胃癌sgc7901细胞特异性结合肽的筛选及鉴定.pdf

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1、 分类号 密级 U D C 编号 硕士学位论文 胃癌 SGC7901 细胞 特异性结合 肽的筛选及鉴定 研 究 生 姓 名： 郭彩霞 指导教师姓名、职称： 梁晓秋 教 授 学 科、专 业 名 称： 病理学与病理生理学 研 究 方 向： 肿瘤的发病机制与防治 2011 年 5 月 南华大学学位论文原创性声明 本人声明 ， 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知 ， 除了论文中特别加以标注和致谢的地方外 ， 论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果 ， 也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论

2、文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文是本人在南华大学攻读 硕 （博 /硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有 ， 本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学 有关保留、使用学位论文的规定 ， 即：学校有权保留学位论文 ， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容 ， 可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ， 并按中国优秀博硕士学

3、位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库 ， 并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文 ， 解密后适用该授权。 作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 目 录 中文摘要 -1 英文摘要 -2 论文正文 1. 前 言 -4 2. 实验材料 和 方法 -5 3. 实验结果 -11 4. 讨论 -22 5. 结论 -26 参考文献 -27 综述 -31 攻读硕士研究生期间撰写的论文 -43 主要英文缩略语索引 -44 致谢 -45 1 胃癌 SGC7901 细胞 特异性结合 肽 的筛选及鉴定 硕士研究生：郭彩

4、霞 导 师：梁晓秋教授 中文 摘要 目的 ： 利用体内噬菌体 展示 技术 ， 筛 选与 人 胃癌 细胞株 SGC7901 特异性亲和的短 肽 ， 以利于指导临床 胃 癌的早期诊断和靶向性治疗 ， 提高 胃 癌治疗的针对性 。 方法 ： 建立裸鼠 胃癌 模型 ， 将噬菌体通过尾静脉注射入裸鼠体内 ， 经过四轮筛 选 ， 得到富集的噬菌体 ， 即与 短 肽结合的目标噬菌体 ， 回收肿瘤组织以及对照的心脏、肝脏 和脑组织 中的噬菌体并测定效价 ， 同时利用免疫组化 及 ELISA 等试验方法对目 标噬菌体进行检测 ， 提取噬菌体 DNA， 进行 序列测定 ， 得到 特异性 短 肽序列。 结果 ： 成

5、功构建裸鼠 胃癌 模型； 经过四轮的 筛 选 ， 免疫组化结果显示：肿瘤组织结合的噬菌体得到明显富集 ， 心脏及脑组织结合的噬菌体没有富集。 通过回收噬菌体效价的测定 ， 肿瘤组织结合噬菌体为肝脏组织的 88.8 倍 ， 脑组织的 6.7 104倍 ， 心脏组织 9.7 104倍。 ELISA 结果显示 P/N2.1 的阳性克隆有 19 个 ，P/N2.5以上的克隆有 13 个 ， 其中 P/N3.0 的克隆有 3个 ， 一般来说当 P/N（ OD克隆 /OD 随机对照克隆） 2.1 时 ， 即可说明 此克隆对 SGC7901 细胞 有高亲和力。得到与噬菌体特异性结合的 短 肽 ， 并成功测序

6、。 结论 ： 利用体内噬菌体展示技术筛选与人胃癌组织特异性结合的短肽， 经过四轮体内淘选 ， 胃癌肿瘤组织噬菌体得到明显富集 ， 测序比对后 ， LLRSTGF出现的次数最多 ， 提示此短肽可能对荷瘤裸鼠模型的胃癌组织具有很强的结合力 ， 有望成为胃癌治疗的靶点 。 关键词 ： 体内 噬菌体展示技术；胃癌； 短 肽 2 Screening and identification of peptide specifically combined with gastric cancer cell SGC 7901 Abstract Objective: Use of in vivo Phage Di

7、splay Technology to pan the short peptide specifically combined with gastric cancer tissue, in order to guide the early diagnosis and targeted therapy of the clinical gastric cancer, to enhance the direction of gastric cancer treatment. Method: To establish the nude mouse tumor model, inject the pha

8、ge through the tail vein, pan four rounds, get enriched phage which binded to the short peptide, recycle and titer the phage of tumor tissue,heart tissue,Liver tissue and brain tissue,test it in the method of Immunohistochemistry and ELISA.Extracting phage DNA and sequencing it , specific short pept

9、ide sequences was obtained. RESULT: Nude mouse tumor model was successfully established. After four rounds of panning, Immunohistochemistry showed that the peptide binding to the tum- or tissue enriched significantly but the heart and Liver and brain tissue didnt.To titer the phage recovery,which bi

10、nding to the tumor tissue is 88.8 times of the Liver tissue, 9.7 104 times of the heart tissue,6.7104 times of the brain tissue. ELISA showed that of all the clones P/N2.1 were 19, P/N2.5 were 13.Among these P/N3.0 were 3.Generally speaking,when the P/N (the clone of OD/the randomized controlled clo

11、ne of OD)2.1,it illustrated that this clone has a high affinity for SGC 7901. We obtained the peptide specifically binding to the phage and sequencing it successfully. CONCLUSION: Use of in vivo Phage Display Technology to pan the short peptide specifically combined with gastric cancer tissue.The pe

12、ptide binding to the gastric tumor tissue enriched significantly after four rounds of panning.After sequence alignment, LLRSTGF occur most frequently.It suggests that this peptide may have a strong binging force to the nude mice model of gastric cancer and is expected to be- come a target for cancer

13、 therapy. 3 Postgraduate： Guo Cai-xia (pathology and pathophysiology) Directed by professor： Liang Xiao-qiu Key words: In vivo; Phage Display Technology; gastric cancer; short peptide 4 前言 胃癌是我国常见的 恶性肿瘤 之一 ， 在我国其 发病率 居各类肿瘤的首位。 因此 ，胃癌的早期发现早期治疗尤为重要。 用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中 筛选到的多肽 ， 可以 作为抗癌药物的定向输送工具 。 本实验通过

14、体内噬菌体展示技术 筛 选与胃癌组织特异性结合的 短 肽 ， 以利于指导 临床胃癌的早期诊断 和 靶向 治疗 。 噬菌体展示技术 是将外源蛋白或多肽的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置 ， 使外源基因随外壳蛋白的表达而表达 ， 同时 ， 外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。 1985年美国 Missouri大学 Smith等1将外源基因插入丝状噬菌体 f1的 p 基因 ， 获得 可在体外稳定增生 的重组噬菌体 ， 从而创立了 噬菌体展 示技 术。 噬菌体展示技术成为研究蛋白及多肽的一种方法。 作为一种简便、高效筛选工具 ， 噬菌体展示技术应用于许多方面 2，

15、 如 功能配体或药物的筛选、 利用特异性的单抗为筛选靶标 3， 筛选多肽或蛋白质 ， 或用其他的功能蛋白作为筛选靶标 4， 如以受体蛋白分 子作为靶标 ， 筛选出特异 性 配体 ， 筛选酶的底物或抑制剂 4 , 5、 肿瘤药物的研发 以及疾病的诊断与治疗 。 由于 它库容量大、筛选简便 ， 所以有 巨大的应用潜力。 本实验通过体内噬菌体展示技术 筛 选与胃癌组织特异性结合的 短 肽 ， 通过建立裸鼠 胃癌 模型 ， 将噬菌体注射入裸鼠体内 ， 经过四轮的 筛 选 ， 得到富集的噬菌体 ， 即与 短 肽结合的目标噬菌体 ， 通过对目标噬菌体的检测 以及提取噬菌体 DNA测序 ， 比对 推导 可以

16、得到与其特异性结合的胃癌组织的 短 肽。 本实验旨在筛选出与胃癌组织特异性结合的 短 肽 ， 指导胃癌的靶向性治疗。 靶向治疗是利用特异性作用于肿瘤组织或器官的结合分子作为药物靶向肿瘤的载体 ， 从而改善抗癌药物的传递系统 ， 提高药物靶向的特异性 ， 实现 治疗的针对性和安全性 6， 为下一步实验做好铺垫 。 5 实验 材料和方法 1 实验材料 和主要试剂 ： 1.1 细胞株 人 胃癌细胞株 SGC 7901 为本室保存 。 1.2 实验动物 BALB/C裸小鼠 购于北京维通利华实验动物技术有限公司 ， SPF级 ， 18只 ， 雌 性 ，4-7周 龄 ， 体重 18-20g， 分笼饲养（每

17、笼 3只） 。 1.3 噬菌体 肽 库 噬菌 体环 7肽文库 (Ph.D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit) 购自美国New England Biolabs 公司。 100ul， 2 1013pfu/ml， 多样性 1.2 109个转化子 ，贮存于含 50%甘油的 TBS溶液中。 1.4 宿主菌 E.coli ER2738宿主菌： 购自 New England Biolabs公司 。 1.5 主要 试剂 RPMI1640 培养基 ： 美国 GIBCO公司 小牛血清 ： 杭州四季青公司 胰蛋白酶 ： 美国 AMRESCO公司 二甲基亚砜（ DMSO

18、） ： 美国 SIGMA公司 胰蛋白 胨 、酵母提取物 ： OXOID公司 琼脂糖、琼脂粉 Tris： 鹏程公司 PEG8000： 碧云天公司 IPTG： 美国 MERCK 公司 X-gal： 美国 AMRESCO 公司 HRP标记的抗噬菌体单克隆抗体 鼠 抗 M13 噬菌体 抗体 ： 美国 Pharmacia 公司 M13噬菌体单链 DNA 快速提取试剂盒 ： 美国 QIAGEN公司 二甲基甲酰胺 （ DMF） ： 美国 AMRESCO 免疫组化试剂盒 ： 福州迈新生物技术开发有限公司 6 四环素 ： 北京鼎国生物技术有限公司 Tween20： 天津市福晨化学试剂厂 BSA： 美国 ROCH

19、E 公司 多聚甲醛 ： 北京鼎国生物有限公司 TMB试剂盒 ： 北京康为世纪生物科技有限公司 5% TritonX-100： 美国 AMRESCO公司 96孔 ELISA酶标板 ： 美国 CORNING公司 1.6 主要工作液配制 ： (1)RPMI-1640培养基：用 800ml去离子水 溶解一袋干粉培养基 ， 冲洗包装袋的内部 搅拌 均匀 ， 充分溶解；加入 2g NaHCO3， 充分搅拌溶解 ， 定容至 1000ml， 调 pH值为 7.0； 0.22 m过滤除菌 ， 4保存 ， 用前添加 10%小牛 血清。 (2)PBS： 8.0gNaCl,2.90gNa2HPO4 12H2O， 0.

20、2gKCl， 0.2gKH2PO4， 加入约 800ml双蒸 水 ， 充分搅拌溶解 ， 定 容到总体积 1升 ， 高压 灭菌 ， 4保存。 (3)LB培养基：称取 10g Bacto-Tryptone， 5g yeast extract， 5g NaCl， 加入约800ml双蒸 水 ， 充分搅拌溶解 ， 定容至 1000ml， 高压灭菌 ， 室温贮存。 (4)LB/IPTG/X-gal 平板： LB培养基 +15g/L 琼脂粉 ， 高压灭菌 ， 冷却至低于 70时 ， 加入 1mlIPTG/X-gal，混匀倒平板。 平板 4避光贮存。 (5)顶层琼脂：称取 10g Bacto-Tryptone

21、， 5g yeastextract， 5gNaCl， 1gMgCl26H2O， 7g琼脂粉 ， 加入约 800ml双 蒸水 ， 充分搅拌溶解 ， 定容至 1000ml。高压灭菌 ， 分成 50ml等份 ， 固体培养基室温贮存 ， 用时微波炉融化。 (6)四环素贮液：以 20mg/ml的浓度溶于乙醇中 ， -20避光贮存。用前摇匀。 (7)LB-Tet平板 ： LB培养基 +15g/L琼脂粉。高压灭菌 ， 冷却至低于 70时 ， 加入1ml四环素贮液 ， 混匀倒平板。平板 4避光贮存 ， 如果平板显棕色或黑色请勿用。 (8)TBS： 50mM Tris-HCl(pH 7.5)， 150mM Na

22、Cl。 高压灭菌 ， 室温贮存。 (9)PEG/NaCl： 20%(w/v)PEG-8000， 2.5M NaCl。 高压灭菌 ， 室温贮存。(10)IPTG/X-gal：称取 1.25g IPTG(isopropyl -D-thiogalactoside)和 1g X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside)溶于 25ml二甲基甲酰胺中。溶液 -20避光贮存。 (11)4%多聚甲醛：称取多聚甲醛 4g， 加入 80ml PBS， 水浴锅 50加热溶解后 ， PBS 7 定容至 100ml， 调整 PH至 7.0。 (12)0.5% Tri

23、tonX-100：将 5% TritonX-100稀释 10倍 ， 现 用 现 配 。 (13)2%BSA： 2g BSA 溶解在 100ml PBS中 ， 现 用 现 配 。 (14)HRP/anti-M13 antibody：用 2%BSA 1： 5000稀释 ， 每 5mlBSA 加入 1 l抗体。 (15)0.1% PBST:1000ml PBS 加入 1ml Tween 20 摇匀 ， 现 用 现 配 。 (16)TMB显色 反应液： 将 TMB和 TMB-显色液以 1： 19的比例均匀混合 ， 即配制成为 TMB显色工作液 ， 现用现配 。 (17)TMB显色终止液 ： 0.5M

24、H2SO4。 (18)DAB显色液 ： A、 B、 C液各取 两 滴 ， 加入 1ml双蒸 水混匀 ， 现用现配 。 1.7 主要仪器 普通光学显微镜 ： 日本 OLYMPUS公司 CO2培养箱 ： 美国 SHEL-LAB公司 独自送回风净化笼具（ IVC） ： 苏州市苏杭实验动物设备厂 细胞超净工 作台 ： 苏州净化设备有限公司 ， 型号 YJ-875 -80超低温冰箱 ： SANYO公司 微量移液器（ 10 l， 100 l， 200 l， 1000 l）： 德国 Eppendorf 公司 低温高速离心机 及迷你型超速离心机 ：德国 Eppendorf公司 pH计 ：美国 Sartoriu

25、s 公司 ， PP-15E型 全自动高压 灭菌器 ： 日本 TOMY KOGYO CO.LTO 公司 ， 型号 TOMY-ES315型 自动双重纯水蒸馏器 ： 上海 申安医疗器械厂 ， 型号 ZLSC-5型 电子天平 ：美国 Sartorius 公司 磁力加热搅拌器：江苏省金坛市金城国胜 实验仪器厂 ， 型号 DF-1型 生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司 ， 型号 SHP-250型 恒温摇床： SHENERGY BIOCOLOR 公司 ， 型号 DHZ-032型 酶联免疫检测仪：第四军医大学 ， 国营华东电子管厂联合研制 ， 型号 DG3022 微波炉： NATIONAL 公司 电热恒温鼓

26、风干燥箱 ：上海跃进医疗器械厂 2 实验方法 2.1 细胞培养 8 人胃癌细胞株 SGC7901培养于含 10小牛血清 的 RPMI 1640培养基中 ， 5% C和 37培养箱中培养。 2.2 裸鼠模型的 建立 大量培养 人 胃 癌细胞 SGC-7901至生长 对数期 ， 胰蛋白酶消化重悬于培养基吹打均匀 ， 将细胞 离心后 收集起来 调整细胞密度为 2 106 个 /ml， 重悬 于 PBS中 ， 用1ml 无菌 注射器取细胞悬液注射于裸鼠 背部 皮下 ， 注射量为 0.2ml/只 ， 裸鼠无菌培养约 2周 。 局部肿瘤直径大约 1-2cm时即可 。 2.3 裸鼠体内噬菌体的筛选 尾静脉注

27、射 噬菌体随机环 7肽文库 2 1011pfu/只 (将其 溶于 RPMI-1640溶液 ，15min后 10%水合氯醛麻醉（ 0.03ml/10g） ， 通过心脏灌注 温热的生理盐水 20ml至肝脏完全变白 ， 取出肿瘤组织、肝脏组织、 心脏组织 及脑组织 ， 取一部分 用 4%多聚甲醛固定用于做免疫组化 ， 剩余的组织 称重 后 剪碎 ， 各 加 3mL0.1%PBST洗涤组织3次 ， 3000r/min离心 10 min， 弃去 上清 。 分别取 1mL大肠杆菌 ER2738(A =0.5)与各组织静止感染 30min后各 加入 9mlLB培养 液室温孵育 30min， 取 100 l感

28、染后的菌液测滴度 ， 并计算总产出量。将 肿瘤组织 剩余的感染后的菌液 3000r/min离 心 10min，沉淀全部扩增到 20mlLB， 220r/min37 振摇 4.5个小时 ， 扩增与胃癌组织 相结合的噬菌体 。 4 条件下离心纯化 ， 用于下一轮筛选 ， 共四轮。 2.4 噬菌体滴定 将待测噬菌体进行系列稀释 ， 一个管为一个 稀释度 ， 待 E.coliER2738菌液 至对数生长期 时， 取 200 l与稀释后的 噬菌体 10 l混匀 ， 室温 孵育 5min， 加入到 3mL 45 的 LB顶层琼脂后迅速倾倒于 LB固体平板 （ 含有 IPTG/X-gal） 上 ， 室温下放

29、置5min， 凝固后 倒置 放入 37 生化 培养箱中培养过夜 ， 第二天 计数蓝色噬菌斑数 ，计算公式 为： 噬菌体效价 (pfu/10 L)=噬斑数稀释倍数 ， 即每 10 L的噬菌体形成单位。 2.5 噬菌体的浓缩纯化 扩增培养物离心 ， 4下 10000 r/min离心 10 min， 取上清液 ， 加入 1/6体 积PEG/NaCl(20g/LPEG8000， 2.5mol/L NaC1)， 4沉淀过夜 。 次日在 4下 12000 r/min离心 15min， 弃上清 ， 用 1ml TBS悬浮沉淀 ， 4下 10000r/min离心 5min， 沉淀残余 9 的细菌 ， 取上清再

30、加入 1/6体积的 PEG/NaCl冰浴中沉淀 1h， 离心 后弃 去上清 ， 将 沉淀溶解于 200 lTBS， 即获得纯化的噬菌体。第 四 轮筛选后随机选取 20个克隆进行如上纯化 ， 用于 DNA序列的测定。 2.6 DNA序列的测定 将第四轮淘选的噬菌体液 ， 不经扩增 直接感染大肠杆菌 ， 并铺到 含IPTG/X-gal的 LB琼脂糖平皿上 ， 于 37 过夜。 12小时后 ， 选取 20个 分隔良好的蓝色噬菌斑 ， 将 E.coli ER2738过夜培养物与 LB培养基按 1:100稀释 ， 分成 1ml/管 ；将单个蓝色噬菌斑加到上述 1 ml培养管中进行扩增 ， 每管一个单克隆

31、 ， 37摇 4.5个小时 ， 220r/min。培养物转入微量离心管中 ， 10000r离心 10min， 用移液器将80%的上清转入新鲜离心管 ， 此即为扩增噬菌体贮液。 4 浓缩 纯化 ， 即为 纯化的噬菌体。 取 200 l/管 用于 做 ELISA， 共 20管。 其余 按照 M13噬菌体单链 DNA快速提取试剂盒提取噬菌体 DNA， 送上海生工测序 ，共 20管 。 2.7免疫组化 取出浸在 4%多聚甲醛中的肿瘤组织、心脏组织、 肝脏组织 及脑组织 ， 经石蜡包埋、切片常规脱蜡至水 ， PBS洗 3次 ， 每次 3分钟 ， 除去 PBS， 每张切片加一滴试剂 A（内源性过氧化物酶阻

32、断剂） ， 室温 10分钟 ， PBS洗 3次 ， 每次 10分钟。除去 PBS，每张切片加一滴试剂 B（正常动物非免疫血清） ， 室温 10分钟 ， 不冲洗 ， 甩去试剂 B擦净 ， 不干片 ， 加一抗（ HRP标记的抗噬菌体单克隆抗体即 鼠 抗 M13噬菌体 抗体） ，4 过夜 ， PBS洗 3次 ， 每次 3分钟 ， 除去 PBS， 每张切片加一滴 C液（生物素标记的羊抗鼠 IgG） ， 室温 10分钟 ， PBS洗 3次 ， 每次 3分钟 ， 除去 PBS， 每张切片加一滴 D液（链霉素抗生物素蛋白 -过氧化物酶） ， 室温 10分钟 ， PBS洗 3次 ， 每次 3分钟 ，除去 PB

33、S， DAB显色 ， 显微镜下观察变黄 ， 冲洗 ， 终止反应 ， 加苏木素复染 30s， 冲洗 ， 1%盐酸分化 2s， 自来水返蓝 5分钟 ， 酒精梯度脱水 ， 烤干 ， 中性树胶封片。 阳性结果判定 :阳性表达为细胞质着棕黄色，所有切片在同一条件下应用 image-p ro plot6.0彩色图像分析系统进行相对灰度值的 测定，随机取 3个高倍视野 ( 40)，其阳性表达水平应用平均灰度值表示。用 (X s) 表示平均灰度值。 2.8 ELISA 10 将 SGC7901按 5 104/孔 （ 200 l/孔 ） 的密度接种于酶标板 96孔板 ， 置 37、5 CO2培养箱培养 至细胞铺

34、满孔底 ， 对细胞进行无血清处理 1h， 清洗细胞 ， 用 4%多聚甲醛固定 20 min， PBS稍洗 ， 0.5%triton X-100处理 10 min， 每孔加满 0.1 % PBST静置 1min， 甩去洗涤液 ， 吸水纸上拍干 ， 如此重复洗板 4 次 ； 每孔加满 2% PBS-BSA封闭 1h后 ， 倒 去洗涤液 ， 每孔加满 0.1% PBST静置 1min， 甩去洗涤液 ，吸水纸上拍干 ， 如此重复洗板 4次； 加入滴度约 1012pfu/ml的噬菌体 （ 200 l/孔） ，37孵育 2h， 倒去噬菌体 ， 每孔加满 0.1% PBST静置 1min， 甩去洗涤液 ，

35、吸水纸上拍干 ， 如此重复洗板 4次 ； 加 1:5000 HRP-anti M13抗体 （ 200 l/孔） ， 37孵育 1h， 倒去抗体 ， 每孔加满 0.1% PBST 静置 1min， 甩去洗涤液 ， 吸水纸上拍干 ，如此重复洗板 4次 ； 用 TMB显色 （ 100 l/孔） ， 室温 避光 25-30min， 每孔加终止液 0.5M H2SO4（ 50 l/孔） 终止反应 （颜色 由 蓝色立转黄色） ， 10min 内 酶标仪 450 nm处 测量各孔的吸光度（ OD值 ） 。随机挑取噬菌体原库蓝斑作为对照 ， P/N2.1为阳性。 2.11 统计分析 采用 SPSS13.0 软

36、件进行统计分析。所得数据用以 X s 表示。 P 0.05有统计学意义。 11 实验 结果 1 异体移植 SGC7901 细胞裸鼠荷瘤模型的成功建立 培养胃癌细胞 SGC7901， 待细胞处于对数生 长期时 ， 消化收集细胞于裸鼠背部皮下注射 ， 每个注射位点约注射细胞 2 106个。大约 2 周后 ， 注射肿瘤细胞部位长出肿块 直径 1-2cm 左右 ， 如下图所示。 图 2： 噬菌体体内筛选结果 BALB/C裸鼠接种胃癌细胞 SGC7901， 2周后肿瘤长至 1-2cm左右 ， 可用于噬菌体克隆体内 筛选 。 2 噬菌体肽库的体内筛选结果及富集效果分析 四 轮筛选后 ， 从单位 胃癌 组织

37、中回收的噬菌体量 显著 增加 ， 从单位 心脏 组织和脑组织 中回收的噬菌体量 显著 下降 。 第 4轮筛选后从 胃癌肿瘤 组织中回收的噬菌体 量 为 肝 组织中回收噬菌体的 88.8倍 ， 脑组织的 6.7 104倍 ， 心脏组织 9.7104倍 。可见 ， 经过 4轮筛选 ， 噬菌体在 胃癌肿瘤 组织 明显 富集 (表 1)。 表 1噬菌体肽库荷瘤裸鼠体内筛选结果 轮次 输入量 瘤回收量 肝回收量 脑回收量 心脏回收量 （ pfu/g） （ pfu/g） (pfu/g) (pfu/g) （ pfu/g） 1 2 1011 2.6 107 2.2 107 5.4 106 6.1 106 2

38、2 1011 3.4 108 4.6 107 3.7 106 4.4 106 3 2 1011 8.9 108 7.0 107 2.8 106 1.4 106 4 2 1011 8.7 109 9.8 107 1.3 105 9.0 105 3 噬菌体肽库的体内筛选 噬菌体 环 七 肽 文 库尾静脉注射 胃癌 肿瘤 裸鼠 ， 进行噬菌体的体内富集筛选 ，每 一 轮筛选前后 分别测滴度 (pfu/ml)， 计算得率。 四 轮筛选前后噬菌体滴度 如图 12 3-图 6所示 A B 图 3：第一轮筛选结果 A：为加入噬菌体稀释 107倍测滴度 ， 约 2 1011； B：筛得的噬菌体稀释 104倍测

39、滴约 2.6 107， 第一轮筛选得率约为 1.30 10-4。 A B 图 4：第 二 轮筛选结果 A：为加入噬菌体稀释 107倍测滴度 ， 约 2 1011； B：筛得的噬菌体稀释 104倍测滴约 3.4 108， 第 二 轮筛选得率约为 1.70 10-3。 A B 图 5：第 三 轮筛选结果 A：为加入噬菌体稀释 107倍测滴度 ， 约 2 1011； B：筛得的噬菌体稀释 104倍测滴约 8.9 108， 第 三 轮筛选得率约为 4.45 10-3 13 A B 图 6：第 四 轮筛选结果 A：为加入噬菌体稀释 107 倍测滴度 ， 约 2 1011； B： 筛得的噬菌体稀释 104

40、 倍测滴约8.7 109， 第 四 轮筛选得率约为 4.35 10-2。 4 免疫组化 结果 免疫组化结果显示 ：经过四轮的筛选 ， 肿瘤组织结合的噬菌体得 到了很好的富集 ， 而心脏组织、脑组织及肝脏组织结合的噬菌体没有得到富集 ， 且逐轮减少（见图 7， 8， 9， 10） A B C D E 图 7肿瘤组织 结合的噬菌体从第一轮到第四轮得到明显富集 （ 40） A： 第一轮 ； B： 第二轮； C：第三轮； D：第四轮 ； E： 对照 肿瘤组织 。 A、 B、 C、 D为阳性 ， 胞浆染色为棕黄色 ， E为阴性 。 A B C 14 D E 图 8肝脏组织 结合的噬菌体从第一轮到第四轮虽

41、略有增加但没有得到明显富集 （ 40） A：第一轮； B：第二轮； C：第三轮； D：第四轮； E：对照 肝脏组织。 A、 B、 C、 D 为弱阳性 ， 胞浆染色 淡棕 黄 ， E为阴性对照 。 A B C D E 图 9心脏组织 结合的噬菌体没有得到富集且逐轮减少 （ 40） A：第一轮； B：第二轮； C：第三轮； D：第四轮； E： 阴性对照 。 A、 B为 弱 阳性 ， 胞浆染色淡棕黄色 ， C、 D为阴性 。 A B C 15 D E 图 10脑 组织 结合的噬菌体没有得到富集且逐轮减少 （ 40） A：第一轮； B：第二轮； C：第三轮； D：第四轮； E： 阴性对照 。 A、 B

42、为弱阳性 ， 胞浆染色淡棕黄色 ， C、 D为阴性 。 表 2 肿瘤 组织 噬菌体得到明显富集 （ X s ,n=3） 灰度值 第 一轮 第二轮 第三轮 第四轮 阴性对照 肿瘤 108.3 3.25* 116.5 5.28* 130.6 4.71* 144.5 5.28* 1.0 0.52 心脏 101.5 1.25* 102.5 1.10* 1.17 0.36 1.15 0.31 1.1 0.44 肝脏 112.4 1.25* 113.4 1.05* 115.8 1.36* 117.3 1.58* 1.2 0.56脑 105.6 3.15* 110.5 2.21* 1.17 0.44 1.1

43、9 0.34 1.0 0.50 *与阴性对照相比， p 0.05 5 ELISA 鉴定重组噬菌体对 SGC7901 的亲和力 噬菌体肽库经过 四 轮体内筛选后 ， 随机挑选 20个噬菌体克隆 ， 分别命名为 pha- ge-1、 phage-20。噬菌体 原库蓝斑作为对照 ， 利用 ELISA鉴定噬菌体克隆对SGC7901的 亲和力 ， 得出 各 克隆的 OD值 ， 如图 11所示 。 图 11： ELISA 检测第 四 轮筛选噬菌体克隆与 SGC7901的亲和力 (X s ， n=3) 横坐标 1， 2， 3， ， 20分别代表噬菌体克隆 phage-1， phage-2， phage-3， ， phage-20。 组织 16 从图 11可 计算出各噬菌体克隆对 SGC7901 的亲和力 ， 当 P/N（ OD克隆 /OD随机对照克隆） 2.