普通高中生物课程标准-PCR.ppt

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1、普通高中生物课程标准人类遗传病调查人类遗传病调查基因诊断基因诊断PCR技术技术吴昌进人类遗传病调查人类遗传病调查遗传病概念及其特征遗传病概念及其特征 1.遗传病概念：遗传病概念：遗遗传传病病(geneticdiseases)是是由由于于遗遗传传物物质质改改变变而而导导致致的的疾疾病病。遗遗传传物物质质是是存存在在于于细细胞胞内内的的、决定特定性状的基因。决定特定性状的基因。2遗传病的特征：遗传病的特征：1）在在有有血血缘缘关关系系的的个个体体间间，由由于于遗遗传传继继承承，有有一一定定的的发发病病比比例例；在在无无血血缘缘关关系系的的个个体体间间，尽管属于同一家庭，但无发病者；尽管属于同一家庭

2、，但无发病者；2）有特定的发病年龄和病程；）有特定的发病年龄和病程；3）同卵双生发病一致率远高于异卵双生。）同卵双生发病一致率远高于异卵双生。遗传病分类遗传病分类 1染染色色体体病病（chromosomaldisorders）：由由于于染染色色体体数目或结构异常所引起的疾病，如先天愚型。数目或结构异常所引起的疾病，如先天愚型。2单单基基因因病病（singlegenedisorders）：由由于于单单个个基基因因突变所引起的疾病。突变所引起的疾病。3多多基基因因遗遗传传病病（polygenicdiseases）：由由多多个个微微效效基因与环境因素共同作用所引起的疾病。基因与环境因素共同作用所引起

3、的疾病。4线线粒粒体体遗遗传传病病（mitochondrialdiseases）：由由于于线线粒体基因突变所引起的疾病，呈母系传递。粒体基因突变所引起的疾病，呈母系传递。5.体体细细胞胞遗遗传传病病（somaticcellgeneticdisorders）：由于体细胞遗传物质改变所引起的疾病由于体细胞遗传物质改变所引起的疾病。典型遗传病举例：1.先天愚型（Down Syndrome）(Trisomy 21)1866年年英国医生英国医生JLHDown首先描述首先描述，1959年年法国法国Lejeune证实证实该病的该病的病因病因是是由于由于G组组染色体染色体多了一条，后多了一条，后确定确定为为2

4、1号。号。发病率发病率：1/6001/800。临床表现临床表现：、特殊、特殊面容面容眼距宽、鼻塌平、口半开、流眼距宽、鼻塌平、口半开、流口水口水、耳廓小、耳廓小、手足手足短。短。、发育不良发育不良、肌、肌张力张力低、低、关节松弛关节松弛、新生儿新生儿有有第三囟门第三囟门。、部分患者部分患者有特殊肤纹，如通贯手、有特殊肤纹，如通贯手、atd角达角达64(正常正常人人41)、半数患者半数患者伴有伴有先天先天性性心脏病心脏病，白血病发病率高于正常白血病发病率高于正常20倍倍男性男性基本基本无无生育能力生育能力，女性少数女性少数可有可有生育能力生育能力。大部分寿命大部分寿命不不长，长，少数少数可达可达

5、50岁岁以上以上。本病本病最大最大特点是特点是智力低下智力低下。2121三体照片三体照片典型遗传病举例：2.TurnerTurner综合征综合征 发生率发生率在新生女婴中约为1/5000临床表现临床表现典型患者以性发育幼稚、身材矮小（120-140cm左右）、肘外翻为特征。核型和遗传学核型和遗传学 约55病例为45，X，其次为各种嵌合型和结构异常的核型 预后及治疗预后及治疗典型遗传病举例：3.常染色体完全显性遗传的特征常染色体完全显性遗传的特征）与性别无关，男女患病机会相同。）患者双亲必定有一人为患者。同胞中约有1/2可能性为患者。）连续传递。）双亲无病，子女一般无病。常染色体显性遗传病的遗传

6、常染色体显性遗传病的遗传短指症一短指家系短指畸形（短指畸形（Brachydactyly）autosomaldominantinheritance典型遗传病举例：4.常染色体不规则显性常染色体不规则显性 杂合子的显性基因由于某种原因不表现出相应的 性状，因此有可能在系谱中出现隔代遗传的现象。如：多指症多指畸形多指畸形Polydactyly典型遗传病举例：5.常染色体常染色体隐性遗传病（AR）1.AR的遗传特征）与性别无关，男女发病机会相同。）系谱中表现散发，非连续传递。）患者双亲正常，但都为携带者。）近亲婚配发病率上升。导致疾病发生的基因在常染色体上，为隐性导致疾病发生的基因在常染色体上，为隐性

7、基因基因。且隐性基因纯合时才表现性状。且隐性基因纯合时才表现性状。目前在人类已发现了目前在人类已发现了17001700多种常染色体隐性遗传病多种常染色体隐性遗传病和性状。和性状。白化病白化病 每三万人中会有每三万人中会有一个白化病患者一个白化病患者白化也在其他白化也在其他动物动物出出现现一例白化病系谱一例白化病系谱表现在：患者（1，3，4，11）的双亲（2，3和7，8）表现型正常，但均为致病基因的肯定携带者；系谱中看不到连续遗传现象，常为散发，有的系谱中只见先证者；同胞中约14个体发病，男女性发病机会均等，患者大部分出现在同胞之间，子女往往正常；近亲婚配的后代发病概率显著较高，系谱中的2和37

8、和8都是近亲婚配。典型遗传病举例：6.伴伴X X隐性遗传隐性遗传(sex-linked recessive inheritance,XR)sex-linked recessive inheritance,XR)由由X染色体携带的隐性基因的遗传方式。染色体携带的隐性基因的遗传方式。传递方式为隔代遗传(criss cross pattern of inheritance)男性的出现机会较大儿子的不正常性状一定由母亲遗传 父亲提供Y染色体，则儿子的x染色体必由母亲提供Colorblindness（色盲）色盲）8%maleshavered-greencolorblindness（男性发生率男性发生率8

9、.0%,女性为女性为0.5%）redcolorblindnesscantseeredgreencolorblindnesscantseegreensbothareX-linkedrecessivetraits(maptotheXchromosome)Bluecolorblindness（兰色色盲）兰色色盲）autosomalrecessive（常染色体隐性）常染色体隐性）mapstochromosome7一例红绿色盲系谱一例红绿色盲系谱：男性患者过远多于女性患者，系谱中的病人几乎都是男性；男性患者的双亲都无病，其致病基因来自携带者母亲；由于交叉遗传，男患者的同胞、舅父、姨表兄弟、外甥中常见到患

10、者，偶见外祖父发病，在此情况下，男患者的舅父一般正常；由于男患者的子女都是正常的，所以代与代间可见明显的不连续（隔代遗传）。遗传病调查调查人群中的遗传病（种类、人群中出现的概率）遗传病家系调查：发放家系调查表，系谱分析 基因诊断基因诊断基因诊断的概念基因诊断的概念分子诊断分子诊断，是通过对某个遗传病患者的某一特定基因或其转录物进行分析并作出诊断的技术。直接诊断被检者的DNA或RNA。发展最快，前景最好。直接DNA检测缺失、突变、重排.。间接遗传标记检测多态性，连锁分析。基因诊断技术：分子杂交、分子扩增、分子测序。基因诊断基因诊断的方法与原理的方法与原理 核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一

11、。它的基核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。它的基本原理是：互补的本原理是：互补的DNADNA单链能够在一定条件下结合成双链，单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在补的原则进行，它不仅能在DNADNA和和DNADNA之间进行，也能在之间进行，也能在DNADNA和和RNARNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组探针，与变性后的单链基因组DNADNA接触时，如果两者的碱基接触时，如果两者的碱基

12、完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组组DNADNA中含有已知的基因序列。由此可见中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有，进行基因检测有两个必要条件：两个必要条件：一是一是必需的特异的必需的特异的DNADNA探针探针；二是；二是必需的基必需的基因组因组DNADNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。常用基因诊断技术 Southern印迹法（Southern blot）聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）Southernblot基因治

13、疗 基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。基因治疗就是利用分子生物学技术，将正常的基因直接或间接转入细胞中以修补错误基因。基因治疗的策略 基因治疗主要以两种策略达到治疗目的。其一是正常基因来纠正突变基因，也就是在原位修复缺陷基因的直接疗法，此乃理想的基因治疗策略，由于多种困难，目前尚未实现；其二是用正常基因不替代致病基因的间接疗法，此法较前者难度小，也是目前众多主张采用的策略，并已付诸临床实践。基因治疗的途径(1

14、)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。基因的这种转移一般只能用显微注射，然而效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，这难适用于人类。而在人类实行基因转移到生殖细胞，并世代遗传，又涉及伦理学问题。因此，就人类而言，目前多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。基因治疗的途径(2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，

15、以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。对特定座位基因转移，目前还有很大困难。基因治疗的步骤一是确定致病基因的位置，或者说找到基因的位点。二是找到治疗基因，即能够修复或替代异常基因的基因。三是找到载体，把治疗基因运送到人体中去。四是使治疗基因在人体细胞内复制、表达。基因治疗的科学性原则基因治疗要具备下列条件才可以进行：（1）具有合适的靶基因，即作为替代、修复或调控的目标基因。（2）具有合适的靶细胞，即接受靶基因的细胞。（3）具有高效专一的基因转移方法，以

16、使外源靶基因导入靶细胞内。（4）基因转移后对组织、细胞无害。（5）在动物模型实验中具有安全、有效的治疗效果。（6）过渡到临床试验或应用前需向国家有关审批部门报批。基因治疗的现状与前景1复合免疫缺陷综合征的基因治疗 1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素（IL2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约12月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25，未见明显副作用

17、。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。2黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte-TIL,即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF肿瘤细胞和IL2肿瘤细胞方案，即分别将IL2基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis ractor,TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL2合并用于病人，结

18、果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。基因治疗的历史与现状1975年，一批前联邦德国科学家试图使用病毒感染法对缺乏某种稀有酶而患痴呆症的两姐妹进行基因补充治疗以来，基因治疗已从实验室进入临床。1990年美国国立卫生研究院（NIH）的布雷斯（Blase RM）和安德森（Anderson WF）用ADA（腺苷酸脱氨酶）基因治愈一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺陷的4岁女孩，致使世界各国都掀起了研究基因治疗的热潮，至今基因治疗的研究内容也从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋

19、病、心血管病、神经系统疾病、自身免疫病和内分泌疾病等。目前美国食品与药品管理局（FDA）批准在肿瘤、基因标记、单基因遗传病、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和脉管疾病等218项基因治疗项目上可进行临床应用。英国一岁半大的男孩伊文接受国家基因改造手术成功，成为英国第一名接受基因改造的婴儿，堪称医学界的奇迹。我国复旦大学遗传研究所与第二军医大学合作，于1991年12月对两例血友病B患者进行基因治疗并取得初步效果。1997年上海市神经外科研究所，分别为35例大脑恶质胶质瘤患者进行基因治疗，获得满意进展，处于国际领先水平。据统计，截止1998年年底，世界范围内已有373个临床法案被实施，累计31

20、34人接受了基因转移试验，充分显示了其巨大的开发潜力及应用前景。PCR技术技术KaryKary Mullis(1985)Mullis(1985)发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR技术自动化。专利官司专利官司1987年美国专利局专利授权1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决

21、定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属CetusCetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器PCRPCR发展速度发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿

22、大籍英国科学家Michael Smith共获 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCR(polymerase chain reaction)Denaturation（变性）Annealing（复性）Extension（延伸）原理原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR原理PCR原理变性PCR原理复性引物引物引物引物PCR原理延伸在在DNA聚合酶的作用下，利用聚

23、合酶的作用下，利用4种种dNTP，合成的互补链合成的互补链PCR原理变性PCR原理复性PCR原理延伸PCR原理变性PCR原理复性PCR原理延伸 DNADNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n)，其中长片段以线性形式扩增其中长片段以线性形式扩增(2(2n+2)n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,7m)(25-35)PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。2401625

24、611452228200短片段（单链）1412108642长片段（单链）128643216总片段（单链）循环数目的片段（双）000822252114PCRPCR实验程序实验程序模板模板(template DNA template DNA or RNA),or RNA),引物（引物（primers primers）聚合酶聚合酶TaqTaq enzyme,enzyme,缓冲液缓冲液1010PCR PCR buffer,buffer,MgMg+,+,5mmol/L5mmol/L dNTPs dNTPspre-pre-denaturationdenaturation-denature denature

25、 completelycompletelyDenaturationDenaturationannealingannealingElongationElongationcycles:25-30cycles:25-30PCR optimizationPCR optimization变性温度和时间92-95，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72，接近Taq酶的最适75时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，

26、则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加PCR is used widely in:Molecular cloning（分子克隆）Pathogen detection（病理检查）Genetic engineering（遗传工程）Mutagenesis（突变形成）Genetics,producing molecular markers（分子标记）PCRPCR技术的应用技术的应用遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病传染性疾病肝炎性病肿瘤法医学法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很

27、少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜 牧畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼植物保护杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分其他考古学植物分类学群体生态学谢谢您的参与！谢谢您的参与！