蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

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1、第第7 7章蛋白质的分离、纯化章蛋白质的分离、纯化和表征和表征ProteinSeparation,PurificationandCharacterization因材施法，有的放矢因材施法，有的放矢Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterization对对蛋蛋白白质质分分子子进进行行的的各各种种研研究究，要要建建立立在在对对蛋蛋白白质质分分子子本本身身的的性性质质（特特别别是是区区别别于于其其它它生生物物与与化化学学分分子子的的独独特特的的性性质质）和和各各种种实实验验手手段段的的原原理

2、和适用性深入了解的基础上理和适用性深入了解的基础上。蛋白蛋白质质大分大分子子半透半透膜膜小分小分子子透析透析透析透析袋外袋外袋外袋外小分小分子子透析透析透析透析袋内袋内袋内袋内Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn分离和纯化蛋白质的分离和纯化蛋白质的各种各种方法主要是利方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：用蛋白质之间各种特性的差异，包括：n分子的大小和形状分子的大小和形状n酸碱性质酸碱性质n溶解度溶解度n吸附性质吸附性质n对配体分子的特异生物学亲和力对配体分

3、子的特异生物学亲和力Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationnThe aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material,exploits利用:Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the prot

4、ein of interestProtein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn.1.1 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质nIonization of proteinIonization of proteinn对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一一pHpH称为蛋白质的称为蛋白质的等电点等电点(isoelectric isoelectric point,

5、pIpoint,pI)。+带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）等点电时的蛋白等点电时的蛋白等点电时的蛋白等点电时的蛋白质（亲水胶体）质（亲水胶体）质（亲水胶体）质（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）脱脱脱脱水水水水脱脱脱脱水水水水脱脱脱脱水水水水带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）（疏水胶体）带负电荷蛋白带负电荷蛋白带负电荷蛋白带负电荷蛋白质（疏水胶体）质（疏水胶体）质（疏水胶体）质（疏水胶体

6、）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒（沉淀）（沉淀）（沉淀）（沉淀）蛋白质胶体颗粒沉淀蛋白质胶体颗粒沉淀碱碱碱碱酸酸酸酸碱碱碱碱碱碱碱碱酸酸酸酸酸酸酸酸沉淀技术沉淀技术Ionization of proteinIonization of proteinn蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显的变化。可以发生明显的变化。n蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。n没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子

7、数与质子受体基团结合的质子数离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的相等时的pHpH称为称为等离子点等离子点(isoionic pointisoionic point)。acidexcesspositivechargeCationexchangerisoelectricpointbalancedpositiveandnegativechargealkalineexcessnegativechargeAnionexchanger310pH_+OverallchargeonproteinTheoverallchargeonaproteindependsonpHIonization of p

8、roteinIonization of proteinn7.2 7.2 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状nProtein size and shapeProtein size and shapen7.2.1 7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量 铁的原子量铁的原子量n铁的百分含量铁的百分含量=100=100 最低相对分子质量最低相对分子质量 铁的原子量铁的原子量n最低相对分子质量最低相对分子质量=100=100铁的百分含量铁的百分含量 例如，肌红蛋白相对分子质量=100 =16700 用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近，可见肌红

9、蛋白分子中只含一个铁原子。nProtein size and shapeProtein size and shape7.2.2 7.2.2 渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压渗透与渗透压n渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量n溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向净移动现象称为渗透渗透(osmosis)(osmosis)。n渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗渗透透压压（osmotic pressure)osmotic pressure)。n渗渗透透压压是单位体积内溶

10、质质质点点数数的的函函数数，而与溶质的性质和形状无关。n在在浓浓度度不不大大时时，渗渗透透压压与与溶溶质质的的相相对对分分子子量量的的关系为：关系为：n=RT(c/Mr +K c=RT(c/Mr +K c2 2)nMr=RT/lim/cMr=RT/lim/cn c0 c0渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量n7.2.3 7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数n扩散（扩散（diffusiondiffusion）ndm/dt=-DA dc/dxdm/dt=-DA dc/dxnD D 扩散系数，扩散系数，A A 扩散面积扩散面积n扩散系数随扩散系数随MrMr的增加而降低

11、。的增加而降低。n但但扩扩散散系系数数对对MrMr的的变变化化并并不不敏敏感感，一一般般不不单单独独用来确定用来确定MrMr。n7.2.4 7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n蛋蛋白白质质溶溶液液在在电电场场中中受受到到强强大大的的离离心心力力作作用用时时，如如果果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。n沉沉降降的的速速率率与与蛋蛋白白质质分分子子大大小小和和密密度度有有关关，而而且且与与分分子形状、溶液的密度和粘度有关。子形状、溶液的密度和粘度有关。n沉降速率法沉降速率法n沉降平衡法沉降平衡法沉降分析法测

12、定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n离心机离心机n转速转速 60 000-80 000rpm 60 000-80 000rpmn离心力离心力 400 00-700 000g 400 00-700 000g沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量离心力离心力 4 42 2 v v 2 2 r r F=-F=-g gF:F:离心力，单位以地心引力的倍数离心力，单位以地心引力的倍数g g表示（即表示（即g g 或或gg）g:g:重力加速度，等于重力加速度，等于980.6 cm980.6 cm2 2/s/s2 2.r r:通通常常指指自自离离心心管管中中轴轴底底部部内内壁壁到到离离心

13、心转转轴轴中中心心之之间间的距离（的距离（cmcm）v v :为为转转速速，即即离离心心机机每每秒秒的的转转数数，若若以以每每分分钟钟转转数数（rpmrpm）表示，则上式应为）表示，则上式应为 4 42 2 v v 2 2 r r F=-F=-（1/601/60）2 2 g gn7.2.4.1 7.2.4.1 沉降速率法沉降速率法n沉降界面沉降界面nn n单单分分子子颗颗粒粒以以恒恒定定速速度度移移动动时时，净净离离心心力力与与摩摩擦擦力力的的关系：关系：nnFnFc c-F-Fb b=F=Ff fnn dx/dt mn dx/dt mp p(1-)(1-)n =n 2 2 f fnndx/d

14、tns=n2n单单位位离离心心场场的的沉沉积积速速度度是是个个定定值值，称称为为沉沉降降系系数数（sedimentation sedimentation coefficient)coefficient)或或沉沉降降常常数数。n蛋蛋白白质质、核核酸酸、核核糖糖体体和和病病毒毒的的沉沉降降系系数数介介于于110110-13-13 到到20010 20010-1313 秒的范围。秒的范围。n10 10-1313 秒秒作作为为一一个个单单位位，斯斯维维得得贝贝格格单单位位或或沉沉降降系系数数单位，即单位，即S S。沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.4.2 7.2.4.2 沉

15、降平衡法沉降平衡法n利利用用沉沉降降平平衡衡法法测测定定相相对对分分子子质质量量是是在在较较低低速速度度（8000-20000r/min8000-20000r/min）的离心场中进行的。）的离心场中进行的。n蛋白质的沉降平衡蛋白质的沉降平衡（图7-3）沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n在时间在时间dtdt内浓度为内浓度为c c的溶液越过横截面的溶液越过横截面A A的溶质量：的溶质量：dm=-dm=-cAcA dx/dtdx/dt dtdtn因此扩散作用沿相反方向越过横截面因此扩散作用沿相反方向越过横截面A A的溶质量：的溶质量：dm=-DA dc/dm=-DA dc/dxd

16、x dtdt沉降沉降分析分析法测法测定相定相对分对分子质子质量量n当当净净离离心心力力与与扩扩散散力力平平衡衡时时，在在离离心心池池内内从从液液面面到到液液底底形形成成一一个个由由低低到到高高的的恒恒定定浓浓度度梯梯度度，因此：因此：n2RTdln(c2/c1)nMr=n(1-)2(x22-x12)沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.5 7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量nGel filtration chromatographyGel filtration chromatographyn凝胶过滤法的原理凝胶过滤法的原理Gel filtr

17、ation chromatographyGel filtration chromatographynSizeexclusionchromatographynMolecularsieve（筛子）（筛子）chromatography Moleculesareseparatedonthebasisoftheirsizeandshape.Theproteinsampleinasmallvolumesisappliedtothetopofacolumnofporous(有孔的有孔的)beadsthataremadeofaninsolublebuthighlyhydrated（亲水的亲水的）polymer

18、suchaspolyacrylamide(Bio-Gel)orthecarbohydratesdextran（葡聚糖（葡聚糖）(Sephadex)oragarose(琼脂糖琼脂糖)(Sepharose)Smallmoleculescanentertheporesinthebeadswhereaslargerormoreelongatedmoleculescannot.Thesmallermoleculesthereforehavealargervolumeofliquidaccessible（可接近的）（可接近的）tothem;boththeliquidsurroundingtheporous

19、headsandthatinsidethebeads.Incontrast,thelargermoleculeshaveonlytheliquidsurroundingthebeadsaccessibletothem,andthusmovethroughthecolumnfaster,emergingoutofthebottom(eluting洗脱洗脱)first.Thesmallermoleculesmovemoreslowlythroughthecolumnandelutelater.层析柱的洗脱体积与分子量的关系：层析柱的洗脱体积与分子量的关系：Ve=K1-K2lgM凝凝胶胶过过滤滤法法

20、测测定定相相对对分分子子质质量量n7.2.6 SDS7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 相对分子质量相对分子质量SDSSDS，有效变性剂，带负电荷有效变性剂，带负电荷巯基乙醇，巯基乙醇，打开二硫键打开二硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。nR Rf f =K K1 1-K K2 2 lg lg M MElectrophoresis of ProteinnInpolyacrylamide(聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺)gelelectrophoresis(PAGE)proteinsareappliedtoaporousp

21、olyacrylamidegelandseparatedinanelectricfieldonthebasisoftheirnetnegativechargeandtheirsize.nSmall/morenegatively-chargedproteinsmigratefurtherthroughthegelthanlarger/lessnegatively-chargedproteinsn7.3 7.3 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀Protein colloid character and depositionProtein colloid charact

22、er and deposition n7.3.1 7.3.1 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n蛋白质溶液是一个分散系统蛋白质溶液是一个分散系统n分散相质点 100nm的为悬浊液，n 介于1-100nm的为胶体溶液。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionn胶体系统的稳定条件：胶体系统的稳定条件：n1 1 分散相质点的大小分散相质点的大小n2 2 分散相质点带有同种电荷分散相质点带有同种电荷n3 3 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层分散相质点能与溶剂形成溶剂化层+n每克蛋白质分

23、子能结合克水。每克蛋白质分子能结合克水。n蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及 不能通过半透膜的性质。不能通过半透膜的性质。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionThehydrophobicandhydrophilicpartsonthesurfaceofproteinProtein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionn7.3

24、.2 7.3.2 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀n沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法 ：n1 1）盐析法）盐析法n 盐析一般不引起蛋白质的变性盐析一般不引起蛋白质的变性n2 2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法 脱去水化层及降低介电常数脱去水化层及降低介电常数(酒精，丙酮酒精，丙酮)n3 3）重金属盐沉淀法）重金属盐沉淀法 生成不溶性的复合物生成不溶性的复合物n4 4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法）生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸n5 5）加热变性沉淀法）加热变性沉淀法n7.4 7.4 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则nPri

25、nciples of Protein purificationPrinciples of Protein purificationn蛋白质分离纯化的程序包括：蛋白质分离纯化的程序包括：n1 1）前处理）前处理n2 2）粗分级分离）粗分级分离n3 3）细分级分离）细分级分离n4 4）结晶）结晶n7.5 7.5 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法nMethods of Protein Purification Methods of Protein Purification n根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法：根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法：n1 1）分子大小）分子大小n2 2）溶解

26、度）溶解度n3 3）电荷）电荷n4 4）吸附性质）吸附性质n5 5）对配体分子的生物学亲和力）对配体分子的生物学亲和力n7.5.1 7.5.1 根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法n7.5.1.1 7.5.1.1 透析和超过滤透析和超过滤n常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸。n透析装置透析装置n利用压力和离心力的超过滤装置利用压力和离心力的超过滤装置Methods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purif

27、ication大分子大分子膜膜小分子小分子滤出液滤出液滤出液滤出液小分子小分子进样液进样液进样液进样液蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n密度梯度（区带）离心法密度梯度（区带）离心法n蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大大小小，而且也决定于它的密度密度。Methods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purification凝胶过滤凝胶过滤 gel filtration chromatographygel filtra

28、tion chromatography1903-1906，M.Tswett 将将叶叶绿绿 素素 的的 石石 油油 醚醚 溶溶 液液 通通 过过CaCO3管管柱柱，并并继继续续以以石石油油醚醚淋淋洗洗，由由于于CaCO3对对叶叶绿绿素素中中各各种种色色素素的的吸吸附附能能力力不不同同，色色素素被被逐逐渐渐分分离离，在在管管柱柱中中出出现现了了不不同同颜颜色色的的谱谱带带，所以称色谱图。所以称色谱图。Methods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationnGel Filtration ChromatographyGel Filt

29、ration Chromatographyn也称：也称：凝胶过滤层析 分子排阻层析 凝胶渗透层析 分子筛层析n凝胶的交联度和孔度（网孔大小）决定了凝胶的分离分级范围Gel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn常使用的凝胶有：常使用的凝胶有：n交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex）n聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gelP)n琼脂糖琼脂糖(SepharoseBio-gelA)nGel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn凝胶过滤的原理：凝胶

30、过滤的原理：n当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外的空隙向下移动并最先流出柱外n比网孔小的分子比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠能不同程度地自由出入凝胶珠的内外的内外n这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得到分离到分离凝凝胶胶过过滤滤柱层析的基本装置柱层析的基本装置ColumnColumn 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯

31、化化方方法法 层析柱通常是玻璃层析柱通常是玻璃的。总的说来，长的。总的说来，长柱分辨率高。但大柱分辨率高。但大量物质的处理则用量物质的处理则用粗的柱比较适宜。粗的柱比较适宜。ColumnColumn蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n凝胶过滤的术语:V Vt t 凝胶柱床的总（床）体积凝胶柱床的总（床）体积V Ve e 洗脱体积洗脱体积V V0 0 孔隙体积，外水体积孔隙体积，外水体积V Vi i 内水体积内水体积V Vm m 凝胶基质体积凝胶基质体积 V Vt=t=V Vi i+V+V0 0+V Vm m蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Gel Filtration Chroma

32、tographyGel Filtration Chromatographyn7.5.2 7.5.2 利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.1 7.5.2.1 等电点沉淀和等电点沉淀和pHpH控制控制蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.2 7.5.2.2 蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析n盐溶：少量盐促进蛋白质溶解的现象盐溶：少量盐促进蛋白质溶解的现象n盐析：大量盐使得蛋白质沉淀的现象盐析：大量盐使得蛋白质沉淀的现象n盐析作用盐析作用n 大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水

33、转变为盐离子的水化水n 那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团n 随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀n 最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.3 7.5.2.3 有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法n与与水水互互溶溶的的有有机机溶溶剂剂（如如甲甲醇醇，乙乙醇醇和和丙丙酮酮等等）能能使使蛋蛋白白质质在在水水中中的的溶溶解解度度显显著著降降低低。室室温温下

34、下，有有机机溶溶剂剂不不仅仅能能引引起起蛋蛋白白质质沉沉淀淀，而而且且伴伴随随着着变变性。性。n控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。n有有机机溶溶剂剂引引起起蛋蛋白白质质沉沉淀淀的的主主要要原原因因之之一一是是改改变变了介质的介电常数。了介质的介电常数。n介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.4温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响n在在一一定定温温度度范范围围内内，约约 0-40 0-40 之

35、之间间，大大部部分分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。n人的血红蛋白从人的血红蛋白从0-250-25，溶解度随温度上升而上升，溶解度随温度上升而上升。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法脲或盐酸胍的变性作用脲或盐酸胍的变性作用n7.5.3根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法n7.5.3.1电泳电泳ElectrophoresisElectrophoresisn在在外外电电场场作作用用下下，带带电电颗颗粒粒，如如不不处处于于等等电电点点的的蛋蛋白白质质分分子子，将将向向着着与与其其电电性性相相反反的的电电

36、极移动，这种现象称为电泳极移动，这种现象称为电泳蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn区带电泳(zone electrophoresis)可分四类：na 滤纸电泳和薄膜电泳；nb 粉末电泳；nc 细丝电泳；nd 凝胶电泳，适于分离蛋白质和多核苷酸、核 酸。v电泳装置主要包括两个部分：电源电泳装置主要包括两个部分：电源(电泳仪）和电电泳仪）和电泳槽。泳槽。v电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。分子的迁移。ElectrophoresisElectrophoresis蛋蛋白

37、白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn7.5.3.2 7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳nPolyacrylamide Gel ElectrophoresisPolyacrylamide Gel Electrophoresisn(PAGE)(PAGE)n有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）n不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3 3种物理作用：种物理作用：1.1.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 2.2.分子筛效应分子筛效应 3.3

38、.电荷效应电荷效应蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Polyacrylamide Gel Electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)(PAGE)nThegreaterthenetchargethefasterthemoleculewillmove.nInPAGEtheelectrophoreticseparationiscarriedoutinagelwhichservesasamolecularsieve.nSmallmoleculesmovereadilythroughtheporesinthegel,where

39、aslargermoleculesareretarded.nTheporesizesinthegelcanbecontrolledbychoosingappropriateconcentrationsofacrylamide（丙烯酰胺）（丙烯酰胺）andthecross-linkingreagent,methylenebisacrylamide（甲叉双丙烯酰胺）（甲叉双丙烯酰胺）.nThehighertheconcentrationofacrylamideused,thesmallertheporessizeinthefinalgel.SDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方

40、方法法Acrylamid丙烯酰胺丙烯酰胺N,NmethylenebisacrylamideN，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺v聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的孔孔径径可可以以通通过过改改变变丙丙烯烯酰酰胺胺和和甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺的的浓浓度度来来控控制制，丙丙烯烯酰酰胺胺的的浓浓度度可可以以在在3 33030之间。之间。v低低浓浓度度的的凝凝胶胶具具有有较较大大的的孔孔径径，如如3-43-4的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶对对蛋蛋白白质质没没有有明明显显的的阻阻碍碍作作用用，可可用用于于等等电电聚聚焦焦或作为或作为PAGEPAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离电泳的浓缩胶，也可以用于分

41、离DNADNA。v高高浓浓度度凝凝胶胶具具有有较较小小的的孔孔径径，对对蛋蛋白白质质有有分分子子筛筛的的作作用用，可可以以用用于于根根据据蛋蛋白白质质的的分分子子量量进进行行分分离离的的电电泳泳中中，如如10102020的凝胶常用于的凝胶常用于PAGEPAGE电泳的分离胶。电泳的分离胶。SDS-PAGESDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法SDS-PAGESDS-PAGEnInsodiumdodecylsulfate(SDS)-PAGE,theproteinsaredenaturedandcoatedwithanoverallnegativecharge(duetob

42、oundSDS)andthusthebasisfortheirseparationisonlytheirmassSDS-PAGESDS-PAGEnTheproteinmixtureisfirsttreatedwithareducingagentsuchas2-mercaptoethanol（巯基乙醇）巯基乙醇）ordithiothreitol（二硫叔糖醇）（二硫叔糖醇）tobreakallthedisulfidebonds.nThestronganionicdetergentSDSisthenaddedwhichdisruptsnearlyallthenoncovalentinteractio

43、nsintheprotein,unfoldingthepolypeptidechain.SDS-PAGESDS-PAGEnApproximatelyonemoleculeofSDSbindsviaitshydrophobicalkyl（烷基）（烷基）chaintothepolypeptidebackboneforeverytwoaminoacidresidues,whichgivesthedenaturedproteinalargenetnegativechargethatisproportional(成比成比例例的的)toitsmass蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.3

44、 7.5.3.3 毛细管电泳毛细管电泳 Capillary Electrophoresis Capillary Electrophoresisn电电泳泳是是在在微微内内径径管管（一一般般为为50um50um内内径径和和300um300um外径）内进行的外径）内进行的.n一一般般管管长长50100 50100 cmcm，电电压压1050 1050 kVkV，时时间间1030 min1030 min。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresisn虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而虽然被分析样品因电泳迁

45、移而分离，然而电渗电渗作用作用(electroendosmosis)(electroendosmosis)使他们向负极移使他们向负极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品的电动。由于电渗流很强，其速度一般比样品的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性分子泳速度大，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。都被推向负极。/蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresisn7.5.3.4 7.5.3.4 等电聚焦等电聚焦n（isoelectric focusing,

46、IEFisoelectric focusing,IEF）n等电聚焦或称电聚焦等电聚焦或称电聚焦(electric focusing,EF)(electric focusing,EF)两性电解质两性电解质 pHpH梯度梯度蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing 在在IEFIEF的电泳中，具有的电泳中，具有pHpH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pHpH值逐渐增大。值逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样

47、在碱性区域蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一pHpH位点时失去电荷位点时失去电荷而停止移动，此处介质的而停止移动，此处介质的pHpH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。到它们的等电点上聚焦为止。在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋白质混合物的各在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋白质混合物的各组分将分别聚焦在各自等电点相应的组分将分别聚焦

48、在各自等电点相应的pHpH位置上，形成分离的蛋白位置上，形成分离的蛋白质区带。质区带。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The apparatus of isoelectric focusingThe apparatus of isoelectric focusing蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Application of Application of isoelectric focusin

49、gisoelectric focusing1 1分离等电点不同的蛋白质。分离等电点不同的蛋白质。2 2测定某个未知蛋白质的等电点。测定某个未知蛋白质的等电点。3 3研究蛋白质微观不均一性。研究蛋白质微观不均一性。4 4.蛋白质纯化制备。蛋白质纯化制备。5 5用于用于IEF/SDS-PAGEIEF/SDS-PAGE双向电泳。双向电泳。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusingnIsoelectricfocusingelectrophoretically

50、separatesproteinsonthebasisoftheirrelativecontentofpositivelyandnegativelychargedgroups.WhenaproteinisatitspI,itsnetchargeiszeroandhenceitwillnotmoveinanelectricfieldThe principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusingnInisoelectricfocusing,apolyacrylamidegelisusedwhichhaslarge