障措施。本规范适用于中华人民共和国境内一切与口蹄疫防治活动有关的单位和个人。2 2 诊断诊断2.1

2、 诊断指标2.1.1 流行病学特点2.1.1.1 偶蹄动物，包括牛科动物（牛、瘤牛、水牛、牦牛）、绵羊、山羊、猪及所有野生反刍和猪科动物均易感，驼科动物（骆驼、单峰骆驼、美洲驼、美洲骆马）易感性较低。2.1.1.2 传染源主要为潜伏期感染及临床发病动物。感染动物呼出物、唾液、粪便、尿液、乳、精液及肉和副产品均可带毒。康复期动物可带毒。652.1.1.3 易感动物可通过呼吸道、消化道、生殖道和伤口感染病毒，通常以直接或间接接触（飞沫等）方式传播，或通过人或犬、蝇、蜱、鸟等动物媒介，或经车辆、器具等被污染物传播。如果环境气候适宜，病毒可随风远距离传播。2.1.2 临床症状2.1.2.1 牛呆立流涎

3、，猪卧地不起，羊跛行；2.1.2.2 唇部、舌面、齿龈、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡；2.1.2.3 发病后期，水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落，恢复期可见瘢痕、新生蹄甲；2.1.2.4 传播速度快，发病率高；成年动物死亡率低，幼畜常突然死亡且死亡率高，仔猪常成窝死亡。2.1.3 病理变化2.1.3.1 消化道可见水泡、溃疡；2.1.3.2 幼畜可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹，形色酷似虎斑。2.1.4 病原学检测2.1.4.1 间接夹心酶联免疫吸附试验，检测阳性（ELISA OIE 标准方法 附件一）；2.1.4.2 RT-PCR 试验，检测阳性（采用国家确认的方法）；2.1.4.3

4、 反向间接血凝试验（RIHA），检测阳性（附件二）；2.1.4.4 病毒分离，鉴定阳性。662.1.5 血清学检测2.1.5.1 中和试验，抗体阳性；2.1.5.2 液相阻断酶联免疫吸附试验，抗体阳性；2.1.5.3 非结构蛋白 ELISA 检测感染抗体阳性；2.1.5.4 正向间接血凝试验（IHA），抗体阳性（附件三）。2.2 结果判定2.2.1 疑似口蹄疫病例符合该病的流行病学特点和临床诊断或病理诊断指标之一，即可定为疑似口蹄疫病例。2.2.2 确诊口蹄疫病例疑似口蹄疫病例，病原学检测方法任何一项阳性，可判定为确诊口蹄疫病例；疑似口蹄疫病例，在不能获得病原学检测样本的情况下，未免疫家畜血清

5、抗体检测阳性或免疫家畜非结构蛋白抗体 ELISA 检测阳性，可判定为确诊口蹄疫病例。2.3 疫情报告任何单位和个人发现家畜上述临床异常情况的，应及时向当地动物防疫监督机构报告。动物防疫监督机构应立即按照有关规定赴现场进行核实。2.3.1 疑似疫情的报告县级动物防疫监督机构接到报告后，立即派出 2 名以上具有相关资格的防疫人员到现场进行临床和病理诊断。确认为疑似口蹄疫疫情67的，应在 2 小时内报告同级兽医行政管理部门，并逐级上报至省级动物防疫监督机构。省级动物防疫监督机构在接到报告后，1 小时内向省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构报告。诊断为疑似口蹄疫病例时，采集病料（附件四），并将病

6、料送省级动物防疫监督机构，必要时送国家口蹄疫参考实验室。2.3.2 确诊疫情的报告省级动物防疫监督机构确诊为口蹄疫疫情时，应立即报告省级兽医行政管理部门和国家动物防疫监督机构；省级兽医管理部门在 1 小时内报省级人民政府和国务院兽医行政管理部门。国家参考实验室确诊为口蹄疫疫情时，应立即通知疫情发生地省级动物防疫监督机构和兽医行政管理部门，同时报国家动物防疫监督机构和国务院兽医行政管理部门。省级动物防疫监督机构诊断新血清型口蹄疫疫情时，将样本送至国家口蹄疫参考实验室。2.4 疫情确认国务院兽医行政管理部门根据省级动物防疫监督机构或国家口蹄疫参考实验室确诊结果，确认口蹄疫疫情。3 3 疫情处置疫情

7、处置3.1 疫点、疫区、受威胁区的划分3.1.1 疫点 为发病畜所在的地点。相对独立的规模化养殖场/户，以病畜所在的养殖场/户为疫点；散养畜以病畜所在的自然村为疫点；放牧畜以病畜所在的牧场及其活动场地为疫点；病畜在运输过程中发68生疫情，以运载病畜的车、船、飞机等为疫点；在市场发生疫情，以病畜所在市场为疫点；在屠宰加工过程中发生疫情，以屠宰加工厂（场）为疫点。3.1.2 疫区 由疫点边缘向外延伸 3 公里内的区域。3.1.3 受威胁区 由疫区边缘向外延伸 10 公里的区域。在疫区、受威胁区划分时，应考虑所在地的饲养环境和天然屏障（河流、山脉等）。3.2 疑似疫情的处置对疫点实施隔离、监控，禁止

8、家畜、畜产品及有关物品移动，并对其内、外环境实施严格的消毒措施。必要时采取封锁、扑杀等措施。3.3 确诊疫情处置疫情确诊后，立即启动相应级别的应急预案。3.3.1 封锁疫情发生所在地县级以上兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区实行封锁，人民政府在接到报告后，应在 24 小时内发布封锁令。跨行政区域发生疫情的，由共同上级兽医行政管理部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令。3.3.2 对疫点采取的措施3.3.2.1 扑杀疫点内所有病畜及同群易感畜，并对病死畜、被扑杀畜及其产品进行无害化处理（附件五）；3.3.2.2 对排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理（附69件六）；3.3.2.3 对

9、被污染或可疑污染的物品、交通工具、用具、畜舍、场地进行严格彻底消毒（附件七）；3.3.2.4 对发病前 14 天售出的家畜及其产品进行追踪，并做扑杀和无害化处理。3.3.3 对疫区采取的措施3.3.3.1 在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，执行监督检查任务，对出入的车辆和有关物品进行消毒；3.3.3.2 所有易感畜进行紧急强制免疫，建立完整的免疫档案；3.3.3.3 关闭家畜产品交易市场，禁止活畜进出疫区及产品运出疫区；3.3.3.4 对交通工具、畜舍及用具、场地进行彻底消毒；3.3.3.5 对易感家畜进行疫情监测，及时掌握疫情动态;3.3.3.6 必要时，可对疫

10、区内所有易感动物进行扑杀和无害化处理。3.3.4 对受威胁区采取的措施3.3.4.1 最后一次免疫超过一个月的所有易感畜，进行一次紧急强化免疫；3.3.4.2 加强疫情监测，掌握疫情动态。3.3.5 疫源分析与追踪调查按照口蹄疫流行病学调查规范，对疫情进行追踪溯源、扩散风险70分析（附件八）。3.3.6 解除封锁3.3.6.1 封锁解除的条件口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后 1 头病畜死亡或扑杀后连续观察至少 14 天，没有新发病例；疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；疫情监测阴性。新血清型口蹄疫疫情解除的条件：疫点内最后 1 头病畜死亡或扑杀后连续观察至少 14 天没有新发病例；

11、疫区、受威胁区紧急免疫接种完成；疫点经终末消毒；对疫区和受威胁区的易感动物进行疫情监测，结果为阴性。3.3.6.2 解除封锁的程序：动物防疫监督机构按照上述条件审验合格后，由兽医行政管理部门向原发布封锁令的人民政府申请解除封锁，由该人民政府发布解除封锁令。必要时由上级动物防疫监督机构组织验收。4 4 疫情监测疫情监测4.1 监测主体：县级以上动物防疫监督机构。4.2 监测方法：临床观察、实验室检测及流行病学调查。4.3 监测对象：以牛、羊、猪为主，必要时对其他动物监测。4.4 监测的范围4.4.1 养殖场户、散养畜，交易市场、屠宰厂（场）、异地调入的活畜及产品。4.4.2 对种畜场、边境、隔离

12、场、近期发生疫情及疫情频发等高风71险区域的家畜进行重点监测。监测方案按照当年兽医行政管理部门工作安排执行。4.5 疫区和受威胁区解除封锁后的监测 临床监测持续一年，反刍动物病原学检测连续 2 次，每次间隔 1 个月，必要时对重点区域加大监测的强度。4.6 在监测过程中，对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，密切注意病毒的变异动态，及时向国务院兽医行政管理部门报告。4.7 各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。4.8 监测结果处理监测结果逐级汇总上报至国家动物防疫监督机构，按照有关规定进行处理。5 5 免疫免疫5.1 国家对口蹄疫实行强制免疫，各级政

13、府负责组织实施，当地动物防疫监督机构进行监督指导。免疫密度必须达到 100%。5.2 预防免疫，按农业部制定的免疫方案规定的程序进行。5.3 突发疫情时的紧急免疫按本规范有关条款进行。5.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的产品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级供应。5.5 所有养殖场/户必须按科学合理的免疫程序做好免疫接种，建立完整免疫档案（包括免疫登记表、免疫证、免疫标识等）。725.6 各级动物防疫监督机构定期对免疫畜群进行免疫水平监测，根据群体抗体水平及时加强免疫。6 6 检疫监督检疫监督6.1 产地检疫猪、牛、羊等偶蹄动物在离开饲养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构报检，

14、接到报检后，动物防疫监督机构必须及时到场、到户实施检疫。检查合格后，收回动物免疫证，出具检疫合格证明；对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按照有关规定处理。6.2 屠宰检疫动物防疫监督机构的检疫人员对猪、牛、羊等偶蹄动物进行验证查物，证物相符检疫合格后方可入厂（场）屠宰。宰后检疫合格，出具检疫合格证明。对检疫不合格的按照有关规定处理。6.3 种畜、非屠宰畜异地调运检疫国内跨省调运包括种畜、乳用畜、非屠宰畜时，应当先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫审批手续，经调出地按规定检疫合格，方可调运。起运前两周，进行一次口蹄疫强化免疫，到达后须隔离饲养 14 天以上，由动物防疫监督机构检疫

15、检验合格后方可进场饲养。6.4 监督管理6.4.1 动物防疫监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情扩散。猪、牛、羊等偶蹄动物及产品凭检疫合格证（章）和动物标识运输、销售。736.4.2 生产、经营动物及动物产品的场所，必须符合动物防疫条件，取得动物防疫合格证，当地动物防疫监督机构应加强日常监督检查。6.4.3 各地根据防控家畜口蹄疫的需要建立动物防疫监督检查站，对家畜及产品进行监督检查，对运输工具进行消毒。发现疫情，按照动物防疫监督检查站口蹄疫疫情认定和处置办法相关规定处置。6.4.4 由新血清型引发疫情时，加大监管力度，严禁疫区所在县及疫区周围 50 公里范围内的家畜及产品流动。在与新发

16、疫情省份接壤的路口设置动物防疫监督检查站、卡实行 24 小时值班检查；对来自疫区运输工具进行彻底消毒，对非法运输的家畜及产品进行无害化处理。6.4.5 任何单位和个人不得随意处置及转运、屠宰、加工、经营、食用口蹄疫病（死）畜及产品；未经动物防疫监督机构允许，不得随意采样；不得在未经国家确认的实验室剖检分离、鉴定、保存病毒。7 7 保障措施保障措施7.1 各级政府应加强机构、队伍建设，确保各项防治技术落实到位。7.2 各级财政和发改部门应加强基础设施建设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化处理、消毒等防治技术工作经费落实。7.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构应按本技术规范，加强应急物资储备，

17、及时培训和演练应急队伍。7.4 发生口蹄疫疫情时，在封锁、采样、诊断、流行病学调查、无害化处理等过程中，要采取有效措施做好个人防护和消毒工作，防止人74为扩散。75附件一：间接夹心酶联免疫吸附试验（间接夹心酶联免疫吸附试验（I-ELISAI-ELISA）1 试验程序和原理1.1 利用包被于固相（I，96 孔平底 ELISA 专用微量板）的 FMDV型特异性抗体（AB，包被抗体，又称为捕获抗体），捕获待检样品中相应型的 FMDV 抗原（Ag）。再加入与捕获抗体同一血清型，但用另一种动物制备的抗血清（Ab，检测抗体）。如果有相应型的病毒抗原存在，则形成“夹心”式结合，并被随后加入的酶结合物/显色系

18、统（*E/S）检出。1.2 由于 FMDV 的多型性，和可能并发临床上难以区分的水泡性疾病，在检测病料时必然包括几个血清型（如 O、A、亚洲-1 型）；及临床症状相同的某些疾病，如猪水泡病（SVD）。2 材料2.1 样品的采集和处理见附件四2.2 主要试剂2.2.1 抗体2.2.1.1 包被抗体：兔抗 FMDV-“O”、 “A”、 “亚洲-I”型 146S 血清；及兔抗 SVDV-160S 血清。2.2.1.2 检测抗体：豚鼠抗 FMDV-“O”、 “A”、 “亚洲-I”型 146S 血清；及豚鼠抗 SVDV-160S 血清。762.2.2 酶结合物兔抗豚鼠 Ig 抗体(Ig)-辣根过氧化物酶

19、(HRP)结合物。2.2.3 对照抗原灭活的 FMDV-“O”“A”“亚洲-I”各型及 SVDV 细胞病毒液。2.2.4 底物溶液（底物/显色剂）3过氧化氢/3.3mmol/L 邻苯二胺(OPD)。2.2.5 终止液1.25mol/L 硫酸。2.2.6 缓冲液2.2.6.1 包被缓冲液 0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。2.2.6.2 稀释液 A 0.01mol/L PBS - 0.05(v/v)Tween-20，pH7.27.4。2.2.6.3 稀释液 B 5脱脂奶粉（w/v）- 稀释液 A 。2.2.6.4 洗涤缓冲液 0.002mol/L PBS - 0.01(

20、v/v)Tween-20。2.3 主要器材设备2.3.1 固相96 孔平底聚苯乙烯 ELISA 专用板。2.3.2 移液器、尖头及贮液槽微量可调移液器一套，可调范围 0.55000L(56 支)；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25250L）；微量可调连续加样移液器（10100L）；与各移液器匹配的各种尖头，及配套使用的贮液槽。2.3.3 振荡器77与 96 孔微量板配套的旋转振荡器。2.3.4 酶标仪,492nm 波长滤光片。2.3.5 洗板机或洗涤瓶,吸水纸巾。2.3.6 37恒温温室或温箱。3 操作方法3.1 预备试验为了确保检测结果准确可靠，必须最优化组合该 ELISA，即试验所

21、涉及的各种试剂，包括包被抗体、检测抗体、酶结合物、阳性对照抗原都要预先测定，计算出它们的最适稀释度，既保证试验结果在设定的最佳数据范围内，又不浪费试剂。使用诊断试剂盒时，可按说明书指定用量和用法。如试验结果不理想，重新滴定各种试剂后再检测。3.2 包被固相3.2.1 FMDV 各血清型及 SVDV 兔抗血清分别以包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按图 3-1所示布局加入微量板各行。每孔50L。加盖后 37振荡 2h。或室温（2025）振荡 30min，然后置湿盒中 4过夜（可以保存 1 周左右）。3.2.2 一般情况下,牛病料鉴定“O”和“A”两个型，某些地区的病料要加上“亚洲-I”型；猪病料要加

22、上 SVDV。图图 3-13-1：定型：定型 ELISAELISA 微量板包被血清布局微量板包被血清布局 、对照和被检样品布局、对照和被检样品布局1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A FMDV“O”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5B “A”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5C “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5D SVDVC+ C+C+ C+C- C-S1 1S3 3S5 5E FMDV“O”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6F “A”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4

23、4S6 678G “Asia-I”C+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6H SVDVC+ C+C+ C+C- C-S2 2S4 4S6 6试验开始，依据当天检测样品的数量包被，或取出包被好的板子；如用可拆卸微量板，则根据需要取出几条。在试验台上放置 20min，再洗涤 5 次，扣干。3.3 加对照抗原和待检样品3.3.1 布局空白和各阳性对照、待检样品在 ELISA 板上的分布位置如图 3-1所示。3.3.2 加样3.3.2.1 第 5 和第 6 列为空白对照（C-），每孔加 50L 稀释液 A。3.3.2.2 先将各型阳性对照抗原分别以稀释液 A 适当稀释，然后加入与包被抗体

24、同型的各行孔中，C+为强阳性，C+为阳性，可以用同一对照抗原的不同稀释度。每一对照 2 孔，每孔 50L。3.3.2.3 按待检样品的序号（S1、S2 .）逐个加入，每份样品每个血清型加 2 孔，每孔 50L。 37 振荡 1h，洗涤 5 次，扣干。3.4 加检测抗体各血清型豚鼠抗血清以稀释液 A 稀释至工作浓度，然后加入与包被抗体同型各行孔中，每孔 50L。37振荡 1h。洗涤 5 次，扣干。3.5 加酶结合物酶结合物以稀释液 B 稀释至工作浓度，每孔 50L。37振荡 40min。洗涤 5 次，扣干。3.6 加底物溶液79试验开始时，按当天需要量从冰箱暗盒中取出 OPD，放在温箱中融化并使

25、之升温至 37。临加样前，按每 6mL OPD 加 3双氧水30L（一块微量板用量），混匀后每孔加 50L。37振荡 15min。3.7 加终止液显色反应 15 分钟，准时加终止液 1.25mol/L H2SO4。50L/孔。3.8 观察和判读结果终止反应后,先用肉眼观察全部反应孔。如空白对照和阳性对照孔的显色基本正常,再用酶标仪(492nm)判读 OD 值。4 结果判定4.1 数据计算为了便于说明，假设表 3-1 所列数据为检测结果（OD 值）。利用表 3-1 所列数据,计算平均 OD 值和平均修正 OD 值（表 3-2）4.1.1 各行 2 孔空白对照（C-）平均 OD 值；4.1.2 各

26、行（各血清型）抗原对照（C+、C+）平均 OD 值；4.1.3 各待检样品各血清型（2 孔）平均 OD 值；4.1.4 计算出各平均修正 OD 值（每个(2)或(3)值同一行的(1)值。表表 3-1. 定型定型 ELISA 结结果果(OD 值值)C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.84 1.740.56 0.460.06 0.041.62 1.540.68 0.720.10 0.08B “A”1.25 1.450.40 0.420.07 0.050.09 0.071.22 1.320.09 0.09C“Asia- I”1.32 1.120.52 0.500.04 0.080

27、.05 0.090.12 0.060.07 0.09D SVDV1.08 1.100.22 0.240.08 0.080.09 0.100.08 0.120.28 0.3480C+ C+ C- S4 S5 S6 E FMDV“O”0.94 0.840.24 0.220.06 0.061.22 1.120.09 0.100.13 0.17F “A”1.10 1.020.11 0.130.06 0.040.10 0.100.28 0.260.20 0.28G“Asia- I”0.39 0.410.29 0.210.09 0.090.10 0.090.10 0.100.35 0.33H SVDV0.

28、88 0.780.15 0.110.05 0.050.11 0.070.09 0.090.10 0.12表表 3-2.平均平均 OD 值值/平均修正平均修正 OD 值值C+ C+ C- S1 S2 S3A FMDV“O”1.79/1.750.51/0.460.051.58/1.530.70/0.650.09/0.04B “A”1.35/1.290.41/0.350.060.08/0.021.27/1.210.09/0.03C “Asia- I”1.22/1.160.51/0.450.060.07/0.030.09/0.030.08/0.02D SVDV1.09/1.010.23/0.150.0

29、80.10/0.020.10/0.020.31/0.23C+ C+ C- S4 S5 S6E FMDV“O”0.89/0.830.23/0.170.061.17/1.110.10/0.040.15/0.09F “A”1.06/1.010.12/0.070.050.10/0.050.27/0.220.24/0.19G “Asia- I”0.40/0.310.25/0.160.090.10/0.010.10/0.010.34/0.25H SVDV0.83/0.780.13/0.080.050.09/0.050.09/0.040.11/0.064.2 结果判定4.2.1 试验不成立如果空白对照(C-

30、)平均 OD 值0.10，则试验不成立，本试验结果无效。4.2.2 试验基本成立如果空白对照(C-)平均 OD 值0.10，则试验基本成立。4.2.3 试验绝对成立如果空白对照(C-)平均 OD 值0.10，C+ 平均修正 OD 值810.10，C+ 平均修正 OD 值1.00, 试验绝对成立。如表 2 中A、B、C、D 行所列数据。4.2.3.1 如果某一待检样品某一型的平均修正 OD 值0.10，则该血清型为阴性。如 S1 的“A”、 “Asia-1”型和“SVDV”。4.2.3.2 如果某一待检样品某一型的平均修正 OD 值0.10，而且比其他型的平均修正 OD 值大 2 倍或 2 倍以

31、上，则该样品为该最高平均修正 OD 值所在的血清型。如 S1 为“O”型；S3 为“Asia-I”型。4.2.3.3 虽然某一待检样品某一型的平均修正 OD 值0.10，但不大于其他型的平均修正 OD 值的 2 倍，则该样品只能判定为可疑。该样品应接种乳鼠或细胞，并盲传数代增毒后再作检测。如 S2“A”型。4.2.4 试验部分成立如果空白对照(C-)平均 OD 值0.10，C+ 平均修正 OD 值0.10，C+ 平均修正 OD 值1.00, 试验部分成立。如表 2 中E、F、G、H 行所列数据。4.2.4.1 如果某一待检样品某一型的平均修正 OD 值0.10，而且比其他型的平均修正 OD 值

32、大 2 倍或 2 倍以上，则该样品为该最高平均修正 OD 值所在的血清型。 例如 S4 判定为“O”型。4.2.4.2 如果某一待检样品某一型的平均修正 OD 值介于0.101.00 之间,而且比其他型的平均修正 OD 值大 2 倍或 2 倍以上，该样品可以判定为该最高 OD 值所在血清型。例如 S5 判定为“A”型。4.2.4.3 如果某一待检样品某一型的平均修正 OD 值介于820.101.00 之间,但不比其他型的平均修正 OD 值大 2 倍，该样品应增毒后重检。如 S6“亚洲-I”型。注意：重复试验时，首先考虑调整对照抗原的工作浓度。如调整后再次试验结果仍不合格，应更换对照抗原或其他试

33、剂。83附件二反向间接血凝试验（反向间接血凝试验（RIHARIHA）1 材料准备1.1 96 孔微型聚乙烯血凝滴定板（110 度），微量振荡器或微型混合器，0.025 mL、0.05mL 稀释用滴管、乳胶吸头或 25L、50L 移液加样器。1.2 pH7.6、0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.6、0.05mol/L PB），pH7.6、50%丙三醇磷酸缓冲液（GPB），pH7.2、0.11mol/L 磷酸缓冲液（pH7.2、0.11mol/L PB），配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录 A（规范性附录）。1.3 稀释液 I、稀释液 II

34、，配制方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录 B（规范性附录）。1.4 标准抗原、阳性血清，由指定单位提供，按说明书使用和保存。1.5 敏化红细胞诊断液：由指定单位提供，效价滴定见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录 C（规范性附录）。1.6 被检材料处理方法见中华人民共和国国家标准（GB/T 19200-2003）猪水泡病诊断技术附录 E（规范性附录）。2 操作方法2.1 使用标准抗原进行口蹄疫 A、O、C、Asia-I 型及与猪水泡病鉴84别诊断。2.1.1 被检样品的稀释：把 8 只试管排列于试管架上，自

35、第 1 管开始由左至右用稀释液 I 作二倍连续稀释（即 1:6、1:12、1:241:768）,每管容积 0.5 mL。2.1.2 按下述滴加被检样品和对照：2.1.2.1 在血凝滴定板上的第一至五排，每排的第 8 孔滴加第 8 管稀释被检样品 0.05 mL，每排的第 7 孔滴加第 7 管稀释被检样品 0.05 mL，以此类推至第 1 孔。2.1.2.2 每排的第 9 孔滴加稀释液 I 0.05 mL,作为稀释液对照。2.1.2.3 每排的第 10 孔按顺序分别滴加口蹄疫 A、O、C、Asia-I 型和猪水泡病标准抗原（1：30 稀释）各 0.05 mL，作为阳性对照。2.1.3 滴加敏化红

36、细胞诊断液：先将敏化红细胞诊断液摇匀，于滴定板第一至五排的第 110 孔分别滴加口蹄疫 A、O、C、Asia-I 型和猪水泡病敏化红细胞诊断液，每孔 0.025 mL，置微量振荡器上振荡 1分钟2 分钟,2035放置 1.5 小时2 小时后判定结果。2.2 使用标准阳性血清进行口蹄疫 O 型及与猪水泡病鉴别诊断。2.2.1 每份被检样品作四排、每孔先各加入 25L 稀释液 II。2.2.2 每排第 1 孔各加被检样品 25L，然后分别由左至右作二倍连续稀释至第 7 孔（竖板）或第 11 孔（横板）。每排最后孔留作稀释液对照。2.2.3 滴加标准阳性血清：在第一、三排每孔加入 25L 稀释液 I

37、I；第二排每孔加入 25L 稀释至 1:20 的口蹄疫 O 型标准阳性血清；第四85排每孔加入 25L 稀释至 1:100 的猪水泡病标准阳性血清；置微型混合器上振荡 1 分钟2 分钟，加盖置 37作用 30 分钟。2.2.4 滴加敏化红细胞诊断液：在第一和第二排每孔加入口蹄疫 O型敏化红细胞诊断液 25L；第三和第四排每孔加入猪水泡病敏化红细胞诊断液 25L；置微型混合器上振荡 1 分钟2 分钟，加盖2035放置 2 小时后判定结果。3 结果判定3.1 按以下标准判定红细胞凝集程度：“+”100%完全凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围；“+”75%凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围，但孔底中心有

38、红细胞形成的针尖大的小点；“+”50%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下的小点；“+”25%凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉积于孔底；“”不凝集，红细胞完全沉积于孔底成一圆点。3.2 操作方法 2.1 的结果判定：稀释液 I 对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集试验方成立。3.2.1 若只第一排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫 A 型；若只第二排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为口蹄疫 O 型；以此类推。若只第五排孔凝集，其余四排孔不凝集，则被检样品为猪水泡病3.2.2 致红细胞 50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。3.2.3 如出

39、现 2 排以上孔的凝集，以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价 2 个对数（以 2 为底）浓度以上者即可判为阳性，其余判86为阴性。3.3 操作方法 2.2 的结果判定：稀释液 II 对照孔不凝集试验方可成立。3.3.3.1 若第一排出现 2 孔以上的凝集（+以上），且第二排相对应孔出现 2 个孔以上的凝集抑制，第三、四排不出现凝集判为口蹄疫 O型阳性。若第三排出现 2 孔以上的凝集（+以上），且第四排相对应孔出现 2 个孔以上的凝集抑制，第一、二排不出现凝集则判为猪水泡病阳性。3.3.3.2 致红细胞 50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价。87附件三正向间接血凝试验（正向间接血凝试验

40、（IHAIHA）1 原理原理用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。2 适用范适用范围围主要用于检测 O 型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。3 试验试验器材和器材和试剂试剂3.1 96 孔 110V 型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板3.2 微量移液器（50L 25L）取液塑咀3.3 微量振荡器3.

41、4 O 型口蹄疫血凝抗原3.5 O 型口蹄疫阴性对照血清3.6 O 型口蹄疫阳性对照血清3.7 稀释液3.8 待检血清（每头约 0.5ml 血清即可）56水浴灭活 30 分钟884 试验试验方法方法4.1 加稀释液在血凝板上 1-6 排的 1-9 孔；第 7 排的 1-4 孔第 6-7 孔；第 8 排的1-12 孔各加稀释液 50L。4.2 稀释待检血清取 1 号待检血清 50L 加入第 1 排第 1 孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧 1-2 次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出 50L移入第 2 孔，混匀后取出 50L 移入第 3 孔直至第 9 孔混匀后取出 50L 丢弃。此时第

42、1 排 1-9 孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512。取 2 号待检血清加入第 2 排；取 3 号待检血清加入第 3 排均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换塑咀一个。4.3 稀释阴性对照血清在血凝板的第 7 排第 1 孔加阴性血清 50L，对倍稀释至第 4 孔，混匀后从该孔取出 50L 丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1:4、1:8、1:16。第 6-7 孔为稀释液对照。4.4 稀释阳性对照血清在血凝板的第 8 排第 1 孔加阳性血清 50L，对倍数稀释至第 12孔，混匀后从该孔取出 5

43、0L 丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1：2-1：4096。894.5 加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加 O 型血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）25L。4.6 振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上 1-2 分钟，如无振荡器，用手轻拍混匀亦可，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或 37下静置 1.5-2 小时判定结果，也可延至翌日判定。4.7 判定标准移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清 1:16 孔，稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集

44、（血球大部沉于孔底，边缘稍有少量血球悬浮）。阳性血清对照 1:2-1:256 各孔应出现“+”“+”凝集为合格（少量血球沉入孔底，大部血球悬浮于孔内）。在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“+”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如 1 号待检血清 1-5 孔呈现“+”“+”凝集，6-7 孔呈现“+”凝集，第 8 孔呈现“+”凝集，第 9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为 1:128。接种口蹄疫疫苗的猪群免疫抗体效价达到 1:128（即第 7 孔）牛群、羊群免疫抗体效价达到 1:256（第 8 孔）呈现“+”凝集为免疫合格。5 检测试剂检测试剂的性状、的性状、规

45、规格格5.1 性状905.1.1 液体血凝抗原：摇匀呈棕红色（或咖啡色），静置后，血球逐渐沉入瓶底。5.1.2 阴性对照血清：淡黄色清亮稍带粘性的液体。5.1.3 阳性对照血清：微红或淡色稍混浊带粘性的液体。5.1.4 稀释液：淡黄或无色透明液体，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶，不影响使用。5.2 包装5.2.1 液体血凝抗原：摇匀后即可使用，5ml/瓶。5.2.2 阴性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。5.2.3 阳性血清：1ml/瓶，直接稀释使用。5.2.4 稀释液：100 ml/瓶，直接使用，4-8保存。5.2.5 保存条件及保存期5.2.5.1 液体血凝抗原：4-

46、8保存（切勿冻结），保存期 3 个月。5.2.5.2 阴性对照血清：-15-20保存，有效期 1 年。5.2.5.3 阳性对照血清：-15-20保存，有效期 1 年。6 注意事注意事项项6.1 为使检测获得正确结果，请在检测前仔细阅读说明书。6.2 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。6.3 勿用 90和 130血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果。6.4 用过的血凝板应及时在水龙头冲净血球。再用蒸馏水或去离91子水冲洗 2 次，甩干水份放 37恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37干燥备用。血凝板应浸泡在洗液中（浓硫酸与重铬酸钾按1：1 混合），48 小时捞

47、出后清水冲净。6.5 每次检测只做一份阴性、阳性和稀释液对照。“-”表示完全不凝集或 0-10%血球凝集。“+”表示 10-25%血球凝集 “+”表示 75%血球凝集。“+”表示 50%血球凝集 “+”表示 90-100%血球凝集。6.6 用不同批次的血凝抗原检测同一份血清时，应事先用阳性血清准确测定各批次血凝抗原的效价，取抗原效价相同或相近的血凝抗原检测待检血清抗体水平的结果是基本一致的，如果血凝抗原效价差别很大用来检测同一血清样品，肯定会出现检测结果不一致。6.7 收到本试剂盒时，应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶盖上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果。92附件四

48、口蹄疫病料的采集、保存与运送口蹄疫病料的采集、保存与运送采集、保存和运输样品须符合下列要求，并填写样品采集登记表。1 样品的采集和保存1.1 组织样品1.1.1 样品的选择用于病毒分离、鉴定的样品以发病动物(牛、羊或猪)未破裂的舌面或蹄部,鼻镜,乳头等部位的水泡皮和水泡液最好。对临床健康但怀疑带毒的动物可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。1.1.2 样品的采集和保存水泡样品采集部位可用清水清洗，切忌使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。1.1.2.1 未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器采集至少 1 毫升，装入灭菌小瓶中(可加适量抗菌素)，加盖密封；尽快冷冻保存。1.1.2.2 剪取新鲜水泡皮 35 克放入灭菌小瓶中,加适量（2 倍体积）50甘油/磷酸盐缓冲液(pH7.4), 加盖密封；尽快冷冻保存。1.1.2.3 在无法采集水泡