蛋白质化学蛋白质分离、纯化和表征.ppt

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1、第第7 7章章 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征 p290p290一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的的-氨基和氨基和-羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些与氨基酸相同。学性质有些与氨基酸相同。蛋白质也是一类两性电解质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。在，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带

2、电荷。基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带电荷。在酸性情况下，在酸性情况下，蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；白质带正电荷；在碱性情况下，在碱性情况下，蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。蛋白质带负电荷。在某一在某一pHpH值时值时，白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的即净电荷为零，此时溶液的pHpH值就是蛋白质的值就是蛋白质的等电点等电点。每种蛋白质都有它特有的等电点每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的，这也是鉴别蛋白质的指标之一

3、。指标之一。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关 中性中性 碱性碱性 酸性。酸性。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量 与等电点的关系与等电点的关系 蛋白质蛋白质酸性氨基酸酸性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性氨基酸碱性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性碱性/酸性酸性等电点等电点37胃蛋白酶胃蛋白酶60.21.0血清蛋白血清蛋白血红蛋白血红蛋白核糖核酸酶核糖核酸酶82991.24.753881.76.77202.99.5三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀 (一一)蛋白质的胶体性质蛋白

4、质的胶体性质 (二二)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(一一)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质蛋白质是高分子化合物，由于相对分子质量大，是高分子化合物，由于相对分子质量大，它它在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征如如布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力等。膜以及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方来分离纯化蛋白质，这个方法称为法称为透析法透析法。蛋白质溶液是胶

5、体溶液（如血清、蛋清）蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）胶体条件：胶体条件：1.1.1.1.大小：大小：大小：大小：1-100nm1-100nm 2.2.2.2.有水膜：有水膜：有水膜：有水膜：表面有许多极性、亲水基团表面有许多极性、亲水基团(-NH(-NH3 3、-COOH-COOH、-OH-OH、-SH-SH、-CONH-CONH2 2等）。等）。3.3.3.3.带相同的电荷带相同的电荷带相同的电荷带相同的电荷（同性相斥）（同性相斥）(二二)蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应 如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的

6、电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。定而出现沉淀现象。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。1 1、加高浓度盐类、加高浓度盐类 2 2、加有机溶剂、加有机溶剂 3 3、加重金属盐、加重金属盐 4 4、加某些酸类或生物碱试剂、加某些酸类或生物碱试剂 5 5、加热变性沉淀、加热变性沉淀加高浓度盐类加高浓度盐类 硫酸铵硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，使蛋白质

7、产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为象，称为盐析盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，这种调节中这种调节中性盐的浓度使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出的方性盐的浓度使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出的方法称法称分段盐析法分段盐析法。返回加有机溶剂加有机溶剂 酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了

8、蛋由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。返回加重金属盐加重金属盐 氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。返回加某些酸类或生物碱试剂加某些酸类或生物碱试剂 加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。成不溶解的蛋白质盐而沉淀。生物碱试剂是指能引起生物

9、碱沉淀的一类试剂，生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。返回加热变性沉淀加热变性沉淀 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全最迅速。加热凝固最完全最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。化层。返回五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯

10、化方法蛋白质的分离纯化依据（一）根据分子大小不同的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化依依据据 分子大小分子大小分子大小分子大小 溶解度溶解度溶解度溶解度 电荷电荷电荷电荷 吸附吸附吸附吸附 特异亲和力特异亲和力特异亲和力特异亲和力 其它其它其它其它（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 1、透析和超过滤：、透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜而与利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。小分子分离。2 2、密度梯度离心：、密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介

11、质蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。成不同的区带。3 3、凝胶过滤、凝胶过滤凝胶过滤：凝胶过滤：凝胶过滤：凝胶过滤：即分子排阻层析。即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。多孔的网状结构。大分子最先流出大分子最先流出层析柱。层析柱。大分大分子子 小分小分子子

12、葡聚糖葡聚糖小株小株（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法1、等电点沉淀和、等电点沉淀和PH过滤过滤2、蛋白质的盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质、蛋白质的盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即的溶解度，即盐溶盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当当离子强度离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的的自由水自由水被移去以溶化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，被移去以溶化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀，即使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀，即盐析盐析。3、有机溶剂分级分离法：一是降低介质的、有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数介电常数，二是，二是与蛋白质争夺水膜水。与蛋白质争夺水膜水。4、温度对蛋白质溶解度的影响：低温稳定，高温不稳定。、温度对蛋白质溶解度的影响：低温稳定，高温不稳定。在在040，大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。，大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。