乙酰蒲公英萜醇影响hepg2细胞增殖、凋亡及迁移的实验研究.docx

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1、学术学位硕士学位论文 单位代码： 10678 学 号： 2013496 分类号： R735.7 密级： 硕上学位论文 乙酰蒲公英萜醇影响 HepG2 细胞增 殖、凋亡及迁移的实验研究 院（系 )、所 昆明医科大学第二临床医学院 研究生姓名 _ us _ 学 科 专 业 外科学 学 位 类 型 学术学位 指 导 教 师 王琳教授 二一六年五月 尾 4S 科犬甞 硕士学位论文 乙酿蒲公英陡醇影响 HepG2 细胞增 殖、凋亡及迁移的实验研究 院（系 )、所 昆明医科大学第二临床医学院 研究生姓名 _ mm _ 学 科 专 业 外 科 学 学 位 类 型 学术学位 指 导 教 师 _ 干 琳教授 _

2、 指导小组成员 李晓主任医师 李越牮副主任医师 基金项目 国家自然科学基金 (40113042) 完 成 日 期 二 一 六年五月 昆明医科大学研宄生学位论文研究撰写声明 本人郑重声明：本学位论文是我本人在导师指导下，独立进行学位课題研宄 所取得的研宄成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人或其他 机构己经发表或撰写过的研宄成果。对本研宄和论文做过贡献的同道我均在论文 中作了明确的说明并表明谢意。该学位论文资料若有不实之处，本人愿承担一切 相关责任。 论文作者（签名 ） ： 年 5 月 日 昆明医科大学研宄生学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解昆明医科大学有关保留、使用学

3、位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査 阅和借阅。学校可公布论文的全部或部分内容 （ 确属保密内容己注明，并在解密 后遵守此规定 ）； 学校可采用影印、缩印或其他手段保存本学位论文。 学位论文作者（签名 ） ； tid 指导教师（签名 ） ： 年 5 月 S。 曰 厶 4 年 5 月 。曰 本人及导师同意将学位论文提交至清华大学 中国学术期刊（光盘版）电 子杂志社 进行电子和网络出版，并编入 CNKI 系列数据库，传播本学位论文的 全部或部分内容，同意按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规 定享受相关权益。 学位论文作者（签名 ） ： 指

4、导教师（签名 ） ： 如吒年 $ 月 k 日 年 孓 月 ？ 。日 目 录 缩略词表 (以字母顺序排列） . 1 中文摘要 . *2 英文摘要 . 0.05),差异无统计学意义。 【结 论】乙酰蒲公英萜醇能抑制体外培养的人肝癌 HepG2 细胞生长，且在 一定浓度下对正常肝细胞活力无显著影响；乙酰蒲公英萜醇对人肝癌 HepG2 细 胞有抑制迁移及侵袭的作用 ;乙酰蒲公英萜醇能通过选择性的下调 Bcl-2,上调 Bax， 激活 Caspase-3,诱导人肝癌 HepG2 细胞凋亡 ;乙酰蒲公英萜醇可能通过选 择性抑制 PI3k/AKT 通路促进人肝癌细胞 HepG2 凋亡。 关键词 ：乙酰蒲公英

5、萜醇；肝癌细胞；凋亡；迁移 Experimental study on the effect of Taraxeryl acetate on proliferation, apoptosis and migration of HepG2 cell PostgraduateiMENG Xu Supervisor:Prof. WANG Lin ABSTRACT ObjectivezTo explores the influence of Taraxeryl acetate on the proliferation, migration, invasion, apoptosis and expres

6、sion of relative protein of HepG2 cell culture in vitro ,and makes prelinminary discussion on the anticancer function and molecular mechanism of dandelion, provide theoretical basis for the Taraxeryl acetate anticancer. Methods: Different concentration of Taraxeryl acetate drugs on HepG2 cell and BR

7、L-3a cell in vitro for 24 hours. Applying MTT to detect the influence of different concentration of dandelion on the cell inhibit rate; Applying Scratch Assay and Transwell Chambers to detect the influence of Taraxeryl acetate on the cell migration and invasion of HepG2 cell; Applying Tunel staining

8、 to detect the influence of Taraxeryl acetate on the apoptosis of HepG2 cell; Applying Western blot to detect the influence of Taraxeryl acetate on the expression lever of Bcl-2, Bax， Caspase-3, PI3K, AKT, p-AKT protein. Results: 1. Determined by MTT colorimetric method results: Compared with the bl

9、ank control group, the Taraxeryl acetate drugs inhibit proliferation of HepG2 cells, and with the increase of the concentration, which the IC50 is 0.69mg/ml. The Taraxeryl acetate drugs also inhibit proliferation of BRL-a cell, which IC50 is 6.54mg/ml.2. Scratch Assay result: Compared with blank con

10、trol group, the Taraxeryl acetate treatment group of HepG2 cell migration distance is shorter by 24 hours. Compared with blank control group, the Taraxeryl acetate treatment group has significant difference with it (P 0.05). The expression of Bel - 2, PI3K and p - AKT were cut but Bax and Caspase-3

11、were raised in HepG2 cell group. HepG2 group have significant difference with it compared with the BRL - 3 group (P G2 细胞 +乙酰蒲公英萜醇及正常肝细胞 +乙酰蒲公英萜醇，四组细胞中 Bcl-2、 Bax、 Caspase-3 蛋白的表达水平。 B、 C、 D 分别为 Bel-2、 Bax、 Caspase-3 蛋白表达与内参的灰度比柱状图。 *表示户 AKT and p-AKT (ser473) expression of HepG2 cell A 为正常肝细胞、 HepG

12、2 细胞、 HepG2 细胞 +乙酰蒲公英萜醇及正常肝细胞 +乙酰蒲公英萜醇，四组细胞中 PI3K、 AKT、 p-AKT (ser473)蛋白的表达水平。 B、 C、 D 分别为 PI3K、 AKT、 p-AKT (ser473)蛋白表达与内参的灰度比柱状 图。 （ *表示户 0.05)。其 余蛋白的表达水平均无明显差别。结果说明乙酰蒲公英萜醇可能并不影响正常肝 细胞的凋亡。 四、讨论 肝细胞癌 (HCC)是全世界癌症死亡的第三大主要原因，是全世界最常见的恶 性肿瘤之一。我国肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，每年全世界肝癌新增 病例和死亡病例有一半发生在中国 1。目前肝癌的主要治疗方法有很

13、多，如手术 切除、射频消融、放化疗、肝移植等，其中早期手术治疗可有效延长患者生存率， 是肝癌的主要治疗策略，但仅有 20%-30%的肝癌患者能在早期确诊肝癌并接受 手术治疗14。由于起病隐匿，早期症状轻，大多数患者在确诊时已是中晚期从而 失去手术根治的机会，多数肝癌晚期患者在确诊后因得不到有效的治疗或因不耐 受放化疗仅数月内便死亡 5。药物治疗是治疗肝癌的重要方法，但目前大多数扬 : 癌药物都有生物利用度低，选择性差等缺点，它们可能同时作用于肿瘤细胞及正 常细胞，造成肝肾损伤，且容易产生耐药 li。 肝癌的死亡率一直居高不下，目前 仍然没有能有效治疗和预防肝癌的药物。 fel 此，寻找和开发新

14、药物预防和治疗肝 癌是必要的。 H 印 G2 来源于一个 15 岁白人的肝癌组织，该细胞系能表达甲胎蛋白、白蛋 白、 a-2-巨球蛋白、 a-1-抗胰蛋白藤、转铁蛋白等，由于来源于肝母细胞瘤、 且在体外培养表型、性状稳定，因此该细胞系被广泛应用于体外培养 实验中，尤 其是用于肝细胞代谢方面的研究。目前已广泛应用于细胞凋亡 21、细胞侵袭能 力以及药物研究 12241。 1. 乙酰蒲公英萜醇对人肝癌细胞的增殖有抑制作用 中草药、植物药等天然产物中存在着广泛的生物活性物质，这些生物活性物 质可以选择性抑制肿瘤细胞增殖 25。随着研究的不断深入，中药抗癌作用日益 受到医药界的关注，从中草药、植物药中

15、寻找作用效果好且毒副作用小的抗肿瘤 药物以及抗肿瘤辅助药物的研究已经成为近年来的研究热点。蒲公英作为中草药 的一种，在我国分布广泛，遍及全国多数地度，资源丰富。其性苦、甘、寒，全 30 草均可入药，药理研究表明具有抑制细菌生长、抗肿瘤、保肝利胆、抗氧化、抗 炎、利尿、促进免疫、抗过敏、抗血栓、降血脂、健胃等作用 【 26。目前蒲公英 在临床上应用越来越广泛。蒲公英提取物已被美国 FDA 批准为一类 GRAS (基 本上认可安全 ） 的食物成分。近年来药理研究表明，蒲公英所含的乙酰蒲公英萜 醇等三萜类物质能诱导肿瘤细胞凋亡并阻滞肿瘤细胞的增殖周期进程从而对肿 瘤细胞增殖起到抑制作用，同时还有抑制

16、肿瘤细胞侵袭、转移的作用 27;而黄 酮类化合物主要机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期抑制肿瘤细胞的增 殖，同时有抑制肿瘤新生血管、调节免疫、抗氧化抗自由基等作用，以达到抗肿 瘤的目的 28。据报道蒲公英中多糖类占其干重的 30%-50%，杨晓杰等 291观察蒲 公英多糖对肝癌细胞的作用，结果发现蒲公英多糖能抑制肝癌细胞增殖，并能显 著拮抗环磷酰胺诱发的微核突变。本实验以研究较为广泛、普遍被采用的人肝癌 HepG2 细胞为研究对象，检测了乙酰蒲公英萜醇对 HepG2 细 胞活力的影响，探 究其是否具有抑制肿瘤细胞生长、杀伤癌细胞的作用，结果发现，乙酰蒲公英萜 醇能有效降低人肝癌 HepG

17、2 细胞活力，且随着浓度的增加抑制效果不断增强。 同时为了更好的为乙酿蒲公英萜醇的开发利用提供依据，本实验相同浓度的乙酰 蒲公英萜醇作用于大鼠正常肝细胞 BRL-3a,结果显示乙酰蒲公英萜醇对正常肝 细胞也具有一定的抑制作用，但是作用有效浓度要高于肝癌细胞。乙酰蒲公英萜 醇浓度 lcm 的标准，但只要保证手术切缘阴性，则对预后无明显影响，即可视为根 治性 （ R0)切除 12。手术方式选择应考虑尽可能多地保留正常肝组织。预留肝 # 保留相当于 30%正常肝或 30% 40%病肝 (肝硬化肝脏和化疗损伤严重肝脏 )。术 前可经 CT、 MRI 检查进行预测以确定预留肝脏体积。同时尽可能清除可切除

18、的 肝门部淋巴结和肝外转移灶 13。肝外转移灶的手术切除标准目前尚无共识，可 0.05)。当 CRLM 病灶为多发且 2cm， # 切除较 RFA可获得更好的生存率，差异有统计学意义。 RFA 治疗 CRLM 的肝脏 局部复发率为 1.7%66.7%,不同研究报道差异较大，可能原因为各项研究的入 选标准不同。手术切除治疗 CRLM的局部复发率为 1.2% 10.4%24_26。可见在 部分经选择的病例（如单个肿瘤及最大径小于 2cm者） RFA 可以获得与肝切除 相似的治疗效果。目前临床常用 RFA 伩器的一次性消融范围最多为 5 c m， 在 治疗 3 c m 的病灶往往 需要采用重叠覆盖消

19、融策略。在多次重叠覆盖消融中，因组织干燥碳化，更易残 留活性病灶而影响预后。故 RFA 目前多用来处理一般情况不适宜或不愿意接受 手术治疗的可切除 CRLM 病例：或预期术后残余肝脏体积过小，先肝切部分较 大转 移灶，然后在术中或术后经皮 RFA 处理较小的转移灶。 2.2RFA 治疗途径的选择：经皮途经、腹腔镜途经及术中途径 RFA 经皮途径与其它途径相比有创伤较小、并发症较轻、可在门诊进行、 费用相对较低、仅需清醒下的麻醉、可反复应用等优点。然而，与经皮途径相比， 经腹腔镜及开腹术中对肝脏 RFA 也有一些独特的优势：可将高频探头放置于肝 脏表面消融病灶，且避免了对肠道及周围其他重要脏器影

20、响，另外可对肝脏全貌 进行超声检查，可对肝脏较小肿瘤进行观察及治疗，而用其它影像技术往往难于 做到这一点。 Vigan 等 27对行肝切除术的 CRLM 患者施行腹腔镜术中超声与开 腹术中超声检查结果显示，用腹腔镜超声可对肿瘤进行更准确的分期。用腹腔镜 超声可识别术前未能用其它手段检测出的表面肿瘤或腹膜种植，从而更改原计划 的射频消融，更好的清除病灶。 腹腔镜途径的劣势包括治疗过程中损伤略大、相关的并发症、额外费用且增 加了治疗的技术难度。电极针布针可能会出现问题。腹腔镜超声探头较昂贵，在 我国应用极少，且目前尚无缚于腹腔镜超声探头的针引导装置，因此射频针不能 与超声探头平行地刺入肿瘤。最常见

21、的做法是， 电极针与超声探头垂直或倾斜。 以这样的角度操作电极针，从技术上讲是个挑战，不易掌握。 也有一些作者发表了他们在开腹术中应用射频消融的经验。在开腹的情况 下，能更准确地进行肿瘤分期；可以使射频电极针和超生探头有更大的活动自由 度；某些病灶如临近肠、胆囊、膈肌等位置的病灶可被移开从而较为容易治疗， 并能减少消融时的副损伤；可短暂阻断门静脉及肝动脉，使肝血运减少从而降低 转移灶及临近肝组织，从而使射频消融能造成更多的热毁损灶，有利于清除癌组 织。当然，开腹射频消融也有不足之处，例如治疗费用较高，恢复时间较长，有 全身麻醉的相关风险，并发症较多等，并且开腹射频消融手术多数只能进行一次。 综

22、上，本文综述了肝切手术与 RFA 治疗 CRLM 各自的适应症、优缺点及肿 瘤学效果。目前肝切手术仍是治疗 CRLM 可切除转移灶的首选方法。但在部分 精心选择的病例（如肝内单个肿瘤，直径小于 2cm) RFA 可以获得相似的肿瘤 学治疗效果。另外 RFA 多用于不能肝切手术及术后复发 CRLM 患者的治疗。 参考文献 1 朱德祥，任黎，许剑民 .中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南 （ V2013)解析 . 中华胃肠外科杂志 .2014.17 (6): 525-529. 2 Kemeny N. Management of liver metastases from colorectal ca

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37、aparoscopic and open intraoperative ultrasonography for staging liver tumour. Br J Surg. 2013. 100(4): 535-542. 攻读学位期间获得的学术成果 蒙旭，王琳 .结直肠癌肝转移微创治疗与手术治疗的比较 .昆明医科大学学报 . 2015.,36(2B):82-85 致谢 本研究及论文的完成离不开我的导师王琳教授的悉心指导，在此谨向王老师 致以诚挚的感谢和崇高的敬意！在硕士研究生三年的学习生活中，王老师以他严 谨务实的治学态度、精益求精的工作作风和平易近人的长者风范给我留下了深刻 的印象，这些使

38、我获益匪浅，并将成为我努力实现自己人生价值的动力。 在科研方面，不管是课题选择、项目完成还是论文撰写，王老师都为我提供 了细心的指导和优越的条件，使我得以充分在所研究的知识海洋里遨游；在临床 工作和生活方面，王老师也给予我无微不至的关怀和爱护，给我创造良好的学习 条件，让我有充分的机会 全面提升自己的临床知识和专业技能，为今后的工作打 下良好基础；王老师还在思想上、人生态度和意志品质方面给予我谆谆教诲，这 些教益必将激励着我在今后的人生道路上奋勇向前。 真诚感谢昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科二病区的张小文老师、李晓 老师、朱红老师、李越华老师、王現老师及科室全体老师，他们不仅在临床实践 中

39、教导我，传授我专业知识，还在生活中关心、帮助我，给我营造轻松的学习氛 围、搭建良好的学习平台，让我收获知识的同时也学到不少为人处世之道。 真诚感谢鲍师兄、柯师兄、同门陈莉及所有师兄、师姐、师弟、师妹对 我的 关心和帮助，没有他们的支持我无法顺利完成我的课题。 衷心感谢我的父母对我的支持和理解，没有他们的辛劳与付出，我无法完成 现在的硕士学业。 衷心感谢所有朋友和 2013 级附二院学术二班的所有同学，因为他们的陪伴 和鼓励，我的学习生活才显得充实丰富、无比精彩。 最后，衷心感谢昆明医科大学研究生部的老师及曾经教育和帮助过我的所有 老师；衷心感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们！