口蹄疫防治技术规范9823.docx

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1、二、口蹄蹄疫防治治技术规规范口蹄疫（FFoott annd MMoutth DDiseeasee, FFMD）是是由口蹄蹄疫病毒毒引起的的以偶蹄蹄动物为为主的急急性、热热性、高高度传染染性疫病病，世界界动物卫卫生组织织（OIIE）将将其列为为必须报报告的动动物传染染病，我我国规定定为一类类动物疫疫病。为预防、控控制和扑扑灭口蹄蹄疫，依依据中中华人民民共和国国动物防防疫法、重重大动物物疫情应应急条例例、国国家突发发重大动动物疫情情应急预预案等等法律法法规，制制定本技技术规范范。1 适适用范围围本规范规规定了口口蹄疫疫疫情确认认、疫情情处置、疫疫情监测测、免疫疫、检疫疫监督的的操作程程序、技技术标

2、准准及保障障措施。本规范适适用于中中华人民民共和国国境内一一切与口口蹄疫防防治活动动有关的的单位和和个人。2 诊诊断2.1 诊断指指标2.1.1 流流行病学学特点2.1.1.11 偶蹄蹄动物，包包括牛科科动物（牛牛、瘤牛牛、水牛牛、牦牛牛）、绵绵羊、山山羊、猪猪及所有有野生反反刍和猪猪科动物物均易感感，驼科科动物（骆骆驼、单单峰骆驼驼、美洲洲驼、美美洲骆马马）易感感性较低低。2.1.1.22 传染染源主要要为潜伏伏期感染染及临床床发病动动物。感感染动物物呼出物物、唾液液、粪便便、尿液液、乳、精精液及肉肉和副产产品均可可带毒。康康复期动动物可带带毒。2.1.1.33 易感感动物可可通过呼呼吸道、

3、消消化道、生生殖道和和伤口感感染病毒毒，通常常以直接接或间接接接触（飞飞沫等）方方式传播播，或通通过人或或犬、蝇蝇、蜱、鸟鸟等动物物媒介，或或经车辆辆、器具具等被污污染物传传播。如如果环境境气候适适宜，病病毒可随随风远距距离传播播。2.1.2 临临床症状状2.1.2.11 牛呆呆立流涎涎，猪卧卧地不起起，羊跛跛行；2.1.2.22 唇部部、舌面面、齿龈龈、鼻镜镜、蹄踵踵、蹄叉叉、乳房房等部位位出现水水泡；2.1.2.33 发病病后期，水水泡破溃溃、结痂痂，严重重者蹄壳壳脱落，恢恢复期可可见瘢痕痕、新生生蹄甲；2.1.2.44 传播播速度快快，发病病率高；成年动动物死亡亡率低，幼幼畜常突突然死亡

4、亡且死亡亡率高，仔仔猪常成成窝死亡亡。2.1.3 病病理变化化2.1.3.11消化道道可见水水泡、溃溃疡；2.1.3.22幼畜可可见骨骼骼肌、心心肌表面面出现灰灰白色条条纹，形形色酷似似虎斑。2.1.4 病病原学检检测2.1.4.11 间接接夹心酶酶联免疫疫吸附试试验，检检测阳性性（ELLISAA OIIE 标标准方法法 附件件一）；2.1.4.22 RTT-PCCR试验验，检测测阳性（采采用国家家确认的的方法）；2.1.4.33 反向向间接血血凝试验验（RIIHA），检检测阳性性（附件件二）；2.1.4.44 病毒毒分离，鉴鉴定阳性性。2.1.5 血血清学检检测2.1.5.11中和试试验，抗

5、抗体阳性性；2.1.5.22液相阻阻断酶联联免疫吸吸附试验验，抗体体阳性；2.1.5.33非结构构蛋白EELISSA检测测感染抗抗体阳性性；2.1.5.44 正向向间接血血凝试验验（IHHA），抗抗体阳性性（附件件三）。2.2 结果判判定2.2.1 疑疑似口蹄蹄疫病例例符合该病病的流行行病学特特点和临临床诊断断或病理理诊断指指标之一一，即可可定为疑疑似口蹄蹄疫病例例。2.2.2 确确诊口蹄蹄疫病例例疑似口蹄蹄疫病例例，病原原学检测测方法任任何一项项阳性，可可判定为为确诊口口蹄疫病病例；疑似口蹄蹄疫病例例，在不不能获得得病原学学检测样样本的情情况下，未未免疫家家畜血清清抗体检检测阳性性或免疫疫家

6、畜非非结构蛋蛋白抗体体ELIISA检检测阳性性，可判判定为确确诊口蹄蹄疫病例例。2.3疫疫情报告告任何单位位和个人人发现家家畜上述述临床异异常情况况的，应应及时向向当地动动物防疫疫监督机机构报告告。动物物防疫监监督机构构应立即即按照有有关规定定赴现场场进行核核实。2.3.1 疑疑似疫情情的报告告县级动物物防疫监监督机构构接到报报告后，立立即派出出2名以以上具有有相关资资格的防防疫人员员到现场场进行临临床和病病理诊断断。确认认为疑似似口蹄疫疫疫情的的，应在在2小时时内报告告同级兽兽医行政政管理部部门，并并逐级上上报至省省级动物物防疫监监督机构构。省级级动物防防疫监督督机构在在接到报报告后，11小

7、时内内向省级级兽医行行政管理理部门和和国家动动物防疫疫监督机机构报告告。诊断为疑疑似口蹄蹄疫病例例时，采采集病料料（附件件四），并并将病料料送省级级动物防防疫监督督机构，必必要时送送国家口口蹄疫参参考实验验室。2.3.2 确确诊疫情情的报告告省级动物物防疫监监督机构构确诊为为口蹄疫疫疫情时时，应立立即报告告省级兽兽医行政政管理部部门和国国家动物物防疫监监督机构构；省级级兽医管管理部门门在1小小时内报报省级人人民政府府和国务务院兽医医行政管管理部门门。国家参考考实验室室确诊为为口蹄疫疫疫情时时，应立立即通知知疫情发发生地省省级动物物防疫监监督机构构和兽医医行政管管理部门门，同时时报国家家动物防防

8、疫监督督机构和和国务院院兽医行行政管理理部门。省级动物物防疫监监督机构构诊断新新血清型型口蹄疫疫疫情时时，将样样本送至至国家口口蹄疫参参考实验验室。2.4 疫情确确认国务院兽兽医行政政管理部部门根据据省级动动物防疫疫监督机机构或国国家口蹄蹄疫参考考实验室室确诊结结果，确确认口蹄蹄疫疫情情。3 疫疫情处置置3.1疫疫点、疫疫区、受受威胁区区的划分分3.1.1疫点点 为发发病畜所所在的地地点。相相对独立立的规模模化养殖殖场/户户，以病病畜所在在的养殖殖场/户户为疫点点；散养养畜以病病畜所在在的自然然村为疫疫点；放放牧畜以以病畜所所在的牧牧场及其其活动场场地为疫疫点；病病畜在运运输过程程中发生生疫情

9、，以以运载病病畜的车车、船、飞飞机等为为疫点；在市场场发生疫疫情，以以病畜所所在市场场为疫点点；在屠屠宰加工工过程中中发生疫疫情，以以屠宰加加工厂（场场）为疫疫点。3.1.2 疫疫区 由疫点点边缘向向外延伸伸3公里里内的区区域。3.1.3 受受威胁区区 由疫疫区边缘缘向外延延伸100公里的的区域。在疫区、受受威胁区区划分时时，应考考虑所在在地的饲饲养环境境和天然然屏障（河河流、山山脉等）。3.2 疑似疫疫情的处处置对疫点实实施隔离离、监控控，禁止止家畜、畜畜产品及及有关物物品移动动，并对对其内、外外环境实实施严格格的消毒毒措施。必要时采采取封锁锁、扑杀杀等措施施。3.3 确诊疫疫情处置置疫情确

10、诊诊后，立立即启动动相应级级别的应应急预案案。3.3.1 封封锁疫情发生生所在地地县级以以上兽医医行政管管理部门门报请同同级人民民政府对对疫区实实行封锁锁，人民民政府在在接到报报告后，应应在244小时内内发布封封锁令。跨行政区区域发生生疫情的的，由共共同上级级兽医行行政管理理部门报报请同级级人民政政府对疫疫区发布布封锁令令。3.3.2 对对疫点采采取的措措施3.3.2.11 扑杀杀疫点内内所有病病畜及同同群易感感畜，并并对病死死畜、被被扑杀畜畜及其产产品进行行无害化化处理（附附件五）；3.3.2.22对排泄泄物、被被污染饲饲料、垫垫料、污污水等进进行无害害化处理理（附件件六）；3.3.2.33

11、对被污污染或可可疑污染染的物品品、交通通工具、用用具、畜畜舍、场场地进行行严格彻彻底消毒毒（附件件七）；3.3.2.44 对发发病前114天售售出的家家畜及其其产品进进行追踪踪，并做做扑杀和和无害化化处理。3.3.3 对对疫区采采取的措措施3.3.3.11在疫区区周围设设置警示示标志，在在出入疫疫区的交交通路口口设置动动物检疫疫消毒站站，执行行监督检检查任务务，对出出入的车车辆和有有关物品品进行消消毒；3.3.3.22 所有有易感畜畜进行紧紧急强制制免疫，建建立完整整的免疫疫档案；3.3.3.33 关闭家畜畜产品交交易市场场，禁止止活畜进进出疫区区及产品品运出疫疫区；3.3.3.44对交通通工

12、具、畜畜舍及用用具、场场地进行行彻底消消毒；3.3.3.55对易感感家畜进进行疫情情监测，及及时掌握握疫情动动态;3.3.3.66 必要要时，可可对疫区区内所有有易感动动物进行行扑杀和和无害化化处理。3.3.4对受受威胁区区采取的的措施3.3.4.11 最后后一次免免疫超过过一个月月的所有有易感畜畜，进行行一次紧紧急强化化免疫；3.3.4.22 加强强疫情监监测，掌掌握疫情情动态。3.3.5 疫源分分析与追追踪调查查按照口蹄蹄疫流行行病学调调查规范范，对疫疫情进行行追踪溯溯源、扩扩散风险险分析（附附件八）。3.3.6解除除封锁3.3.6.11封锁解解除的条条件口蹄疫疫疫情解除除的条件件：疫点点

13、内最后后1头病病畜死亡亡或扑杀杀后连续续观察至至少144天，没没有新发发病例；疫区、受受威胁区区紧急免免疫接种种完成；疫点经经终末消消毒；疫疫情监测测阴性。新血清型型口蹄疫疫疫情解解除的条条件：疫疫点内最最后1头头病畜死死亡或扑扑杀后连连续观察察至少114天没没有新发发病例；疫区、受受威胁区区紧急免免疫接种种完成；疫点经经终末消消毒；对对疫区和和受威胁胁区的易易感动物物进行疫疫情监测测，结果果为阴性性。3.3.6.22解除封封锁的程程序：动动物防疫疫监督机机构按照照上述条条件审验验合格后后，由兽兽医行政政管理部部门向原原发布封封锁令的的人民政政府申请请解除封封锁，由由该人民民政府发发布解除除封

14、锁令令。必要时由由上级动动物防疫疫监督机机构组织织验收。4 疫情情监测4.1 监测主主体：县县级以上上动物防防疫监督督机构。4.2 监测方方法：临临床观察察、实验验室检测测及流行行病学调调查。4.3 监测对对象：以以牛、羊羊、猪为为主，必必要时对对其他动动物监测测。4.4 监测的的范围4.4.1 养殖场场户、散散养畜，交交易市场场、屠宰宰厂（场场）、异异地调入入的活畜畜及产品品。4.4.2对种种畜场、边边境、隔隔离场、近近期发生生疫情及及疫情频频发等高高风险区区域的家家畜进行行重点监监测。监测方案案按照当当年兽医医行政管管理部门门工作安安排执行行。4.5疫疫区和受受威胁区区解除封封锁后的的监测

15、 临床监监测持续续一年，反反刍动物物病原学学检测连连续2次次，每次次间隔11个月，必必要时对对重点区区域加大大监测的的强度。4.6在在监测过过程中，对对分离到到的毒株株进行生生物学和和分子生生物学特特性分析析与评价价，密切切注意病病毒的变变异动态态，及时时向国务务院兽医医行政管管理部门门报告。4.7 各级动动物防疫疫监督机机构对监监测结果果及相关关信息进进行风险险分析，做做好预警警预报。4.8监监测结果果处理监测结果果逐级汇汇总上报报至国家家动物防防疫监督督机构，按按照有关关规定进进行处理理。5 免疫疫5.1 国家对对口蹄疫疫实行强强制免疫疫，各级级政府负负责组织织实施，当当地动物物防疫监监督

16、机构构进行监监督指导导。免疫疫密度必必须达到到1000%。5.2 预防免免疫，按按农业部部制定的的免疫方方案规定定的程序序进行。5.3 突发疫疫情时的的紧急免免疫按本本规范有有关条款款进行。5.4 所用疫疫苗必须须采用农农业部批批准使用用的产品品，并由由动物防防疫监督督机构统统一组织织、逐级级供应。5.5 所有养养殖场/户必须须按科学学合理的的免疫程程序做好好免疫接接种，建建立完整整免疫档档案（包包括免疫疫登记表表、免疫疫证、免免疫标识识等）。5.6 各级动动物防疫疫监督机机构定期期对免疫疫畜群进进行免疫疫水平监监测，根根据群体体抗体水水平及时时加强免免疫。6 检检疫监督督6.1 产地检检疫猪

17、、牛、羊羊等偶蹄蹄动物在在离开饲饲养地之之前，养养殖场/户必须须向当地地动物防防疫监督督机构报报检，接接到报检检后，动动物防疫疫监督机机构必须须及时到到场、到到户实施施检疫。检检查合格格后，收收回动物物免疫证证，出具具检疫合合格证明明；对运运载工具具进行消消毒，出出具消毒毒证明，对对检疫不不合格的的按照有有关规定定处理。6.2 屠宰检检疫动物防疫疫监督机机构的检检疫人员员对猪、牛牛、羊等等偶蹄动动物进行行验证查查物，证证物相符符检疫合合格后方方可入厂厂（场）屠屠宰。宰宰后检疫疫合格，出出具检疫疫合格证证明。对对检疫不不合格的的按照有有关规定定处理。6.3 种畜、非非屠宰畜畜异地调调运检疫疫国内

18、跨省省调运包包括种畜畜、乳用用畜、非非屠宰畜畜时，应应当先到到调入地地省级动动物防疫疫监督机机构办理理检疫审审批手续续，经调调出地按按规定检检疫合格格，方可可调运。起起运前两两周，进进行一次次口蹄疫疫强化免免疫，到到达后须须隔离饲饲养144天以上上，由动动物防疫疫监督机机构检疫疫检验合合格后方方可进场场饲养。6.4 监督管管理6.4.1动物物防疫监监督机构构应加强强流通环环节的监监督检查查，严防防疫情扩扩散。猪猪、牛、羊羊等偶蹄蹄动物及及产品凭凭检疫合合格证（章章）和动动物标识识运输、销销售。6.4.2生产产、经营营动物及及动物产产品的场场所，必必须符合合动物防防疫条件件，取得得动物防防疫合格

19、格证，当当地动物物防疫监监督机构构应加强强日常监监督检查查。6.4.3 各各地根据据防控家家畜口蹄蹄疫的需需要建立立动物防防疫监督督检查站站，对家家畜及产产品进行行监督检检查，对对运输工工具进行行消毒。发发现疫情情，按照照动物物防疫监监督检查查站口蹄蹄疫疫情情认定和和处置办办法相相关规定定处置。6.4.4 由由新血清清型引发发疫情时时，加大大监管力力度，严严禁疫区区所在县县及疫区区周围550公里里范围内内的家畜畜及产品品流动。在在与新发发疫情省省份接壤壤的路口口设置动动物防疫疫监督检检查站、卡卡实行224小时时值班检检查；对对来自疫疫区运输输工具进进行彻底底消毒，对对非法运运输的家家畜及产产品

20、进行行无害化化处理。6.4.5任何何单位和和个人不不得随意意处置及及转运、屠屠宰、加加工、经经营、食食用口蹄蹄疫病（死死）畜及及产品；未经动动物防疫疫监督机机构允许许，不得得随意采采样；不不得在未未经国家家确认的的实验室室剖检分分离、鉴鉴定、保保存病毒毒。7 保障障措施7.1各各级政府府应加强强机构、队队伍建设设，确保保各项防防治技术术落实到到位。7.2各各级财政政和发改改部门应应加强基基础设施施建设，确确保免疫疫、监测测、诊断断、扑杀杀、无害害化处理理、消毒毒等防治治技术工工作经费费落实。7.3各各级兽医医行政部部门动物物防疫监监督机构构应按本本技术规规范，加加强应急急物资储储备，及及时培训

21、训和演练练应急队队伍。7.4发发生口蹄蹄疫疫情情时，在在封锁、采采样、诊诊断、流流行病学学调查、无无害化处处理等过过程中，要要采取有有效措施施做好个个人防护护和消毒毒工作，防防止人为为扩散。附件一：间接夹心心酶联免免疫吸附附试验（II-ELLISAA）1 试验验程序和和原理1.1利利用包被被于固相相（I，996孔平平底ELLISAA专用微微量板）的的FMDDV型特特异性抗抗体（AAB，包包被抗体体，又称称为捕获获抗体），捕捕获待检检样品中中相应型型的FMMDV抗抗原（AAg）。再再加入与与捕获抗抗体同一一血清型型，但用用另一种种动物制制备的抗抗血清（AAb，检检测抗体体）。如如果有相相应型的的

22、病毒抗抗原存在在，则形形成“夹心”式结合合，并被被随后加加入的酶酶结合物物/显色色系统（*E/SS）检出出。1.2由由于FMMDV的的多型性性，和可可能并发发临床上上难以区区分的水水泡性疾疾病，在在检测病病料时必必然包括括几个血血清型（如如O、AA、亚洲洲-1型型）；及及临床症症状相同同的某些些疾病，如如猪水泡泡病（SSVD）。2 材料料2.1 样品的的采集和和处理见附件四四2.2 主要试试剂2.2.1 抗抗体2.2.1.11包被抗抗体：兔兔抗FMMDV-“O”、“A”、“亚洲-II”型1446S血血清；及及兔抗SSVDVV-1660S血血清。2.2.1.22检测抗抗体：豚豚鼠抗FFMDVV-

23、“O”、“A”、“亚洲-II”型1446S血血清；及及豚鼠抗抗SVDDV-1160SS血清。2.2.2 酶酶结合物物 兔抗豚豚鼠Igg抗体(Ig)-辣根根过氧化化物酶(HRPP)结合合物。2.2.3 对对照抗原原 灭活的的FMDDV-“O”“A”“亚洲洲-I”各型及及SVDDV细胞胞病毒液液。2.2.4 底底物溶液液（底物物/显色色剂） 3过过氧化氢氢/3.3mmmol/L邻苯苯二胺(OPDD)。2.2.5 终终止液 1.225mool/LL 硫酸酸。2.2.6 缓缓冲液2.2.6.11包被缓缓冲液 0.05mmol/L NNa2CO3-NaaHCOO3，pHH9.66。2.2.6.22稀释液

24、液A 0.001mool/LL PBBS - 0.05(v/v)TTweeen-220，ppH7.277.4。2.2.6.33稀释液液B 5脱脱脂奶粉粉（w/v）- 稀释释液A 。2.2.6.44洗涤缓缓冲液 0.0022moll/L PBSS - 0.001(v/vv)Twweenn-200。2.3 主要器器材设备备2.3.1 固固相 96孔孔平底聚聚苯乙烯烯ELIISA专专用板。2.3.2 移移液器、尖尖头及贮贮液槽 微量可可调移液液器一套套，可调调范围00.550000L(556支支)；多多（4、88、122）孔道道微量可可调移液液器（2252250L）；微量可可调连续续加样移移液器（1

25、101100L）；与各移移液器匹匹配的各各种尖头头，及配配套使用用的贮液液槽。2.3.3 振振荡器 与966孔微量量板配套套的旋转转振荡器器。2.3.4 酶酶标仪,4922nm波波长滤光光片。2.3.5 洗洗板机或或洗涤瓶瓶,吸水水纸巾。2.3.6 337恒温温温室或温温箱。3 操作作方法3.1 预备试试验 为为了确保保检测结结果准确确可靠，必必须最优优化组合合该ELLISAA，即试试验所涉涉及的各各种试剂剂，包括括包被抗抗体、检检测抗体体、酶结结合物、阳阳性对照照抗原都都要预先先测定，计计算出它它们的最最适稀释释度，既既保证试试验结果果在设定定的最佳佳数据范范围内，又又不浪费费试剂。使使用诊

26、断断试剂盒盒时，可可按说明明书指定定用量和和用法。如如试验结结果不理理想，重重新滴定定各种试试剂后再再检测。3.2 包被固固相3.2.1 FFMDVV各血清清型及SSVDVV兔抗血血清分别别以包被被缓冲液液稀释至至工作浓浓度，然然后按图图3-11所示示布局加加入微量量板各行行。每孔孔50L。加加盖后337振荡22h。或或室温（220225）振荡荡30mmin，然然后置湿湿盒中44过夜（可可以保存存1周左左右）。3.2.2 一一般情况况下,牛牛病料鉴鉴定“O”和“A”两个型型，某些些地区的的病料要要加上“亚洲-II”型；猪猪病料要要加上SSVDVV。 图图3-11：定型型ELIISA微微量板包包

27、被血清清布局 、对对照和被被检样品品布局 1 22 3 44 55 6 7 8 9 10 11 122A FMDDV“O”C+ C+C+ C+C- CC-S1 1S3 3S5 5B “A”C+ C+C+ C+C- CC-S1 1S3 3S5 5C “Asiia-II”C+ C+C+ C+C- CC-S1 1S3 3S5 5D SVDDVC+ C+C+ C+C- CC-S1 1S3 3S5 5E FMDDV“O”C+ C+C+ C+C- CC-S2 2S4 4S6 6F “A”C+ C+C+ C+C- CC-S2 2S4 4S6 6G “Asiia-II”C+ C+C+ C+C- CC-S2 2

28、S4 4S6 6H SVDDVC+ C+C+ C+C- CC-S2 2S4 4S6 6试验开始始，依据据当天检检测样品品的数量量包被，或或取出包包被好的的板子；如用可可拆卸微微量板，则则根据需需要取出出几条。在在试验台台上放置置20mmin，再再洗涤55次，扣扣干。3.3 加对照照抗原和和待检样样品3.3.1 布布局空白和各各阳性对对照、待待检样品品在 EELISSA 板板上的分分布位置置如图33-1所示示。3.3.2 加加样3.3.2.11第5和和第6列列为空白白对照（CC-），每每孔加550L稀释释液A。3.3.2.22先将各各型阳性性对照抗抗原分别别以稀释释液A适适当稀释释，然后后加入与

29、与包被抗抗体同型型的各行行孔中，CC+为为强阳性性，C+为阳性性，可以以用同一一对照抗抗原的不不同稀释释度。每每一对照照2孔，每每孔500L。3.3.2.33按待检检样品的的序号（SS1、SS2 .）逐逐个加入入，每份份样品每每个血清清型加22孔，每每孔500L。 377 振荡荡1h，洗洗涤5次次，扣干干。3.4 加检测测抗体 各血清清型豚鼠鼠抗血清清以稀释释液A稀稀释至工工作浓度度，然后后加入与与包被抗抗体同型型各行孔孔中，每每孔500L。377振荡11h。洗洗涤5次次，扣干干。3.5 加酶结结合物 酶结合合物以稀稀释液BB稀释至至工作浓浓度，每每孔500L。37振振荡400minn。洗涤涤

30、5次，扣扣干。3.6 加底物物溶液试验开始始时，按按当天需需要量从从冰箱暗暗盒中取取出OPPD，放放在温箱箱中融化化并使之之升温至至37。临加加样前，按按每6mmL OOPD加加3双双氧水330L（一一块微量量板用量量），混混匀后每每孔加550L。377振荡115miin。3.7 加终止止液 显色反反应155分钟，准准时加终终止液11.255moll/L H2SO4。500L/孔孔。3.8 观察和和判读结结果终止反应应后,先先用肉眼眼观察全全部反应应孔。如如空白对对照和阳阳性对照照孔的显显色基本本正常,再用酶酶标仪(4922nm)判读OOD值。4 结果果判定4.1 数据计计算 为了便便于说明明

31、，假设设表3-1所列列数据为为检测结结果（OOD值）。 利用表表3-1所列列数据,计算平平均ODD值和平平均修正正OD值值（表33-2）4.1.1各行行2孔空空白对照照（C-）平均均OD值值；4.1.2各行行（各血血清型）抗抗原对照照（C+、CC+）平平均ODD值；4.1.3各待待检样品品各血清清型（22孔）平平均ODD值；4.1.4计算算出各平平均修正正OD值值（每个(2)或或(3)值同一一行的(1)值值。表3-11. 定定型ELLISAA结果(OD值值)C+ CC+ CC- S11 SS2 S3A FMMDV“O”1.844 1.740.566 0.460.066 0.041.622 1.

32、540.688 0.720.100 0.08B “A”1.255 1.450.400 0.420.077 0.050.099 0.071.222 1.320.099 0.09C“Assia-I”1.322 1.120.522 0.500.044 0.080.055 0.090.122 0.060.077 0.09D SSVDVV1.088 1.100.222 0.240.088 0.080.099 0.100.088 0.120.288 0.34C+ C+ C- SS4 S55 S6 E FMMDV“O”0.944 0.840.244 0.220.066 0.061.222 1.120.099

33、 0.100.133 0.17F “A”1.100 1.020.111 0.130.066 0.040.100 0.100.288 0.260.200 0.28G“Assia-I”0.399 0.410.299 0.210.099 0.090.100 0.090.100 0.100.355 0.33H SSVDVV0.888 0.780.155 0.110.055 0.050.111 0.070.099 0.090.100 0.12表3-22.平均均OD值值/平均均修正OOD值 C+ C+ C- SS1 S22 S3A FFMDVV“O”1.799/1.750.511/0.460.0551.5

34、88/1.530.700/0.650.099/0.04B“A”1.355/1.290.411/0.350.0660.088/0.021.277/1.210.099/0.03C “AAsiaa-I”1.222/1.160.511/0.450.0660.077/0.030.099/0.030.088/0.02D SSVDVV1.099/1.010.233/0.150.0880.100/0.020.100/0.020.311/0.23 C+ CC+ C- S4 SS5 SS6E FFMDVV“O”0.899/0.830.233/0.170.0661.177/1.110.100/0.040.155/0

35、.09F “A”1.066/1.010.122/0.070.0550.100/0.050.277/0.220.244/0.19G “AAsiaa-I”0.400/0.310.255/0.160.0990.100/0.010.100/0.010.344/0.25H SSVDVV0.833/0.780.133/0.080.0550.099/0.050.099/0.040.111/0.064.2 结果判判定4.2.1 试试验不成成立 如果空空白对照照(C-)平均均OD值值0.10，则则试验不不成立，本本试验结结果无效效。4.2.2 试试验基本本成立 如果空空白对照照(C-)平均均OD值值0.110，

36、则则试验基基本成立立。4.2.3 试试验绝对对成立 如果空空白对照照(C-)平均均OD值值0.110，CC+ 平平均修正正OD值值0.10，CC+ 平均修修正ODD值11.000, 试试验绝对对成立。如如表2中中A、BB、C、DD行所列列数据。4.2.3.11如果某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值0.110，则则该血清清型为阴阴性。如S1的的“A”、“Asiia-11”型和“SVDDV”。4.2.3.22如果某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值00.100，而且且比其他他型的平平均修正正OD值值大2倍倍或2倍倍以上，则则该样品品为该最最高平均均修正OOD值所所在的血血清型

37、。如如S1为为“O”型；SS3为“Asiia-II”型。4.2.3.33虽然某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值00.100，但不不大于其其他型的的平均修修正ODD值的22倍，则则该样品品只能判判定为可可疑。该该样品应应接种乳乳鼠或细细胞，并并盲传数数代增毒毒后再作作检测。如如S2“A”型。4.2.4 试试验部分分成立 如果空空白对照照(C-)平均均OD值值0.110，CC+ 平平均修正正OD值值0.110，CC+ 平均修修正ODD值1.000, 试验部部分成立立。如表表2中EE、F、GG、H行行所列数数据。4.2.4.11如果某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值0.110

38、，而而且比其其他型的的平均修修正ODD值大22倍或22倍以上上，则该该样品为为该最高高平均修修正ODD值所在在的血清清型。 例如SS4判定定为“O”型。4.2.4.22如果某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值介于于0.11011.000之间,而且比比其他型型的平均均修正OOD值大大2倍或或2倍以以上，该该样品可可以判定定为该最最高ODD值所在在血清型型。例如如S5判判定为“A”型。4.2.4.33如果某某一待检检样品某某一型的的平均修修正ODD值介于于0.11011.000之间,但不比比其他型型的平均均修正OOD值大大2倍，该该样品应应增毒后后重检。如如S6“亚洲-II”型。注意：重

39、重复试验验时，首首先考虑虑调整对对照抗原原的工作作浓度。如如调整后后再次试试验结果果仍不合合格，应应更换对对照抗原原或其他他试剂。附件二反向间接接血凝试试验（RRIHAA）1 材料料准备1.1 966孔微型型聚乙烯烯血凝滴滴定板（1110度度），微微量振荡荡器或微微型混合合器，00.0225 mmL、00.055mL稀稀释用滴滴管、乳乳胶吸头头或255L、550L移液液加样器器。1.2 pHH7.66、0.05mmol/L磷酸酸缓冲液液（pHH7.66、0.05mmol/L PB），ppH7.6、550%丙丙三醇磷磷酸缓冲冲液（GGPB），ppH7.2、00.111moll/L磷磷酸缓冲冲液（

40、ppH7.2、00.111moll/L PBB），配配制方法法见中华华人民共共和国国国家标准准（GBB/T 192200-20003）猪猪水泡病病诊断技技术附附录A（规规范性附附录）。1.3 稀释液液I、稀稀释液III，配配制方法法见中华华人民共共和国国国家标准准（GBB/T 192200-20003）猪猪水泡病病诊断技技术附附录B（规规范性附附录）。1.4 标准抗抗原、阳阳性血清清，由指指定单位位提供，按按说明书书使用和和保存。1.5敏敏化红细细胞诊断断液：由由指定单单位提供供，效价价滴定见见中华人人民共和和国国家家标准（GGB/TT 1992000-20003）猪猪水泡病病诊断技技术附附录

41、C（规规范性附附录）。1.6 被检检材料处处理方法法见中华华人民共共和国国国家标准准（GBB/T 192200-20003）猪猪水泡病病诊断技技术附附录E（规规范性附附录）。2 操作作方法2.1 使用标标准抗原原进行口口蹄疫AA、O、CC、Assia-I型及及与猪水水泡病鉴鉴别诊断断。2.1.1被检检样品的的稀释：把8只只试管排排列于试试管架上上，自第第1管开开始由左左至右用用稀释液液I作二二倍连续续稀释（即即1:66、1:12、11:2441:7688）,每每管容积积0.55 mLL。2.1.2按下下述滴加加被检样样品和对对照：2.1.2.11在血凝凝滴定板板上的第第一至五五排，每每排的第第

42、8孔滴滴加第88管稀释释被检样样品0.05 mL，每每排的第第7孔滴滴加第77管稀释释被检样样品0.05 mL，以以此类推推至第11孔。2.1.2.22每排的的第9 孔滴加加稀释液液I 00.055 mLL,作为为稀释液液对照。2.1.2.33每排的的第100孔按顺顺序分别别滴加口口蹄疫AA、O、CC、Assia-I型和和猪水泡泡病标准准抗原（11：300稀释）各各0.005 mmL，作作为阳性性对照。2.1.3 滴滴加敏化化红细胞胞诊断液液：先将将敏化红红细胞诊诊断液摇摇匀，于于滴定板板第一至至五排的的第110孔孔分别滴滴加口蹄蹄疫A、OO、C、AAsiaa-I型型和猪水水泡病敏敏化红细细胞

43、诊断断液，每每孔0.0255 mLL，置微微量振荡荡器上振振荡1分分钟22分钟,2035放置11.5小小时22小时后后判定结结果。2.2使使用标准准阳性血血清进行行口蹄疫疫O型及及与猪水水泡病鉴鉴别诊断断。2.2.1每份份被检样样品作四四排、每每孔先各各加入225L稀释释液III。2.2.2每排排第1孔孔各加被被检样品品25L，然然后分别别由左至至右作二二倍连续续稀释至至第7孔孔（竖板板）或第第11孔孔（横板板）。每每排最后后孔留作作稀释液液对照。2.2.3滴加加标准阳阳性血清清：在第第一、三三排每孔孔加入225L稀释释液III；第二二排每孔孔加入225L稀释释至1:20的的口蹄疫疫O型标标准阳性性血清；第四排排每孔加加入255L稀释释至1:1000的猪水水泡病标标准阳性性血清；置微型型混合器器上振荡荡1分钟钟2分分钟，加加盖置337作用330分钟钟。2.2.4滴加加敏化红红细胞诊诊断液：在第一一和第二二排每孔孔加入口口蹄疫OO型敏化化红细胞胞诊断液液25L；第第三和第第四排每每孔加入入猪水泡泡病敏化化红细胞胞诊断液液25L；置置微型混混合器上上振荡11分钟2分钟钟，加盖盖2035放置22小时后后判定结结果。3 结果