对胃粘膜损伤有辅助保护功能评价方法.doc

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1、23附件 2： 对胃粘膜损伤有辅助保护对胃粘膜损伤有辅助保护功能评价方法功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment1 试验项目试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重 1.1.2 胃粘膜大体损伤状况1.1.3 胃粘膜病理损伤积分1.2 人体试食试验1.2.1 临床症状1.2.2 体征1.2.3 胃镜观察2 试验原则试验原则2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。2.2 无水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜损伤模型或冰醋酸致慢性胃粘膜损伤模型任选其一进行动物实验。2.3 在进行人体试食试

2、验时，应对受试样品的安全性作进一步的观察。3 结果判定结果判定3.1 动物实验：实验组与模型对照组比较，大体观察评分与病理组织学检查评分结果均表明胃粘膜损伤明显改善，可判定该受试样品动物实验结果为阳性。3.2 人体试食试验：试食组与对照组比较，临床症状、体征积分明显减少，胃镜复查结果有改善，可判定该受试样品对胃粘膜有辅助保护功能。24对胃粘膜损伤有辅助保护功能检验方法对胃粘膜损伤有辅助保护功能检验方法Method for the Assessment of Protection of Gastric Mucosa Function1 动物实验动物实验1.1 原理原理在一定时间内给予一定量的受试

3、样品，用对胃粘膜有损伤作用的物质造成急性胃粘膜损伤模型，观察各剂量组胃粘膜的损伤程度；或用对胃粘膜有损伤作用的物质造成慢性胃溃疡模型，在一定时间内给予一定量的受试样品，观察各剂量组胃溃疡的面积和体积，反映受试样品对胃粘膜的保护作用。1.2 实验动物实验动物选用 SD 或 Wistar 健康大鼠，单一性别，180220 克，每组 812 只。1.3 实验设计及剂量分组实验设计及剂量分组受试物设三个剂量组，其中一个应为人体推荐量的 5 倍剂量组，并同时设置正常对照组。不同的损伤模型，还应设置相应的模型对照组。慢性溃疡模型应先造模，手术次日再分组。受试样品给予时间一般为 1430 天，必要时可以延长

4、至 45 天。 1.4 胃粘膜损伤模型胃粘膜损伤模型1.4.1 急性胃粘膜损伤酒精模型急性胃粘膜损伤酒精模型1.4.1.1 实验动物：选用 Wistar 或 SD 健康大鼠，单一性别。1.4.1.2 实验器材及试剂：解剖器械，游标卡尺，酒精或醋酸，病理制片系统，生物显微镜等。1.4.1.3 实验方法：动物随机分正常对照组、模型组和受试样品三个剂量组。各剂量组灌胃样品30 天后，全部动物严格禁食 24 小时（不禁水），此期间亦禁止给予受试物。除空白对照外，所有试验组动物给予无水乙醇 1.0ml/只，1 小时后处死动物，暴露完整胃，结扎幽门，灌注适量 10%甲醛溶液，固定 20min，然后沿胃大弯

5、剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，在体视解剖显微镜下或肉眼下用游标卡尺测量出血点或出血带的长度和宽度。因宽度所代表损伤的严重性远较长度大，故双倍积分。其评分标准见表 1。表 1 急性酒精损伤肉眼观查评分标准损伤程度1 分2 分3 分4 分 出血点1 个- 出血带长度1-5mm6-10mm10-15mm15mm 出血带宽度1-2mm2mm 总积分 = 出血点分值+长度分值+（宽度分值2）25观察指标：各实验组胃粘膜损伤程度以损伤发生率（%）、损伤积分指数和损伤抑制率表示。损伤发生率（%）= 某组出现出血或溃疡的大鼠数量该组大鼠数量100%；损伤积分指数 = 组损伤评分总和组动物数量；损伤抑制率（%

6、）= (A-B) /A100%（A、B 分别为模型组与试验组的损伤积分）。病理组织学观察及评分：大体检查完毕，将每只动物胃粘膜损伤最严重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常规制片，HE 染色，镜下观察。注意选择胃粘膜正横切面，包括粘膜全层的区域观察。评分方法：以充血、出血、粘膜细胞变性坏死在整个粘膜上皮层的累及程度分为 5 级。充血权重为 1，出血权重为 2，上皮细胞变性坏死权重为 3，评分标准及病变总积分公式见表 2。表 2 急性胃粘膜损伤镜下评分标准病变1 分2 分3 分4 分5 分充血 1/51/5 - 2/52/5 - 3/53/5 - 4/5上皮全层出血 1/51/5 - 2/52/

7、5 - 3/53/5 - 4/5上皮全层上皮细胞变性坏死 1/51/5 - 2/52/5 - 3/53/5 - 4/5上皮全层病变总积分 = 充血积分+出血积分2+上皮细胞变性坏死积分31.4.2 急性胃粘膜损伤消炎痛模型急性胃粘膜损伤消炎痛模型1.4.2.1 实验动物：选用 Wistar 或 SD 健康大鼠，单一性别。1.4.2.2 实验器材及试剂：解剖器械或游标卡尺，病理制片系统；消炎痛，甲醛等。1.4.2.3 实验方法：动物随机分正常对照组、模型组和受试样品三个剂量组，灌胃给予动物受试物30 天后，禁食不禁水 24 小时，模型组和剂量组给予消炎痛 40mg/kg 一次性腹腔注射。5 小时

8、后处死动物，剖腹将胃取出，结扎幽门和贲门，从十二指肠与幽门部结合处注入 10%甲醛溶液 5 ml，固定 20 分钟后，沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃粘膜，用纸吸干，观察胃粘膜损伤程度。用游标卡尺测量胃出血或溃疡的最大长度及宽度，以出血或溃疡的最大长宽径作为损伤指标评分。消炎痛所致胃粘膜损伤的溃疡一般较小，肉眼观查以点状多见，其评分标准见表 3。表 3 急性胃粘膜损伤消炎痛模型评分标准损伤形态1 分2 分3 分4 分出血点1 个- 出血带长度1-2mm2-4mm4-6mm6mm出血带宽度1-2mm2mm总积分 = 出血点分值+长度分值+（宽度分值2）注：长度和宽度均以最大径计。观察指标：各实

9、验组胃粘膜损伤程度以损伤发生率（%）、损伤指数和损伤抑制率表示。损伤发生率（%）= 某组出现出血或溃疡的大鼠数量该组大鼠数量100%；损伤指数 = 组损伤评分总和组动物数量；损伤抑制率（%）=(A-B)/A100%（A、B 分别为模型组与试验组的损伤积分）病理组织学观察及评分：同急性胃粘膜损伤酒精模型。1.4.3 慢性胃溃疡模型慢性胃溃疡模型1.4.3.1 动物：选用 Wistar 或 SD 健康大鼠，单一性别。261.4.3.2 实验器材及试剂：带标尺的解剖镜、微量注射器，醋酸、半胱氨酸等1.4.3.3 实验方法：1.4.3.3.1 醋酸注射法：将动物禁食不禁水 24 小时，乙醚或 1%巴比

10、妥钠麻醉后实施剖腹手术，消毒腹部，于剑突下切开腹腔，将胃轻拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽门处浆膜下注射 20-30l的 30%冰醋酸，缝合切口，术后正常喂食和水。第二天将手术后状态良好的动物按体重随机分为模型组和受试样品三个剂量组。各剂量组按相应剂量灌胃，连续 14 天。模型组灌胃蒸馏水或溶剂。禁食 24 小时后处死，取出整个胃浸泡于 10%的甲醛内，浸泡 20 分钟后沿胃大弯剪开，洗净内容物，取腺胃区展开平铺于玻璃板上，用纸吸干溃疡内的水分，测量其面积和体积。溃疡面积和体积测量法：于带标尺的解剖显微镜下计数溃疡所占的方格数，换算成面积。然后用微量注射器将有色墨水注入溃疡内，将溃疡填满与周边平

11、齐，读取微量注射器上刻度即为溃疡的体积。1.4.3.3.2 冰醋酸浸渍法：将动物禁食不禁水 24 小时，乙醚或 1%巴比妥钠麻醉后实施剖腹手术，消毒腹部，于剑突下切开腹腔，将内径 5mm、长 30mm 的玻璃管垂直放置胃体部粘膜上，向管腔加入冰醋酸 0.2ml，1.5 分钟后用棉签蘸出冰醋酸，缝合手术切口，术后正常喂食和水，第二天将手术后状态良好的动物按体重随机分组、给药，动物处置和测量等操作同上。1.5 数据处理和结果判定数据处理和结果判定数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F 值，F 值50）的资料应用秩和检验。结果判定：试食前后试食组自身比较及试食后试食组与对照组组间比较，临床症状、体征积分明显减少，胃镜复查结果有改善或不加重，可判定该受试样品对胃粘膜损伤有辅助保护功能。