氨基酸检测方法.pptx

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1、氨基酸衍生化方法柱后衍生柱前衍生氨基酸衍生化后的氨基酸试剂色谱柱检测器色谱柱检测器第1页/共52页 氨基酸试剂色谱柱检测器柱后衍生色谱柱:阳离子交换柱试剂:茚三酮方法-UV/VIS 检测器 OPA方法-荧光检测器第2页/共52页柱后衍生化分离柱阳离子交换柱使用阳离子交换柱，峰分离度较差。分析所有的氨基酸所需时间较长。蛋白质水解氨基酸(45 min)生物体氨基酸(120 min)第3页/共52页 茚三酮方法伯氨基酸和仲氨基酸（亚氨基酸）检 测:440nm(脯 氨 酸)or 570nm(primary)反应温度:130 反应速度:快 速 试剂稳定性:不稳定（必须冷藏）衍生化产物稳定性:稳定第4页/

2、共52页 茚三酮方法 阳离子交换柱UV/VIS检 测 器 茚三酮试剂130 氨基酸 柱温箱 反应器加热器第5页/共52页OPA 方 法(邻 苯 二 甲 醛)伯氨基酸 检 测：荧光检测器(Ex=350nm,Em=460nm)反应温度：室 温 反应速度：快 速 试剂稳定性:较 差 衍生化产物稳定性：较 差第6页/共52页 脯氨酸和羟基脯氨酸分析 脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 发生反应 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 用下列试剂进行氧化 次氯酸盐 氯胺T第7页/共52页OPA 衍生反应辅助试剂 有硫醇存在时，OPA才会与伯氨基酸发生反应 乙硫醇2-硫基乙醇3-硫基丙酸 (非挥发性)第8页/共5

3、2页OPA 方 法 阳离子交换柱 荧光检测器 氨基酸 柱温箱OPA 试剂 次氯酸盐第9页/共52页 茚三酮方法和OPA方法比较第10页/共52页 衍生化后的氨基酸 色 谱 柱 检 测 器 柱前衍生 色 谱 柱:反相柱(ODS)试 剂:OPA(荧光检测)FMOC(荧光检测)荧 光 胺(荧光检测)DANS-Cl(荧光检测)PITC(UV)第11页/共52页 柱前衍生分离柱 反相色谱柱(ODS)使用反相柱，色谱峰分离良好。分析某些类型的氨基酸所需时间很短 蛋白质水解氨基酸(20 min)生物体氨基酸(60 min)第12页/共52页OPA Method(o-phthaldialdehyde)伯氨基酸

4、检测:荧光检测器(Ex=380nm,Em=420nm)反应温度：室温反应速度：快速第13页/共52页OPA柱前衍生化色谱图生物体氨基酸标准品Shim-pack CLC-ODS第14页/共52页FMCO 方法(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)通用试剂，用于缩氨酸 N端保护第15页/共52页荧光胺方法pH7时与伯氨基酸快速反应易于水解第16页/共52页DANS-Cl 方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)与伯氨基酸和仲氨基酸反应效率低第17页/共52页PITC 方法(phenylisothiocy

5、anate)For peptide and protein sequencing as Edman抯 reagent伯氨基酸和仲氨基酸(碱性条件)反应时间长使用UV检测器，灵敏度低PITCPTC第18页/共52页PTC-氨基酸色谱图STR ODS-II氨基酸标准品第19页/共52页自动氨基酸分析仪对于“柱前”和“柱后”自动氨基酸分析仪来说，采用何种方法更好？要控制反应时间，采用柱后衍生方法更方便。这就是为什么采用柱后衍生法所得结果之重复性更好的原因。柱后衍生重复性,RSD 约为 1%柱前衍生重复性,RSD 2%第20页/共52页Shimadzu 氨基酸分析系统第21页/共52页氨基酸分析流程图

6、第22页/共52页分离柱强酸性阳离子交换树脂 (带有磺化基团的苯乙烯二乙烯基苯共聚物)Na型 and Li型Shim-pack AMINO-Na，用于水解氨基酸分析Shim-pack AMINO-Li，用于生物体氨基酸分析第23页/共52页水解氨基酸色谱图第24页/共52页生物体氨基酸色谱图第25页/共52页流动相 Na型 A 溶液:0.2N 柠檬酸钠 (用高氯酸调 pH至 3.2)B 溶液:0.6N 柠檬酸钠/0.2M 硼酸 (用4M NaOH调 pH至 10.0)C溶液:0.2N NaOH(用于清洗色谱柱)Li 型A 溶液:0.15N 柠檬酸锂/7%甲氧基乙醇 (用硼酸调 pH至 2.6)

7、B溶液:0.3N 柠檬酸锂/0.2M 硼酸 用4M LiOH调 pH至 10.0)C 溶液:0.2N LiOH(用于清洗色谱柱)第26页/共52页PH梯度 H H H R-C-COOH R-C-COOH R-C-COO-NH3+NH2 NH2分离是通过 离子力进行的第27页/共52页N-acetylcystine作为辅助试剂第28页/共52页什么是氨捕集柱?流动相中的氨 无捕集柱有捕集柱第29页/共52页重复性(各250 pmol)(n=10)第30页/共52页线性第31页/共52页高灵敏度分离色谱图 25 pmol 氨基酸标准品第32页/共52页样品预处理脱脂 去蛋白蛋白质水解样品稀释过滤第

8、33页/共52页脱脂脂类组分会影响分析柱使用弱极性溶剂乙酸乙酯氯仿正己烷等两相分离后,水相必须使用0.45 um 滤膜过滤第34页/共52页除蛋白蛋白组分会干扰氨基酸的分离除蛋白试剂酸性溶剂方法有机溶剂方法超滤方法蛋白沉淀物必须采用离心(3000 rpm,5 min)或过滤方法除去.第35页/共52页酸性溶剂方法三氯乙酸(5-10%水溶液)高氯酸(0.1-1%水溶液)除去蛋白后,通过加 NaOH or LiOH 以中和溶液 (溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.)第36页/共52页有机溶剂方法乙腈乙醇聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。如果采用有机溶剂方法,进样量应尽可能小。第37页/共52页超滤方法效率

9、高 成本低第38页/共52页老鼠血清中游离氨基酸分析第39页/共52页牛尿中游离氨基酸分析第40页/共52页猪血粉中游离氨基酸分析第41页/共52页茶叶中游离氨基酸分析第42页/共52页蛋白质水解(1)高氯酸水解方法6N-HCl 110C(N2氛围)22-72 hours色氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸分析不能用此水解方法(可用其它方法).天冬酰胺酸和 谷氨酸 转换成酸的形式。第43页/共52页蛋白质水解(2)碱水解方法4N NaOH 110C(N2 氛围)16-24 hours这一方法用于色氨酸第44页/共52页蛋白质水解(3)过甲酸氧化方法A/B=5/95 110C(N2 氛围)A:30%过氧化氢

10、B:90%甲酸 22-72 h这一方法用于 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸分析第45页/共52页盐酸水解方法实例 从胰腺得到的胰岛素中的水解氨基酸分析第46页/共52页氨基酸残留基团测定值和理论值比较第47页/共52页 碱水解方法实例意大利草中水解氨基酸分析第48页/共52页过甲酸氧化方法实例人发中水解氨基酸分析第49页/共52页样品稀释0.2N 柠檬酸钠缓冲液(pH 2.2)0.2N 柠檬酸锂缓冲液(pH 2.2)用于稀释样品稀释后的最佳浓度约为 5 nmol/ml-10 mmol/ml.第50页/共52页过滤进样前应使用 0.45 mm孔径的滤膜过滤样品第51页/共52页谢谢您的观看！第52页/共52页