黄曲霉毒素的检查方法.pptx

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1、会计学1黄曲霉毒素的检查方法黄曲霉毒素的检查方法第1页/共26页n n由于黄曲霉素在自然界的由于黄曲霉素在自然界的广泛存在广泛存在和对人、和对人、畜等生物的畜等生物的巨巨n n大危害性大危害性（主要为致癌性，（主要为致癌性，WHOWHO将其列为自将其列为自然界最强的三大致癌物之一），国际上将然界最强的三大致癌物之一），国际上将其纳入到严格控制的其纳入到严格控制的有害生物名单有害生物名单之中。之中。农产品黄曲霉素含量是国际上食品卫生和农产品黄曲霉素含量是国际上食品卫生和农产品农产品贸易中的必检指标贸易中的必检指标。在我国加入。在我国加入WTOWTO后，黄曲霉素（后，黄曲霉素（A flatoxin

2、A flatoxin）也常常成为）也常常成为某些国家和组织某些国家和组织限制我国农副产品出口的限制我国农副产品出口的绿色壁垒绿色壁垒，我国已连续多次因为黄曲霉素，我国已连续多次因为黄曲霉素被检出而遭受农产品贸易损失。基于上述被检出而遭受农产品贸易损失。基于上述这些原因，我们必须加强农副产品及饲料这些原因，我们必须加强农副产品及饲料产品中各型黄曲霉素检测的工作。产品中各型黄曲霉素检测的工作。世界公认的三大致癌物：黄曲霉菌、三四苯并芘、亚硝酸盐世界公认的三大致癌物：黄曲霉菌、三四苯并芘、亚硝酸盐第2页/共26页 n n 黄曲霉毒主要存在于发霉的粮、油、花生黄曲霉毒主要存在于发霉的粮、油、花生中，它

3、是黄曲霉及寄生曲霉的代谢产物，中，它是黄曲霉及寄生曲霉的代谢产物，毒性极强，可致肝癌，由于黄曲霉素是一毒性极强，可致肝癌，由于黄曲霉素是一种热稳定的化学物质，所以在烹调过程中种热稳定的化学物质，所以在烹调过程中不易破坏。预防措施主要是防霉。不易破坏。预防措施主要是防霉。但如果食品已但如果食品已但如果食品已但如果食品已霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等

4、。可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等。可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等。可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等。n n 目前已分离鉴定出目前已分离鉴定出1818种，主要是黄曲霉种，主要是黄曲霉毒素毒素B B1 1、B B2 2、G G1 1、G G2 2 以及由以及由B B1 1、B B2 2在体内经过在体内经过羟化而衍生成的代谢产物羟化而衍生成的代谢产物M M1 1、M M2 2 等，等，B B1 1为毒为毒性及致癌性最强的物质。性及致癌性最强的物质。其毒性为氰化钾的其毒性为氰化钾的其毒性为氰化钾的其毒性为氰化钾的10101010倍、砒倍、砒倍、砒倍、砒霜的霜的霜的霜的

5、68686868倍倍倍倍,被列入严管的特剧毒物质！被列入严管的特剧毒物质！被列入严管的特剧毒物质！被列入严管的特剧毒物质！第3页/共26页n n 中药材的采收、加工、销售、直到使用需中药材的采收、加工、销售、直到使用需要一段相当长的时间，如果储存环境不合要一段相当长的时间，如果储存环境不合理，会造成药材或饮片发霉变质，特别是理，会造成药材或饮片发霉变质，特别是含油脂比较丰富的种子类药材，更容易发含油脂比较丰富的种子类药材，更容易发生变质，产生大量黄曲霉素。生变质，产生大量黄曲霉素。n n 2010 2010版中国药典，修改增加了很多版中国药典，修改增加了很多项目，尤其是增加了安全性控制指标，其

6、项目，尤其是增加了安全性控制指标，其中首次增加黄曲霉素控制。中首次增加黄曲霉素控制。第4页/共26页n n 2010201020102010版药典规定每版药典规定每版药典规定每版药典规定每1000g1000g1000g1000g含黄曲霉素含黄曲霉素含黄曲霉素含黄曲霉素B B B B1 1 1 1不得过不得过不得过不得过5g5g5g5g，含黄曲霉素，含黄曲霉素，含黄曲霉素，含黄曲霉素G G G G2 2 2 2、黄曲霉素、黄曲霉素、黄曲霉素、黄曲霉素G G G G1 1 1 1、黄曲霉素、黄曲霉素、黄曲霉素、黄曲霉素B B B B2 2 2 2和和和和黄曲霉素黄曲霉素黄曲霉素黄曲霉素B B B

7、B1 1 1 1的总量不得过的总量不得过的总量不得过的总量不得过10g10g10g10g。n n 在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。第5页/共26页测定方法测定方法n n测定黄曲霉毒素测定黄曲霉毒素测定黄曲霉毒素测定黄曲霉毒素B1B1B1B1的方法有薄层色谱法、高效液的方法有薄层色谱法、高效液的方法有薄层色谱法、高效液的方法有薄

8、层色谱法、高效液相色谱法、荧光光度相色谱法、荧光光度相色谱法、荧光光度相色谱法、荧光光度法法法法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法、免疫亲和层析柱免疫亲和层析柱免疫亲和层析柱免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析高效液相色谱法、免疫亲和层析高效液相色谱法、免疫亲和层析高效液相色谱法、免疫亲和层析柱柱柱柱-荧光光度计法等荧光光度计法等荧光光度计法等荧光光度计法等第6页/共26页薄层分析法薄层分析法(TLC)(TLC)n n最经典、最常用，至今仍为一些检测机构最经典、最常用，至今仍为一些检测机构所用，也是一种国标方法所用，也是一种国标方法 n n

9、原理原理原理原理是用适宜的萃取溶剂将黄曲霉素从试样是用适宜的萃取溶剂将黄曲霉素从试样中萃取出来，经柱层析（中萃取出来，经柱层析（它利用吸附剂对不同物质吸它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法）净化后，再在薄板上展开后分离，利用黄净化后，再在薄板上展开后分离，利用黄曲霉素的荧光特性曲霉素的荧光特性,根据荧光斑点的强弱与根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分很复标准比较确定其含量，对于一些组分很复杂的试样要双向展开，才能获得较高的灵杂的试样要双向展开，才能获得较高的灵敏度敏度n

10、nTLCTLC法设备简单，检测费用低，但操作繁琐法设备简单，检测费用低，但操作繁琐费时，萃取和净化效果不理想，灵敏度差，费时，萃取和净化效果不理想，灵敏度差，对操作人员的身体健康存在较大程度的危对操作人员的身体健康存在较大程度的危害害第7页/共26页 液相色谱法液相色谱法(HPLC)(HPLC)原理是在高效液相色谱仪上添加原理是在高效液相色谱仪上添加原理是在高效液相色谱仪上添加原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统柱后衍生系统柱后衍生系统柱后衍生系统分离，再用分离，再用分离，再用分离，再用荧光检测荧光检测荧光检测荧光检测器器器器测定。当前，该方法大多用测定。当前，该方法大多用测定。当前，该方

11、法大多用测定。当前，该方法大多用免疫亲和柱免疫亲和柱免疫亲和柱免疫亲和柱来净化分离，净化效果优异来净化分离，净化效果优异来净化分离，净化效果优异来净化分离，净化效果优异n n 该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素，检测速度快且该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素，检测速度快且该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素，检测速度快且该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素，检测速度快且定性与定量定性与定量定性与定量定性与定量准确，检测限低，可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵前处理方准确，检测限低，可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵前处理方准确，检测限低，可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵前处理方准确，检测限

12、低，可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵前处理方法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，对操作人对操作人对操作人对操作人员的身体健康仍存在一定的危害员的身体健康仍存在一定的危害员的身体健康仍存在一定的危害员的身体健康仍存在一定的危害柱后衍生：柱后衍生：利用衍生反应使被测物与相应的试剂分析反应，以改变其物理或化学性质，使其被检测到。例如将发色基团或荧光基团键合到样品中去，多极放大检测灵敏度柱后衍生系统：柱后衍生系统：有碘衍生化法、

13、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法免疫亲和柱：免疫亲和柱：基于抗原抗体反应，特异性抗体连接在柱体内，选择性吸附样品中的待检物，杂质不被吸附，流出柱外，柱上结合的目标物再被特定的洗脱液洗下来，可以用于液相色谱(HPLC)分析或者ELISA含量测定，是一种高效的前处理柱。第8页/共26页第9页/共26页第10页/共26页 n n 原理是根据抗体和抗原之间特异性原理是根据抗体和抗原之间特异性原理是根据抗体和抗原之间特异性原理是根据抗体和抗原之间特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的的免疫学反应，最后用测定酶活力的的免疫学反应，最后用测定酶活力的的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来

14、增加测定的灵敏度方法来增加测定的灵敏度方法来增加测定的灵敏度方法来增加测定的灵敏度 ELISA ELISA ELISA ELISA法将已知的待测法将已知的待测法将已知的待测法将已知的待测AFBAFBAFBAFB1 1 1 1抗原抗原抗原抗原(或抗体或抗体或抗体或抗体)吸附于固定载体的免疫吸附吸附于固定载体的免疫吸附吸附于固定载体的免疫吸附吸附于固定载体的免疫吸附剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质,加入酶标记的加入酶标记的加入酶标记的加入酶标记的AFBAFBAFBAFB1 1 1 1 抗体抗体抗体抗体(

15、或抗原或抗原或抗原或抗原)与样与样与样与样品中的待测物品中的待测物品中的待测物品中的待测物(抗原或抗体抗原或抗体抗原或抗体抗原或抗体)发生特异发生特异发生特异发生特异免疫学反应，形成免疫学反应，形成免疫学反应，形成免疫学反应，形成酶标记的抗原一抗酶标记的抗原一抗体复合物体复合物，洗涤后，加入酶底物，进，洗涤后，加入酶底物，进，洗涤后，加入酶底物，进，洗涤后，加入酶底物，进行显色反应，通过颜色的深浅来测定行显色反应，通过颜色的深浅来测定行显色反应，通过颜色的深浅来测定行显色反应，通过颜色的深浅来测定AFBAFBAFBAFB1 1 1 1抗原或抗体的含量。抗原或抗体的含量。抗原或抗体的含量。抗原或

16、抗体的含量。酶联免疫法酶联免疫法(ELISA)(ELISA)第11页/共26页 ELISA ELISA法相对于法相对于HPLCHPLC具有特异性强、干具有特异性强、干扰小，样品的预处理简便，且快速、灵敏、扰小，样品的预处理简便，且快速、灵敏、高效等特点，而且回收率高，提取方法简高效等特点，而且回收率高，提取方法简单，可以进行单，可以进行定性和定量测定定性和定量测定，并且对设，并且对设备装置的投资比备装置的投资比HPLCHPLC降低了许多，大大节降低了许多，大大节约了测试的成本，因而约了测试的成本，因而ELISAELISA已已广泛广泛用于食用于食品中黄曲霉毒素的测定。品中黄曲霉毒素的测定。第12

17、页/共26页n n n n一种常用的国标方法一种常用的国标方法n n原理是利用黄曲霉素各种毒素的原理是利用黄曲霉素各种毒素的荧光特性荧光特性，用荧光光度计测定样品中黄曲霉素的含量。用荧光光度计测定样品中黄曲霉素的含量。大致过程是：试样先经甲醇水大致过程是：试样先经甲醇水提取提取，提，提取液经取液经过滤、稀释过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲后，滤液经过含有黄曲霉素特殊抗体的霉素特殊抗体的免疫亲和柱净化免疫亲和柱净化（生物免疫学原（生物免疫学原（生物免疫学原（生物免疫学原理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能）理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能）理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能）理，此抗体对黄曲

18、霉素具有专一识别功能），黄曲霉素键合，黄曲霉素键合在免疫亲和小柱的抗体上，用蒸馏水将柱在免疫亲和小柱的抗体上，用蒸馏水将柱上的杂质除去后，以甲醇将目标化合物洗上的杂质除去后，以甲醇将目标化合物洗脱下来，加显色剂于专用的荧光光度计中脱下来，加显色剂于专用的荧光光度计中测定样品中的黄曲霉素含量测定样品中的黄曲霉素含量n n该方法对检测人员身体健康无危害该方法对检测人员身体健康无危害,检测速检测速度迅速，灵敏度高，适用于度迅速，灵敏度高，适用于大量试样检测大量试样检测，且且定量定量准确，但检测费用较高，需要配置准确，但检测费用较高，需要配置专用设备，且不能对单一的毒素进行检测专用设备，且不能对单一的

19、毒素进行检测荧光光度法荧光光度法(IAC/SFB)(IAC/SFB)第13页/共26页几种黄曲霉素检测方法的特点几种黄曲霉素检测方法的特点第14页/共26页免疫亲和层析净化高效液相色谱免疫亲和层析净化高效液相色谱法法n n 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此

20、抗体对黄曲霉毒素黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B B B B1 1 1 1，B B B B2 2 2 2,G,G,G,G1 1 1 1，G G G G2 2 2 2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温或吐温或吐温或吐温-20/PBS-20/PBS-20/PBS-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇

21、通过免疫亲和层析将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。测定黄曲霉毒素的含量。测定黄曲霉毒素的含量。测定黄曲霉毒素的含量。n n 将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用是目前采用较多的一种将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用是目前采用较多的一种将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用是目前采用较多的一种将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应

22、用是目前采用较多的一种方法方法方法方法 这些新方法新手段的快速应用这些新方法新手段的快速应用这些新方法新手段的快速应用这些新方法新手段的快速应用 为黄曲霉毒素的检测提供了更广为黄曲霉毒素的检测提供了更广为黄曲霉毒素的检测提供了更广为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地适应了不同的检测目的和要求泛的选择余地适应了不同的检测目的和要求泛的选择余地适应了不同的检测目的和要求泛的选择余地适应了不同的检测目的和要求第15页/共26页免疫亲和层析净化荧光光度法免疫亲和层析净化荧光光度法n n 黄曲霉毒素速测仪 农业部油料及制品质检中心中国农业科学院油料作物研究所根据 GB/T18979-2003研制成0

23、42NYART型黄曲霉毒素速测仪,本仪器采用的是免疫亲和层析净化荧光光度法n n 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B B1 1，B B2 2,G,G1 1，G G2 2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去.以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素(B B1 1+B B2 2+G G1 1+G G2 2)总量。n n该方法准确、简单、快速、安全。该方法准确、简单、快速、安全。第16页/共26页毛细管电泳法毛细管电泳法(CE

24、)(CE)n n是一种新发展起来的分析黄曲霉素的方法是一种新发展起来的分析黄曲霉素的方法 n n该方法与激光减弱荧光检测器该方法与激光减弱荧光检测器(LIF)(LIF)连用连用可很好地提高灵敏度等可很好地提高灵敏度等n n用毛细管电泳激光减弱荧光检测器测定用毛细管电泳激光减弱荧光检测器测定AFBAFB1 1、AFBAFB2 2和和 AFG AFG1 1 、AFGAFG2 2 ，取得了较为理想的，取得了较为理想的分离效果，其中对分离效果，其中对AFBAFB2 2的测定最为灵敏的测定最为灵敏,但但CECE法的法的成本较高成本较高，操作复杂，不适宜在试，操作复杂，不适宜在试样检测中广泛应用样检测中广

25、泛应用第17页/共26页生物传感器法生物传感器法n n是使用是使用固定化技术固定化技术将具有将具有分子识别能力的分子识别能力的生物活性物质生物活性物质与与物理化学换能器物理化学换能器结合，可结合，可以用来探测生物体内外的环境化学物质或以用来探测生物体内外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。其中利用装置。其中利用分子间特异亲和性制备的分子间特异亲和性制备的亲和型生物传感器亲和型生物传感器为免疫传感器。为免疫传感器。根据能量转换器所传导的物理或化学根据能量转换器所传导的物理或化学信号的不同信号的不同,免疫传感器又可分为电化学免免疫传感器又可分为电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器、光学免疫传感器、压电晶体免疫传感器等疫传感器等 由于生物传感器具有选择性高，响应由于生物传感器具有选择性高，响应快操作简单携带方便和适合于现场检测等快操作简单携带方便和适合于现场检测等优点，因此各国科研工作者正积极探索研优点，因此各国科研工作者正积极探索研制新型生物传感器用于检测黄曲霉素。制新型生物传感器用于检测黄曲霉素。第18页/共26页第19页/共26页研第20页/共26页第21页/共26页