辅助降血糖功能评价方法.doc

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1、29附件 3： 辅助降血糖功能评价方法辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment1 试验项目试验项目1.1 动物实验分为方案一（胰岛损伤高血糖模型）和方案二（胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型）两种1.1.1 方案一（胰岛损伤高血糖模型）1.1.1.1 体重1.1.1.2 空腹血糖1.1.1.3 糖耐量1.1.2 方案二（胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型）1.1.2.1 体重1.1.2.2 空腹血糖1.1.2.3 糖耐量1.1.2.4 胰岛素1.1.2.5 总胆固醇1.1.2.6 甘油三酯1.

2、2 人体试食试验1.2.1 空腹血糖1.2.2 餐后 2 小时血糖1.2.3 糖化血红蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白1.2.4 总胆固醇1.2.5 甘油三酯 2 试验原则试验原则2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。2.2 根据受试样品作用原理不同，方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。2.3 除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外，应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。2.4 人体试食试验应在临床治疗的基础上进行。2.5 应对临床症状和体征进行观察。2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3 结果判定结果判定303.1 动物实验：方案

3、一：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，血脂（总胆固醇、甘油三酯）无明显升高，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。3.2 人体试食试验：空腹血糖、餐后 2 小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白） 、血脂四项指标均无明显升高，且空腹血糖、餐后 2 小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该受试样品具有辅助降血糖功能的作用。31辅助降血糖功能检验方法辅助降血糖功能检验方法 Method for the Asse

4、ssment of Assisting Blood Sugar Reduction Function1.动物实验动物实验1.1 实验动物实验动物选用成年动物，选用小鼠（262g）或大鼠（18020g） ，单一性别，大鼠每组 812 只、小鼠每组 1015 只。1.2 材料材料1.2.1 试剂试剂四氧嘧啶（C4H2N2O4H2O,分子量 160.08）或链脲佐菌素、地塞米松磷酸钠注射液、葡萄糖或医用淀粉、血糖测定试纸或试剂盒，胰岛素、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒1.2.2 高热能饲料高热能饲料猪油 10% 、蔗糖 15% 、蛋黄粉 15% 、酪蛋白 5% 、胆固醇 1.2% 、胆酸钠 0.2%

5、、碳酸氢钙 0.6%、石粉 0.4%、鼠维持料 52.6% 1.2.3 仪器仪器血糖仪、全自动生化仪、可见光分光光度计、酶标仪、天平。1.3 剂量分组及受试样品给予时间剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个模型对照组，以人体推荐量的 10 倍（小鼠）或 5 倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，高剂量一般不超过 30 倍，必要时设空白对照组。同时设给予受试样品高剂量的正常动物组。受试样品给予时间 30 天，必要时可延长至 45 天。1.4 实验方法实验方法1.4.1 正常动物降糖实验正常动物降糖实验选健康成年动物按禁食 35 小时的血糖水平分组，随机选 1 个对照组和 1 个

6、剂量组。对照组给予溶剂，剂量组给予高剂量浓度受试样品，连续 30 天，测空腹血糖值（禁食同实验前） ，比较两组动物血糖值。1.4.2 高血糖模型降糖实验高血糖模型降糖实验方案一321.4.2.1 胰岛损伤高血糖模型1.4.2.1.1 原理四氧嘧啶（或链脲佐菌素）是一种细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛细胞，造成胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病。1.4.2.1.2 造模方法购入成年动物，适应 1 天后，随机取 15 只动物禁食 35 小时，测空腹血糖，作为该批次动物基础血糖值。随后动物禁食 24 小时（自由饮水） ，注射四氧嘧啶（用前新鲜配制）造模，小鼠 4550mg/kg BW.iv 或

7、125130mg/kg BW.ip，大鼠 5080mg/kg BW.iv 或120160mg/kg BW.ip。57 天后动物禁食 35 小时，测血糖，血糖值 1025mmol/L 为高血糖模型成功动物。1.4.2.1.3 高血糖模型动物降糖实验选高血糖模型动物按禁食 35 小时的血糖水平分组，随机选 1 个模型对照组和 3 个剂量组（组间差不大于 1.1mmol/L） 。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30 天，测空腹血糖值（禁食同实验前） ，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。（实验前血糖值实验后血糖值） 血糖下降率%= -100 实验前血糖值1.4.2.1.4 高血糖

8、模型动物糖耐量实验剂量分组及受试样品给予时间同 1.4.2。各组动物禁食 35 小时，测定给葡萄糖或医用淀粉前（即 0 小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，1520 分钟后各组经口给予葡萄糖 2.0g/kg BW 或医用淀粉 35g/kg BW，测定给葡萄糖后各组0.5、2 小时的血糖值或给医用淀粉后 1、2 小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点（0、0.5、2 小时）血糖值及血糖曲线下面积的变化。（0 小时血糖0.5 小时血糖）0.5 （2 小时血糖0.5 小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2 2方案二1.4.2.2 胰岛素

9、抵抗糖脂代谢紊乱模型(任选其一)1.4.2.2.1 地塞米松诱导胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型1.4.2.2.1.1 原理糖皮质激素具有拮抗胰岛素生物效应的作用，可抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用，促进蛋白质和脂肪的分解及糖异生作用，导致糖、脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.1.2 试验方法购入健康雄性大鼠（15020g） ，普通维持料适应饲养 35 天，禁食 34 小时，取尾血，测定空腹即给葡萄糖前（0 小时）血糖值，给 2.5g/kgBW 葡萄糖后测定 0.5、2 小时血糖值，作为该批次动物基础值。以 0、0.5 小时血糖水平分 5 个组，即 1 个空白对照组、1 个模型

10、对照组和 3 个剂量组，每组 15 只。空白对照组不做处理，3 个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续 35 天。各组给予维持料饲养，1 周后模型对照组和 3 个剂量组更换高热能饲料，喂饲 2 周后，模型对照组和 3 个剂量组在高热能饲料基础上分别给予地33塞米松 0.8mg/kgBW 腹腔注射（0.008%地塞米松注射量 1ml/100g 体重） ，每日 1 次，连续1012 天。试验结束，各组动物禁食 34 小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.2.2.1.3 观察指标1.4.2.2.1.3.1 空腹血糖、糖耐量各组动物禁食 34

11、小时，测定空腹血糖即给葡萄糖前（0 小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，1520 分钟后各组经口给予葡萄糖 2.5g/kg BW，测定给葡萄糖后各组 0.5、2 小时的血糖值，若模型对照组 0.5 小时血糖值10mmol/L，或模型对照组 0.5 小时、2 小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2 小时）血糖及 0、0.5、2 小时血糖曲线下面积的变化。（实验前血糖值实验后血糖值） 血糖下降率%= -100 实验前

12、血糖值（0 小时血糖0.5 小时血糖）0.5 （2 小时血糖0.5 小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2 21.4.2.2.1.3.2 胆固醇、甘油三脂各组动物禁食 34 小时，检测血清胆固醇、甘油三脂，若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型脂代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组血脂变化。1.4.2.2.1.3.3 胰岛素各组动物禁食 34 小时，检测血清胰岛素，模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降，且动物糖/脂代谢紊乱成立，判定胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。血糖胰岛素 胰

13、岛素抵抗指数 = 胰岛素/22.5e-血糖 22.51.4.2.2.2 四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型1.4.2.2.2.1 原理高热能饲料喂饲基础上，辅以小剂量四氧嘧啶（C4H2N2O4H2O,分子量 160.08） ，造成糖/脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.2.2 造模方法购入健康雄性大鼠（15020g） ，普通维持料适应饲养 35 天，禁食 34 小时，取尾血，测定给葡萄糖前（即 0 小时）血糖值，给 2.5g/kgBW 葡萄糖后 0.5、2 小时血糖值，作为该批次动物基础值。以 0、0.5 小时血糖水平分 5 个组，即 1 个空白对照组、1 个模型对照

14、组和 3 个剂量组，每组 15 只。空白对照组不做处理，3 个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续 33 天。各组给予维持料饲养，1 周后模型对照组和 3 个剂量组更34换高热能饲料，喂饲 3 周后，模型对照组和 3 个剂量禁食 24 小时（不禁水） ，给予四氧嘧啶103105mg/kgBW 腹腔注射，注射量 1ml/100g 体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲 35天。试验结束，各组动物禁食 34 小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.2.2.2.3 观察指标1.4.2.2.2.3.1 空腹血糖、糖耐量各组动物禁食 34 小时，测定空

15、腹血糖即给葡萄糖前（0 小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，1520 分钟后各组经口给予葡萄糖 2.5g/kg BW，测定给葡萄糖后各组 0.5、2 小时的血糖值，若模型对照组 0.5 小时血糖值10mmol/L，或模型对照组 0.5 小时、2 小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2 小时）血糖及 0、0.5、2 小时血糖曲线下面积的变化。（实验前血糖值实验后血糖值） 血糖下降率%= -100 实验前血糖值（0

16、小时血糖0.5 小时血糖）0.5 （2 小时血糖0.5 小时血糖）1.5 血糖曲线下面积 + 2 21.4.2.2.2.3.2 胆固醇、甘油三脂各组动物禁食 34 小时，检测血清胆固醇、甘油三脂，若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型脂代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组血脂变化。1.4.2.2.2.3.3 胰岛素各组动物禁食 34 小时，检测血清胰岛素，模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降，且动物糖/脂代谢紊乱成立，判定胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。血糖胰岛素 胰岛素抵抗指数

17、 = 胰岛素/22.5e-血糖 22.51.5 数据处理及结果判定数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F值2L/日多食易饥无餐前有轻度饥饿感餐前有明显饥饿感昼夜均有饥饿感多尿尿量3 L/日倦怠乏力无精神不振，不耐劳力 精神疲乏，可坚持轻体力劳动精神极度疲乏，勉强坚持日常活动2.6.2.2 空腹血糖 观察试食前后空腹血糖值、空腹血糖下降百分率、空腹血糖有效率。2.6.2.3 餐后 2 小时血糖 观察试食前后食用 100g 精粉馒头后 2 小时血糖值、餐后 2 小时血糖下降百分率、餐后 2小时血糖有效率。2.6.2.4 糖化血红蛋白或糖

18、化血清蛋白 观察试食前后糖化血红蛋白或糖化血清蛋白变化。2.6.2.5 血脂观察试食前后血清总胆固醇、血清甘油三酯水平。2.7 注意注意2.7.1 血清(浆)中的葡萄糖能与白蛋白及其他血清蛋白分子末端的氨基上发生非酶促糖化反应而形成高分子酮胺结构。此酮胺结构能在碱性环境中与硝基四氮唑兰(NBT)发生还原反应生成蓝紫色物质，以1- 脱氧-1- 吗啡啉果糖(DMF)作标准参照物在540 nm 波长处(530 nm550 nm)进行比色测定，求得样本中果糖胺的浓度。参考值为1.7 mmol/L2.5 mmol/L。由于血清中白蛋白的半衰期约21 d，所以糖化血清蛋白测定可反映患者过去23 周平均血糖

19、水平。 糖尿病患者的糖化血清蛋白的增加比糖化血红蛋白迅速， 当血糖得到较好控制时，糖化血清蛋白的下降也比糖化血红蛋白迅速， 因此能较早地提供血糖控制信息。糖化血清蛋白更能灵敏地反映近期糖尿病患者血糖的波动情况。它的敏感度高，特异强。并不受年龄，饮食，药物，妊娠39等因素的影响，对血糖浓度的临时波动反应不敏感，是诊断糖尿病和较长时间血糖控制水平研究的良好指标。标本溶血对糖化血清蛋白的测定结果有较大影响，血清中1 g/L 的血红蛋白可导致GSP 测定结果增高0.6 mmol/L 左右。2.7.2 糖化血红蛋白是经过缓慢的，不可逆的，非酶促反应而结合形成的产物，其浓度与红细胞寿命(平均120天)和该

20、时期内血糖平均浓度有关，不受每天葡萄糖波动的影响，也不受运动或食物的影响，可反映患者抽血前2个月3个月的平均血糖水平，是判断糖尿病长期控制的良好指标。糖化血红蛋白在健康人体内的波动范围很小(0.1%0.2%)，正常值为4%6%。2.8 数据处理和结果判定数据处理和结果判定凡自身对照资料可以采用配对 t 检验，两组均数比较采用成组 t 检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行 t 检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用 t检验或秩和检验；方差齐但变异系数太大（如 CV50）的资料应用秩和检验。2.8.1 血糖下降幅

21、度血糖下降幅度试验前空腹血糖 试验后空腹血糖 空腹血糖下降百分率 = 100%试验前空腹血糖试验前餐后 2 小时血糖 试验后餐后 2 小时血糖 餐后 2 小时血糖下降百分率 = 100%试验前餐后 2 小时血糖2.8.2 糖化血红蛋白或糖化血清蛋白下降幅度糖化血红蛋白或糖化血清蛋白下降幅度试验前糖化血红蛋白 试验后糖化血红蛋白 糖化血红蛋白下降百分率 = 100%试验前糖化血红蛋白试验前糖化请红蛋白 试验后糖化血清蛋白 糖化血清蛋白下降百分率 = 100%试验前糖化血清蛋白2.8.3 功效判定标准：功效判定标准：有效：试验后空腹血糖恢复正常（5.6 mmol/L） ，或空腹血糖下降幅度10%试

22、验后餐后 2 小时血糖恢复正常(7.8 mmol/L)，或餐后 2 小时血糖下降幅度10%无效：未达到有效标准空腹血糖有效例数 空腹血糖下降有效率 = 100%空腹血糖观察例数餐后 2 小时血糖有效例数40餐后 2 小时血糖下降有效率 = 100%餐后 2 小时血糖观察例数2.8.4 指标判定指标判定2.8.4.1 空腹血糖：试验前后自身比较，空腹血糖下降差异有显著性，且试验后平均血糖下降幅度10；试验后试食组空腹血糖值下降或空腹血糖下降幅度升高与对照组比较，差异有显著性； 试验后试食组空腹血糖下降有效率升高与对照组比较，差异有显著性。满足上述 3 个条件，可判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性

23、。2.8.4.2 餐后 2 小时血糖：试验前后自身比较，餐后 2 小时血糖下降差异有显著性，且试验后平均血糖下降幅度10；试验后试食组餐后 2 小时血糖值下降或餐后 2 小时血糖下降幅度升高与对照组比较，差异有显著性；试验后试食组餐后 2 小时血糖下降有效率升高与对照组比较，差异有显著性。满足上述 3 个条件，可判定该受试样品餐后 2 小时血糖指标结果阳性。2.8.4.3 糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）：试验前后自身比较，糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）下降差异有显著性；试验后试食组糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）值下降或糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）下降幅度升高与对照组比较，差异有显著性。满足上

24、述 2 个条件，可判定该受试样品糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）指标结果阳性。2.8.4.4 血清胆固醇：试验前后自身比较，血清胆固醇下降差异有显著性；试验后试食组血清胆固醇下降与对照组比较，差异有显著性。满足上述 2 个条件，可判定该受试样品血清胆固醇指标结果阳性。2.8.4.5 血清甘油三酯：试验前后自身比较，血清甘油三酯下降差异有显著性；试验后试食组血清甘油三酯下降与对照组比较，差异有显著性。满足上述 2 个条件，可判定该受试样品血清甘油三酯指标结果阳性。2.8.5 结果判定结果判定空腹血糖、餐后 2 小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白） 、血脂四项指标均无明显 升高，且空腹血糖、餐后 2 小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该 受试样品具有辅助降血糖功能的作用。