十三、炭疽防治技术规范.doc

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1、254十三、炭疽防治技术规范十三、炭疽防治技术规范炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。为预防和控制炭疽，依据中华人民共和国动物防疫法和其它相关法律法规，制定本规范。1 1 适用范围适用范围本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。2 2 诊断诊断依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断结果做出综合判定。2.1 流行特点本病为人畜共患传染病，各

2、种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。人也易感。患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。255本病呈地方性流行。有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。2.2 临床症状2.2.1 本规范规定本病的潜伏期为 20 天。2.2.2 典型症状 本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。牛：体温升高常达 41以上，可视黏膜呈暗紫色，心动

3、过速、呼吸困难。呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。急性病例一般经 2436 小时后死亡，亚急性病例一般经 25 天后死亡。马：体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明显。急性病例一般经 2436 小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达 38 天。羊：多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。病程稍长者也只持续数小时后死亡。猪：多为局限性变化，呈慢性经过，临床症状不明

4、显，常在宰后见病变。犬和其它肉食动物临床症状不明显。2.3 病理变化死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。淋巴结肿大、充血，切面潮红。脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑紫色。256严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。2.4 实验室诊断实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。2.4.1 病原鉴定2.4.1.1 样品采集、包装与运输按照 NYT561 2.1.2、4.1、5.1 执行。2.4.1.2 病原学诊断炭疽的病原分离及鉴定（见 NY/T561）。2.4.2 血清学诊断 炭疽沉淀

5、反应（见 NY/T561）。2.4.3 分子生物学诊断聚合酶链式反应（PCR）（见附件 1）。3 3 疫情报告疫情报告3.1 任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。3.2 当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。4 4 疫情处理疫情处理依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。4.1 当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及同群动物，限制移动。257对病死动物尸体，严禁进行

6、开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。4.2 确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。4.2.1 由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。疫 点：指患病动物所在地点。一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。疫 区：指由疫点边缘外延 3 公里范围内的区域。在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。受威胁区：指疫区外延 5 公里范围内的区域。4.2.2 本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动物立即进行强制免疫接种，并隔离观察 20 天。对病死动物及排泄物、可

7、能被污染饲料、污水等按附件 2 的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件 2）。疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。4.2.3 本病呈暴发流行时（1 个县 10 天内发现 5 头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下：4.2.3.1 疫点出入口必须设立消毒设施。限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。对疫点内动物舍

8、、场地以及所有运载258工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。其它易感动物紧急免疫接种。对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件 2 要求进行无害化处理。动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。4.2.3.2 疫区：交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。停止疫区内动物及其产品的交易、移动。所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。4.2.3.3

9、 受威胁区：对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。4.2.3.4 进行疫源分析与流行病学调查4.2.3.5 封锁令的解除最后 1 头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后 20 天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。4.2.4 处理记录对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。5 5 预防与控制预防与控制5.1 环境控制 饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合动物防疫条件审核管259理办法（农业部200215 号令）规定的动物防疫条件，建立严格的卫生（消毒）管理制度。5.2 免疫接种 5.

10、2.1 各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。5.2.2 使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。5.3 检疫5.3.1 产地检疫按 GB16549 和动物检疫管理办法实施检疫。检出炭疽阳性动物时，按本规范 4.2.2 规定处理。5.3.2 屠宰检疫按 NY467 和动物检疫管理办法对屠宰的动物实施检疫。5.4 消毒 对新老疫区进行经常性消毒，雨季要重点消毒。皮张、毛等按照附件 2 实施消毒。5.5 人员防护 动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和

11、手套，做好自身防护。260附件 1聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）技术）技术1 1 试剂试剂1.1 消化液消化液1.1.1 1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0)三羟甲基氨基甲烷 12.11g灭菌双蒸水 80mL浓盐酸 调 pH 至 8.0灭菌双蒸水 加至 100mL1.1.2 0.5M 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g灭菌双蒸水 80mL氢氧化钠 调 pH 至 8.0灭菌双蒸水 加至 100mL1.1.3 20% 十二烷基磺酸钠(SDS)溶液 (pH7.2)十二烷基磺酸钠 20g灭菌双蒸水 80mL浓盐酸

12、 调 pH 至 7.2灭菌双蒸水 加至 100mL1.1.4 消化液配制1M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH8.0) 2mL0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 0.4mL20% 十二烷基磺酸钠溶液(pH7.2) 5mL2615M 氯化钠 4mL灭菌双蒸水 加至 200mL1.2 蛋白蛋白酶酶 K 溶液溶液蛋白酶 K 5g灭菌双蒸水 加至 250mL1.3 酚酚/氯氯仿仿/异戊醇混合液异戊醇混合液碱性酚 25mL氯仿 24mL异戊醇 1mL1.4 2.5mmol/LdNTP dATP(100mmol/L) 20LdTTP(100mmol/L) 20LdGTP(

13、100mmol/L) 20LdCTP(100mmol/L) 20L灭菌双蒸水 加至 800L1.5 8pmol/L PCR 引物引物上游引物 ATXU（2 OD）加入 701l 灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2 OD）加入 697L 灭菌双蒸水溶解，分别取 ATXU、ATXD 溶液各 300L，混匀即为 8pmol/L 扩增引物。1.6 0.5 单单位位 Taq DNA 聚合聚合酶酶5 单位 Taq DNA 聚合酶 1L灭菌双蒸水 加至 10L现用现配。 1.7 10PCR 缓缓冲液冲液1.7.1 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0)262三羟基甲基氨基

14、甲烷 15.8g灭菌双蒸水 80mL浓盐酸 调 pH 至 9.0灭菌双蒸水 加至 100mL1.7.2 10 倍 PCR 缓冲液1mol/L 三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)( pH9.0) 1mL氯化钾 0.373g曲拉通 X-100 0.1mL灭菌双蒸水 加至 100mL1.8 溴化乙溴化乙锭锭(EB)溶液溶液溴化乙锭 0.2g灭菌双蒸水 加至 20mL1.9 电电泳泳缓缓冲液冲液(50 倍倍)1.9.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g灭菌双蒸水 80mL氢氧化钠 调 pH 至 8.0灭菌双蒸水 加至 100

15、mL1.9.2 TAE 电泳缓冲液(50 倍) 三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mlL0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL灭菌双蒸水 加至 1 000mL用时用灭菌双蒸水稀释使用1.10 1.5琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶 263琼脂糖 3gTAE 电泳缓冲液(50 倍) 4mL灭菌双蒸水 196mL微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液 20L。1.11 上上样缓样缓冲液冲液溴酚蓝 0.2g，加双蒸水 10mL 过夜溶解。50g 蔗糖加入 50ml 水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至 100mL。1.12 其它其它试剂试剂异丙醇(分

16、析纯)70%乙醇15mmoL/L 氯化镁灭菌双蒸水2 2 器材器材2.1 仪仪器器分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20冰箱、可调移液器（2L 、20L、200L、1000L）。2.2 耗材耗材眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL 一次性注射器、1.5 mL 灭菌离心管、0.2 mL 薄壁 PCR 管、琼脂糖、500 mL 量筒、500 mL 锥形瓶、吸头(10L、200L、1000L)、灭菌双蒸水。2.3 引物引物设计设计根据 GenBank 上已发表的炭疽杆菌 POX1 质粒序列，设计并合

17、成了以下两条引物：ATXU：5-AGAATGTATCACCAGAGGC-3 ATXD：5-264GTTGTAGATTGGAGCCGTC-3，此对引物扩增片段为 394bp。2.4 样样品的采集与品的采集与处处理理2.4.1 样品的采集病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血510mL，28保存，送实验室检测。2.4.2 样品的处理每份样品分别处理。2.4.2.1 组织样品处理称取待检病料 0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入 2mL 消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清 100L 加入 1.5 mL 灭菌离心管中，再加入 500L 消化液和 10L 蛋白酶 K 溶液，混匀后，

18、置 55水浴中 416h。2.4.2.2 待检菌的处理取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。取其悬液 100L 加入1.5mL 灭菌离心管中，再加入 500L 消化液和 10L 蛋白酶 K 溶液，混匀后，置 55水浴中过夜。2.4.2.3 全血样品处理待血凝后取上清放于离心管中，4 8000 g 离心 5 分钟，取上清100L，加入 500L 消化液和 10L 蛋白酶 K 溶液，混匀后，置 55水浴中过夜。 2.4.2.4 阳性对照处理取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。取其悬液 100L，置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入 500L 消化液和 10L 蛋白酶 K 溶液，混匀后，置 55水浴中

19、过夜。2652.4.2.5 阴性对照处理取灭菌双蒸水 100L，置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入 500L 消化液 10l 蛋白酶 K 溶液，混匀后，置 55水浴中过夜。2.5 DNA 模板的提取模板的提取2.5.1 取出已处理的样品及阴、阳对照，加入 600L 酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，12000g 离心 10 分钟。2.5.2 取上清置 1.5mL 灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中 3 分钟。取出样品管，室温融化，15000rpm 离心 15 分钟。2.5.3 弃上清，沿管壁缓缓滴入 1ml 70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上

20、1 分钟，真空抽干 15 分钟(以无乙醇味为准)。2.5.4 取出样品管，用 50L 灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。2.6 PCR 扩扩增增总体积 20l，取灭菌双蒸水 8l,2.5mmol/L dNTP、8pmol/L 扩增引物、15mmol/L 氯化镁、10PCR 缓冲液、0.5 单位 TaqDNA 聚合酶各 2L，2L 模板 DNA。混匀，作好标记，加入矿物油 20L 覆盖(有热盖的自动 DNA 热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为 94 3 分钟后，94 30s，58 30s，72 30s 循环 35 次，72延伸 5 分钟。2.7 电电泳泳将 PCR 扩增产物 15L 混合 3L

21、上样缓冲液，点样于 1.5%琼脂糖凝胶孔中，以 5V/cm 电压于 1TAE 缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。2.8 结结果判定果判定在阳性对照出现 394bp 扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)266时，试验结果成立。被检样品出现 394bp 扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。267附件 2无害化处理无害化处理1 1 炭疽动物尸体处理炭疽动物尸体处理应结合远离人们生活、水源等因素考虑，因地制宜，就地焚烧。如需移动尸体，先用 5福尔马林消毒尸体表面，然后搬运，并将原放置尸地及尸体天然孔出血及渗出物用 5%福尔马林浸渍消毒数次，在搬运过程中避免污染沿途路段。焚烧时将尸体垫起，用油或木

22、柴焚烧，要求燃烧彻底。无条件进行焚烧处理时，也可按规定进行深埋处理。2 2 粪肥、垫料、饲料的处理粪肥、垫料、饲料的处理被污染的粪肥、垫料、饲料等，应混以适量干碎草，在远离建筑物和易燃品处堆积彻底焚烧，然后取样检验，确认无害后，方可用作肥料。3 3 房屋、厩舍处理房屋、厩舍处理开放式房屋、厩舍可用 5%福尔马林喷洒消毒三遍，每次浸渍 2小时。也可用 20漂白粉液喷雾，200mL/m2作用 2 小时。对砖墙、土墙、地面污染严重处，在离开易燃品条件下，亦可先用酒精或汽油喷灯地毯式喷烧一遍，然后再用 5福尔马林喷洒消毒三遍。对可密闭房屋及室内橱柜、用具消毒，可用福尔马林熏蒸。在室温 18条件下，对每

23、 2530m3空间，用 10浓甲醛液（内含 37甲醛气体）约 4000mL，用电煮锅蒸 4 小时。蒸前先将门窗关闭，通风孔隙用高粘胶纸封严，工作人员戴专用防毒面具操作。密封 812 小时后，打开门窗换气，然后使用。熏蒸消毒效果测定，可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的纸片，放在含组氨酸的琼脂平皿上，待熏后取出置 37培养 24 小时，如无细菌生长268即认为消毒有效。也可选择其它消毒液进行喷洒消毒，如 4戊二醛（pH8.08.5）2 小时浸洗、5甲醛（约 15福尔马林）2 小时、3 H2O22 小时或过氧乙酸 2 小时。其中，H2O2和过氧乙酸不宜用于有血液存在的环境消毒；过氧乙酸不宜用于金属器械消毒。4

24、 4 泥浆、粪汤处理泥浆、粪汤处理猪、牛等动物死亡污染的泥浆、粪汤，可用 20漂白粉液 1 份（处理物 2 份），作用 2 小时；或甲醛溶液 50100ml/m3比例加入，每天搅拌 12 次，消毒 4 天，即可撒到野外或田里，或掩埋处理(即作深埋处理)。5 5 污水处理污水处理按水容量加入甲醛溶液，使其含甲醛液量达到 5，处理 10 小时；或用 3过氧乙酸处理 4 小时；或用氯胺或液态氯加入污水，于 pH4.0时加入有效氯量为 4mg/L，30 分钟可杀灭芽孢，一般加氯后作用 2 小时流放一次。6 6 土壤处理土壤处理炭疽动物倒毙处的土壤消毒，可用 5甲醛溶液 500mL/m2消毒三次，每次

25、2 小时，间隔 1 小时。亦可用氯胺或 10漂白粉乳剂浸渍2 小时，处理 2 次，间隔 1 小时。亦可先用酒精或柴油喷灯喷烧污染土地表面，然后再用 5甲醛溶液或漂白粉乳剂浸渍消毒。7 7 衣物、工具及其它器具处理衣物、工具及其它器具处理耐高温的衣物、工具、器具等可用高压蒸汽灭菌器在 121高压蒸汽灭菌 1 小时；不耐高温的器具可用甲醛熏蒸，或用 5甲醛溶液浸渍消毒。运输工具、家具可用 10漂白粉液或 1过氧乙酸喷雾或擦拭，作用 12 小时。凡无使用价值的严重污染物品可用火彻底焚269毁消毒。8 8 皮、毛处理皮、毛处理皮毛、猪鬃、马尾的消毒，采用 9798的环氧乙烷、2的CO2、1的十二氟混合液体，加热后输入消毒容器内，经 48 小时渗透消毒，启开容器换气，检测消毒效果。但须注意，环氧乙烷的熔点很低（0），在空气中浓度超过 3，遇明火即易燃烧发生爆炸，必须低温保存运输，使用时应注意安全。骨、角、蹄在制作肥料或其它原料前，均应彻底消毒。如采用121高压蒸汽灭菌；或 5甲醛溶液浸泡；或用火焚烧。