紫花牡荆素对胃癌sgc-7901细胞增殖的影响及机制研究.pdf

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1、 分类号 密级 U D C 编号 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 紫花牡荆素 对 胃癌 SGC-7901 细胞 增殖的影响及 机制研究 研究生姓名 ： 王刚 指导教师姓名、职称 ： 姜浩 教授 学科专业名称 ： 肿瘤 学 研究方向 ：肿瘤分子药理 2010 年 12 月 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或 其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结

2、果由本人承担。 作者签名： 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文是本人在南华大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查 阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文

3、收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。 作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 南华大学学位论文原创性声明 一、主要英文缩略语索引 1 二、中文摘要2 三、英文摘要 3 四、论文正文 1. 前言 5 2 材料与方法 7 3 实验 结果1 5 4 讨论 36 6 结论 42 五、参考文献 43 六、综述 47 七、攻读硕士期间发表的论文 56 八、致谢 57 目 录 主要英文缩略语索引 Bax Bcl-2 Assaciated X protein Bcl-2 相关 X 蛋白 Bcl-2 B cell lymphoma/lew

4、kmia-2 B 细胞淋巴瘤 /白血病 -2 基因 DMEM Dulbeccos modified Eagles medium Dulbecco 极限必需培养基 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 DEPC Diethlphrocarbonate 焦碳酸二乙酯 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 PAGE polyacrylamide gel electrophroesis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟 PB

5、S Phosphate buffer solution 磷酸盐缓冲液 rpm revolutions per minute 每分钟转数 RT-PCR ReverseTranscription- Polymerase Chain Reaction 逆转录聚合酶链式反应 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 WB Western Blotting 蛋白质免疫印迹 紫花牡荆素对人胃癌 SGC-7901 细胞增殖的影响 及 机制研究 研 究 生： 王 刚 指 导 教 师： 姜 浩 教授 中 文 摘 要 目的 : 观察紫花牡荆素 对人 胃癌 SGC-7901 细胞 增殖的

6、影响，初步探讨其抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。 方法 ： MTT 比色 法 ， 检测 紫花牡荆素对 人 胃癌 SGC-7901 细胞 生长的抑制； FITC 标记Annexin-V/PI 双染流式细胞术，分析凋亡细胞百分率； RT-PCR 方法， 检测 紫花牡荆素对Bcl-2/Bax mRNA 表达的影响； Western Blotting 方法， 检测 紫花牡荆素 对 Bcl-2/Bax 蛋白表达的影响。 结果 ： MTT 比色结果显示， 紫花牡荆素能呈浓度依赖性抑制 SGC-7901 细胞 的增殖，不同浓度的紫花牡荆素 （ 1.0g/mL、 2.0g/mL、 4.0g/mL、 8.0g/mL

7、、 16.0g/mL） 处理SGC-7901 细胞 48h 后，其细胞增殖抑制率分别为 19.78%、 29.79%、 47.47%、 55.62%、 60.32%。 FITC 标记 Annexin-V/PI 双染流式细胞术结果表明： 紫花牡荆素诱导 SGC-7901 细胞 凋亡百分率增 高（ P0.1M 的蔓荆子黄素处理 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞均能产生增殖抑制作用，但这种作用可以被逆转。此外，紫花牡荆素也可以抑制某些癌症细胞系的生长，比如 EL-4 和 P815.9细胞系 20。提示紫花牡荆素可能对炎症和免疫调节失调比如风湿性关节炎和淋巴瘤有一定的治疗意义。 Mesaik 21等 发现

8、紫花牡荆素具有有效的免疫调节功能和细胞毒性。在体外检测其趋药性， T 细胞增殖活性以及细胞毒性时发现，紫花牡荆素对单核细胞氧化迸发具有显著的抑制作用并呈剂量依赖性， 能 对高浓度 fMLP 刺激嗜中性粒细胞产生的化疗毒性 产生 明显的抑制作用，也 能 明显缓解植物血球凝集素对 T 细胞产生的刺激作用。 在抗癌方面， Shen22等在研究紫花牡荆素抗白血病的作用及其分子机制中发现，紫花牡荆素能抑制多种白血病细胞的增殖， 如 K562， Kasumi-1，和 HL-60 细胞系，并呈时间和剂量依赖性。孵育 48 小时后，紫花牡荆素对 K562， HL-60 和 Kasumi-1 细胞系的 IC50

9、分别为 5.95M， 4.82M和 15.56M。细胞周期分析证明紫花牡荆素处理能导致细胞在 G2/M期明显 停滞 ，并伴随 P21waf1 和 P27kip1 表达上调。处理 12 小时后，细胞生长停滞于 G2/M的百分数达到最大值（ 75.3%），也能观察到有丝分裂障碍和聚合微管蛋白的下调。结果证明了紫花牡荆素能通过诱导凋亡和有丝分裂障碍引起白血病细胞死亡，并能使 PI3K/AKT 抑制剂增强，提示紫花牡荆素可能对治疗白血病有作用 22。 Kobayakawa J14等人从单叶蔓荆中分离出紫花牡荆素，青蒿亭，六羟黄酮和 5,3-二羟基 -6,7,4-三甲氧苯酰胺等类黄酮分析其抗肿瘤作用时发

10、现，与其它类黄酮相比，紫花牡荆素显著抑制 KB 细胞生长，并导致细胞停滞于 G2/M 期。同时紫花牡荆素不抑制类似正常细胞的 A431， 3T3 Swiss Albino 和TIG-103 细胞增殖。由此提示紫花牡荆素诱导的 G2/M 期停滞可能与其抗有丝分裂活性相关，对特定肿瘤具有抗肿瘤作用并具有较小副作用。 Ono23发现紫花牡荆素对人类肺癌细胞和人类结 肠癌细胞较强的生长抑制活性。另外，从黄荆中分离出来的紫花牡荆素还有抗脂氧合酶的活性 25。 因此我们首先用 MTT比色法检测紫花牡荆素对 SGC-7901细胞增殖的影响，结果显示，紫花牡荆素明显抑制 SGC-7901 细胞的增殖，不同浓度

11、的紫花牡荆素处理 SGC-7901 细胞后，随时间和剂量的增加，。各浓度处理组的细胞增殖抑制率与空白对照组相比均显著增加（ P0.05）。实验证实紫花牡荆素对 SGC-7901 细胞的增殖具有明显的抑制作用，且 呈显著的浓度 -效应依赖性。 SGC-7901 细胞增殖抑制率也逐渐增加。 细胞凋亡 （ Apoptosis） 在生物进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡类型，具有重要的生物学意义及复杂的 分子生物学机制。凋亡是多 基因 严 格控制的过程 ， 如 Bcl-2 家族、 caspase 家族、 癌基因 如 C-myc、抑癌基因 P53 等，但是

12、迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的 发生 有直接或间接的关系 ， 如肿瘤、自身免疫性疾病等。 为了进一步区分晚期凋亡和死亡细胞 ，我们采用 FITC 标记 Annexin-V/PI 双染流式细胞术分析紫花牡荆素对SGC-7901 细胞凋亡的影响，实验结果显示，不同浓度的紫花牡荆素作用于 SGC-7901 细胞12h、 24h 和 48h 后，其凋亡率逐渐增加。其中，紫花牡荆素在 48h 诱导 SGC-7901 细胞凋亡的作用最明显，但其促凋亡作用小于羟基喜树碱。 Bcl-2 原癌基因（ B 细胞淋巴瘤 /白血病 -2， B cell lymphoma/lew

13、kmia-2）是 1984 年Tsujmoto 等 26首次克隆于携带 t (14； 18) (q32； q21)染色体易位的 滤泡性非霍杰金淋巴瘤细胞系。它定位于 18q21，含 3 个外显子，在特异的 t （ 14； 18）染色体易位中， Bcl-2 基因转位于 14 号染色体免疫球蛋白重链 JH 片段，致 Bcl-2 基因表达失控，其编码分子量为26KD 的蛋白质。这种蛋白质位于细胞的线粒体膜、核膜和内质网膜上它不仅存在于 T 及 B 淋巴细胞，还存在于未成熟的造血细胞、上皮细胞、神经细胞及多种癌株中 27。至于其抗凋亡机制可能有以下几种：（ 1） Bcl-2 与促凋亡蛋白 Bax 结合

14、成异二聚体，从而抑制后者的生物活性 28。（ 2） Bcl-2 蛋白作为一种抗氧化剂调节细 胞的氧化还原状态 29。（ 3） Bcl-2蛋白抑制细胞内钙离子的重新分隔，以阻断某些因素的促凋亡过程 30。（ 4） Bcl-2 蛋白与线粒体 ATP 产量正相关 31。 Lee32等研究认为单独的 Bcl-2 基因的高表达并不能引起细胞增殖或诱发转化，但它可以同 c-myc、 p53、 fas 等基因协同作用，在一定条件下， c-myc 过度表达，可以迅速导致凋亡的发生，若有 Bcl-2 联合表达，则会阻止 c-myc 引发的凋亡。 Forones 等 33研究了 22 例胃癌和 22 例肠化胃黏膜

15、标本中 Bcl-2 基因蛋白的表达情况，结果表 明 Bcl-2 基因蛋白在胃癌中的阳性表达率约为 45%，而且 Bcl-2 在早期胃癌中的表达率比进展期的高，因此认为Bcl-2 基因在胃癌的早期阶段起重要作用。 Pan 等 34报道 1196 例日本早期胃癌 Bcl-2 表达与淋巴结转移的关系，结果显示 Bcl-2 表达增加更易导致胃癌的浸润发展和淋巴结转移。Anagnostopoulos 等 35检测 145 例慢性浅表性胃炎，萎缩性胃炎，肠化和不典型增生胃黏膜中 Bcl-2 的表达情况，发现在慢性浅表性胃炎中没有 Bcl-2 的表达，而在肠化和不典型增生组织中有异常表达，考虑 Bcl-2

16、的 过度表达是胃癌发生过程中的早期事件。 Muller36等对413 例胃癌标本进行免疫组化分析，结果有 47 例 Bcl-2 表达阳性， 95%的 Bcl-2 阳性胃癌为肠型胃癌，所有弥漫型胃癌和印戒细胞癌 Bcl-2 表达均为阴性。以上研究提示， Bcl-2 在胃癌的发生过程中可能发挥重要作用，而且抑制其在胃癌发生过程中表达可能成为潜在的治疗途径。而本实验结果发现，紫花牡荆素能抑制 SGC-7901 细胞增殖并诱导其凋亡，提示紫花牡荆素可能成为治疗胃癌的新药物。 Karnak D37等研究前列腺癌化疗耐受中发现，晚期前列腺癌中的雄激素非依赖性是化疗耐受发生的机制之一，而抗凋亡蛋白 Bcl-

17、2， Bcl-xL 和 Mcl-1 的高表达是这种转变发生的标志。减少 Bcl-2/xL/Mcl-1 蛋白的表达可以增加细胞对化疗的敏感性，用小分子抑制剂阻断相关异二聚体具有重要的临床价值。如何通过多种途径，包括 Bcl-2/xL/Mcl-1，来减弱癌症细胞的存活能力，并使得细胞死亡成为化疗的唯一疗效有待进 一步研究。 Shankar E38等在研究乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡机制中发现， PKC（蛋白激酶 C）高表达能增加抗凋亡基因 Bcl-2 表达。 PKC 是一种改造致癌基因，同时也是重要的抗凋亡蛋白，其高表达还能减少促凋亡基因 Bid 表达，减弱肿瘤坏死因子相关凋亡诱导级联反应（ T

18、RAIL） 介导的凋亡。用 siRNA 沉默 PKC 或 Akt，都可以引起 Bcl-2 蛋白和转录水平的降低。然而，敲除 PKC 而不敲除 Akt，也能引起 Bcl-2 蛋白和转录水平的降低。此外，敲除 PKC能减弱 CREB（ cAMP 应答元件结合蛋白）在丝氨酸 133 位点的磷酸化， siRNA 沉默 CREB也能引起 Bcl-2 蛋白和转录水平的降低。此外，敲除 CREB 能增加细胞对 TRAIL 介导凋亡的敏感性。由此提示 PKC 可能通过激活转录因子 CREB 的表达调节 Bcl-2 的产生。由此提示， Bcl-2 表达降低可能受某些细胞因子或信号通路的影响，而我们的结果显示，紫

19、花牡荆素处理 SGC-7901 细胞后，能使 Bcl-2 表达显著降低。而紫花牡荆素是否通过以上细胞因子或信号通路影响 Bcl-2 表达，还是直接影响 Bcl-2 表达，其机制有待进一步研究。 Bcl-2 相关蛋白 X（ Bcl-2 Associated Protein X）即 Bax 是第一个从有 t（ 14； 18）易位的人 B 细胞发现的与 Bcl-2 共免疫沉淀的蛋白。 Bax 基因定位于染色体 19q13.3-19q13.4，与 Bcl-2 约有 21%的氨基酸序列同源。研究显示， Bax 由 9 条螺旋组成，其 BH3 结构域位于 2 螺旋，对与其他凋亡相关蛋白的结合以及线粒体膜定

20、位都起着关键作用。在生 理状态下。大多数 Bax 蛋白是以单体的形式定位于细胞浆中，少部分定位于内质网等细胞器。当细胞收到凋亡信号后， Bax N 末端的 1 螺旋暴露，并引导 Bax 定位到线粒体外膜上与自然定位于线粒体外膜上的 Bak 蛋白共同发挥其促凋亡的作用。即通过介导线粒体膜上的膜通透性孔道 (permeability transition pore， PT 孔 )的开放将细胞色素 C 等凋亡前体物质释放到胞浆中的。而 Bcl-2 可通过与 Bax 竞争性地与 ANT(线粒体内膜上的腺苷酸转运蛋白 )结合，或者直接阻止 Bax与 ANT和 VDAC(线粒体外膜上的电压 依赖性阴离子通

21、道 )的结合来发挥其抗凋亡效应 39-41。本研究发现紫花牡荆素诱导 SGC-7901 细胞凋亡过程中，随着紫花牡荆素的剂量增大和处理时间延长， Bax 表达呈剂量 -时间依赖性上调，提示 Bax 表达上调与胃癌发生有关，与上述研究一致。 诸多研究表明 Bcl-2 和 Bax 可形成同源二聚体，也能相互作用为异源二聚体形式。当Bax 蛋白以异源二聚体形式存在时，细胞趋向存活，但如果 Bax 蛋白大量表达与 Bcl-2 蛋白形成异源二聚体并自身形成同源二聚体，则细胞趋向死亡。 Bax 过度表达，细胞死亡增多，而 Bcl-2 过度表达时 ，它与 Bax 结合，死亡被抑制。 Bax/Bcl-2 异源

22、二聚体及 Bax/Bax同源二聚体的比率在细胞生与死之间起关键作用，因此说 Bcl-2 与 Bax 比例是决定细胞凋亡敏感性的变阻器 42。当细胞内 Bcl-2 较多时， Bcl-2 和 Bax 的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱；当细胞内 Bax 较多时，则 Bax 本身形成的同源二聚体占主导，则易于发生凋亡。 Bcl-2/Bax 比值对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。死亡信号能激活 bax，使 Bax 从细胞浆移位到线粒体膜上。 Bax 在移位到线粒体膜上后，很快形成同源二聚体，促进凋亡，而 Bcl-2 则在 Bax 诱发凋亡过程中对其功能进行限制。 Bax 促进凋亡的机理主要是：线粒体渗

23、透性转换、氧化磷酸化和 ATP 的合成功能被破坏；细胞氧化还原作用改变；线粒体中的凋亡相关分子 Apaf-1 释放出来，与细胞色素 C 相互作用，激活胱冬肽酶 (caspase)信号转导途径。 Sawada 等 43对脑神经胶质瘤的研究发现 Bcl-2/Bax 比值增大时抑制细胞凋亡，否则促进细胞凋亡。其进一步研究认为 Bcl-2 过分表达能抑制线粒体中的细胞色素 C释放到胞液和降低 Caspases 活性，从而阻断神经酰胺介导的凋亡途径来抑制细 胞凋亡，而Bax 通过加速线粒体中细胞色素 C 的释放和增加 Caspases 活性来促进细胞凋亡 43,44。李征45等用 S-P 法观察 42

24、例骨肉瘤中 Bcl-2/Bax 蛋白表达情况表明在骨肉瘤不同病理级别中，随着病理分级的升高， Bax 蛋白表达的阳性率成下降趋势，但各级之间无显著性差异， Bax蛋白表达的阳性率不能完全反应骨肉瘤的恶性程度。 Bcl-2 蛋白表达阳性组中 Bax 蛋白阳性率显著高于 Bcl-2 蛋白表达阴性组，可以认为 Bax 蛋白在骨肉瘤中的表达与 Bcl-2 蛋白表密切相关。 Hasnan J46等也发现，长期高 血糖可诱导糖尿病溃疡性内皮细胞凋亡，此过程能加重微血管途径并延迟组织愈合和更新。进一步研究发现 Bax 和 Bcl-2 在其中发挥重要作用， Bax 是正常组织凋亡的重要调节因子，而 Bcl-2

25、 高表达对受到凋亡诱导刺激的细胞起到增强其生存活性的作用。 Bax 与 Bcl-2 构成的异型二聚体与凋亡抑制功能蛋白（ Bax和 Bcl-xL）同源，并导致 Bax 促进凋亡引起抑制作用。这提示 Bcl-2 家族不同蛋白的相关表达可以控制细胞对凋亡刺激的敏感性。结合上述研究， Bax 表达上调或与 Bcl-2 结合形成二聚体， Bax/Bcl-2 比值增大均可引 起细胞凋亡，而本实验结果显示， Bcl-2 表达显著下调， Bax 表达显著上调，同时 SGC-7901 细胞发生增殖抑制和凋亡增加，与上述研究一致。而 Bcl-2 是否与 Bax 形成二聚体，有待于进一步验证。 综上所述，我们发现

26、紫花牡荆素作用于 SGC-7901 细胞后， Bcl-2 的表达下调，同时Bax 的表达上调。不同浓度紫花牡荆素处理 SGC-7901 细胞 12h 后，对 Bcl、 Bax 蛋白和mRNA 的表达无显著性差异，然而 24h 和 48h 时 Bcl、 Bax 蛋白和 mRNA 的表达量都有变化，并且呈剂量依赖性，而总 -actin mRNA 的表达量受处理因素的影响较小。 结合以上实验结果，我们发现一定浓度的紫花牡荆素可以诱导人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡，其作用机制可能是通过下调 Bcl-2，上调 Bax 蛋白和 mRNA 的表达，诱导人胃癌 SGC-7901 细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤

27、细胞的生长。本文为紫花牡荆素广泛用于临床肿瘤的治疗提供了一定的实验依据。紫花牡荆素对人胃癌的作用是否存在更精细的分子调节机制还有待进一步的实验研究。 结 论 紫花牡荆素 SGC-7901 细胞 具有抑制增殖作用 ，并且 浓度 依赖性 ；紫花牡荆素能诱导SGC-7901 细胞凋亡，其作用机制可能与 Bcl-2mRNA 和 Bcl-2 蛋白的表达下调、 BaxmRNA和 Bax 蛋白的表达上调有关。 参 考 文 献 1 孙秀娣 , 牧人 , 周有尚 , 等 . 中国胃癌死亡率 20 年变化情况分析及其发展趋势预测 J. 中华肿瘤杂志 , 2004, 26 (1) : 4-9. 2 Nishikaw

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