生物化学实验报告2010范文.pdf

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1、孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法 一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下

2、加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540 nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂 1实验材料 小麦面粉(1000 g)2主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL11 （2）滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2

3、；10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗（10）天平 （11）分光光度计 3 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80 烘至恒重的分析纯葡萄糖 100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取 6.5 g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000 mL容量瓶中，加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL，再加入 45 g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000 mL。（3）碘-碘化钾溶液：

4、称取 5 g 碘和 10 g 碘化钾，溶于 100 mL 蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取 0.1 g 酚酞，溶于 250 mL 70%乙醇中。（5）6 M HCl 和 6 M NaOH 各 100 mL。（分别取 59.19 mL 37%浓盐酸和 24 克 NaOH 定容至 100mL）四、操作步骤 1.制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年 月 日 取 7 支 20 mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1 mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL）蒸馏水

5、（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至 540 nm，用 0 号管调零点，等后面 710 号管准备好后，测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲

6、线。葡萄糖标准曲线 2.样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取 准确称取 3.00 g 食用面粉，放入 100 mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50 mL蒸馏水，搅匀，置于 50 恒温水浴中保温 20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在 100 mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取 准确称取 1.00 g 食用面粉，放入 100 mL 三角瓶中，加 15 mL 蒸馏水及 10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解 30 min,取出 12 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完

7、全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂，以 6 mol/L NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100 mL，过滤取滤液 10 mL 于 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释 1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色 葡萄糖含量（mg）光密度值 取 4 支 20 mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540 nm，用 0 号管调零点，测出 710 号管的光密度值。表

8、 2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算 计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积 测定时取用体积 100=样品毫克数 六、注意 1.标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

9、2.面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题 1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓 HCl 处理？而在其测定前，又为何要用 NaOH 中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设 0 号管有什么意义？3.绘制标准曲线的目的是什么？总糖（%）=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数 0.9100=样品毫克数 孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验二 油脂酸价的测定 一、目的与要求 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。二、实验原理 油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并

10、且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和 1g 油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。三、主要仪器、实验材料和试剂 1.锥形瓶（250 mL）3 个；2.量筒（50 mL）1 支；3.碱式滴定管 1 支；4.花生油、菜油、芝麻油等；5.乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；6.0.1 KOH（1 克 KOH 溶于 1000 mL 纯水中）。四、操作步骤 1.准确称取 12 g 油脂于 250 mL 锥形瓶中。2.在瓶内加入乙醇乙

11、醚混合液 50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入 1酚酞指示剂 35 滴，立即用 0.1 KOH 标准溶液滴定至溶液成微红色（放置 30 S 内不褪色）为终点，并记录用去的 KOH 的体积，并按下式进行计算。酸价2(V2-V1)/W V2：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数 V1：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数 W：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。五、实验结果 油脂名称 起始刻度 终点刻度 体积（mL）酸价 备注 空白对照 六、思考题 请

12、对你的实验结果进行分析。批阅教师：年 月 日 孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验三 蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求 掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在 280 nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度 OD280nm与其浓度呈正

13、比关系，可作定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂 1.试验材料：萌发 3 天的小麦种子 2.主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管（5）研钵 （6）100 mL 容量瓶 3试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为 1mg/mL（0.5 克标准牛血清蛋白纯水定容至 500 mL）的溶液。四、操作步骤 1蛋白质（淀粉酶）的提取 称取 1g 萌发 3 天的小麦种子（芽长约 1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和 2 mL 蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用 6 mL 蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置

14、提取 1520 min，每隔数分钟搅动 1 次，使其充分提取。然后在 3,000 r/min 转速下离心 10 min，将上清液倒入 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。2.标准曲线制作 按表 1 分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为 1 cm 的石英比色杯，在 280 nm 波长处测定各管溶液的光密度值 OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。批阅教师：年 月 日 表 1 蛋白质标准曲线制作 管号 标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm 1 0 4 0 2 0.5 3

15、.5 0.125 3 1.0 3.0 0.25 4 1.5 2.5 0.375 5 2.0 2.0 0.50 6 2.5 1.5 0.625 7 3.0 1.0 0.75 8 4.0 0 1.0 3.样品测定 取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定 280 nm 的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于 2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。蛋白质浓度=五、思考题 1.为何要在 280 nm 波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？2.如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？孝感学院生命科学技术学

16、院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验四 淀粉酶活力的测定 一、目的与要求 学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、实验原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使 3,5-二硝基水杨酸还原，生

17、成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在 70 15min 钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力

18、+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂 1实验材料 萌发的小麦种子（芽长约 1cm）2仪器（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：50mL1,100mL1（6）恒温水浴（7）20mL 具塞刻度试管13（8）试管架（9）刻度吸管：2mL3,1mL2,10mL1（10）分光光度计 3试剂（均为分析纯）（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取 100mg 麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至 100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取 3,5-二硝基水杨酸 1g，溶于 20 mL 2 mol/L NaOH 溶液中，加入

19、50 mL 蒸馏水，再加入 30 g 酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至 100 mL。盖紧瓶塞，勿使 CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液 A 液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取 C6H8O7H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至 1L。B 液：（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取 Na3C6H5O72H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至 1L。取 A 液 55mL 与 B 液 145mL 混匀，既为 0.1mol/LpH5.6 的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取 1g 淀粉溶于 100mL 0.1mol/L pH5.6

20、的柠檬酸缓冲液中。批阅教师：年 月 日 四、操作步骤 1麦芽糖标准曲线的制作 取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 1 加入试剂：表 1 麦芽糖标准曲线制作 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（mL）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 蒸馏水（mL）2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 3,5-二硝基水杨酸（mL）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 吸光度值 摇匀，置沸水浴中煮沸 5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 mL。以 1 号管作

21、为空白调零点，在 540 nm 波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2淀粉酶液的制备 称取 1g 萌发 3 天的小麦种子（芽长约 1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和 2 mL 蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用 6 mL 蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取 1520 min，每隔数分钟搅动 1 次，使其充分提取。然后在 3 000r/min 转速下离心 10min，将上清液倒入 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液 10 mL，放入 50 mL 容量瓶中，用蒸

22、馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。3酶活力的测定：取 6 支干净的试管，编号，按表 2 进行操作。表 2 酶活力测定取样表 将各试管摇匀，置沸水浴中煮沸 5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 mL。以 1 号管（做标准曲线时用过的）作为空白调零点，在 540 nm 波长下比色测定光密度，记录测定结果。管号-1-2-3-4-5-6 吸光度 麦芽糖含量 五、结果计算 计算-2、-3 光密度平均值与-1 光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算-淀粉酶的活力。计算-5、-6 光密度平均值与-4 光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦

23、芽糖含量（mg），按下式计算（）淀粉酶总活力(单位同上)。（）淀粉酶总活力 -淀粉酶活力（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力 六、思考题 1为什么要将-1、-2、-3 号试管中的淀粉酶原液置 70 水浴中保温 15min？2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和 1%淀粉溶液分别置于 40 水浴中保温？操 作 项 目 -淀粉酶活力测定 -淀粉酶活力测定 -1 -2 -3 -4 -5 -6 淀粉酶原液（mL）1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化-淀粉酶 置 70 水浴 15min，冷却 淀粉酶稀释液（mL）0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸（mL）2.0 0 0 2.0 0.0 预保

24、温 将各试管和 1%淀粉溶液分别置于 40恒温水浴中保温 10 min 1%淀粉溶液（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 在 40恒温水浴中准确保温 5min 3,5-二硝基水杨酸（mL）0 2.0 2.0 0 2.0 2.0 孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 一、目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理 带电质点在电场中移动的现象称为电泳。电泳有很多类型，如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。任何一种物质的质点，

25、由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。不同的质点在同一电场中泳动速度不同，据此可将不同带电物质分开。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅 120 微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。三、

26、器材及试剂 1器材：醋酸纤维薄膜（28cm）玻璃板 常压电泳仪 竹镊 点样器（盖玻片）白磁反应板 培养皿（染色及漂洗用）人血清或鸡血清 粗滤纸 2试剂：巴比妥缓冲液（PH8.6）：巴比妥 2.76 克，巴比妥纳 15.45 克，加水至 1000 毫升。染色液：氨基黑 10B 0.25 克，甲醇 50 毫升，冰醋酸 10 毫升，水 40 毫升（可重复用）。漂洗液：含甲醇或乙醇 45 毫升，冰醋酸 5 毫升，水 50 毫升。透明液：含无水乙醇 7 份，冰醋酸 3 份。四、操作步骤 1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜 1 张（识别出光泽面与无光泽面，并在无光泽面角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡 20

27、分钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端 23 厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。批阅教师：年 月 日 3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极

28、。盖严电泳室。通电。调节电压至 160V，电流强度 0.40.7 毫安/厘米膜宽，电泳时间约为 60 分钟。4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡 10 分钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。6定量（了解）：有两种方法（1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于 4.0ml 0.4mol L-1NaOH溶液中（37）510 分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：OD白、OD1、OD2、OD、OD。则光密度总和（OD总）为：OD总=OD白+OD1+OD2+OD+OD 白蛋白%=总白O

29、DOD100 1球蛋白%=总ODOD1100 2球蛋白%=总ODOD2100 球蛋白%=总ODOD100 球蛋白%=总ODOD100（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约 510 分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。五、思考题 1点样端为何放在负极？2实验中应注意哪些事项？膜条+样品 孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验六 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一、实验目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

30、二、实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 Rf 值(比移)来表示的：Rf=原点到层析中心的距离/原点到容剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材 1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、小烧杯 6、长颈漏斗 7、层析滤纸(新华一号)8、电吹风 四、试剂 1、扩展剂 正丁醇:88%甲酸:水15:2.5:2.5（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制 40 mL。2、氨基

31、酸溶液 05的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为 05)。3、显色剂 50l00 mL 0.1 水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作 1将盛有扩展剂 10 mL 的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。2戴手套取层析滤纸(长 22 cm、宽 14 cm)一张。在纸的一端距边缘 23 cm 处用铅笔划一条直 线，在此直线上每间隔 2.5 cm 作一记号。3点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 5 个位置上，干后重复点一次，直径最大不超过 3 mm。缝成筒状，两边不能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约 1030 分钟。4展层 用长颈漏斗，扩展剂的液面需低于点样

32、线 1cm。溶剂扩展至滤纸上沿约 5 厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。5显色 用 0.1%茚三酮丙酮溶液均匀浸透，用热风吹干。脯氨酸、羟脯氨酸产生黄色物质外，所有 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。批阅教师：年 月 日 6计算各种氨基酸的 Rf 值。六、实验结果 各种氨基酸的 Rf 值：赖氨酸 脯氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 Rf 值 七、思考题 1.实验过程中切勿用手直接接触滤纸和显色剂，为什么？2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为什么？溶剂前沿 层析点 原点 溶剂前沿 亮 苯丙 缬 脯 赖 孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：

33、实验七 基因组 DNA 的快速提取-碘化钾法 一、实验目的 了解碘化钾法提取动物组织基因组 DNA 的原理；掌握 DNA 提取的相关操作技术。二、实验原理 快速、经济地从血液、组织或培养细胞中得到高产量、高纯度的 DNA 对于基因研究非常重要。目前国内外基因组 DNA 的提取方法有传统的蛋白酶 K 消化法、尿素法、氯化锌法、辛酸法等，这些方法存在操作步骤繁杂或者使用蛋白酶，且国内许多实验室不易得到方法中使用的试剂。高浓度碘化钾可直接将细胞膜、核膜破坏、使 DNA 释放出来，然后用异丙醇沉淀 DNA。实验表明，KI 的浓度对 DNA 的提取效率有影响，5 mol/L 的 KI 提取 DNA 效果

34、较好。KI 法操作简便，不用价格较高的蛋白酶 K。DNA 丢失少。该方法提取的 DNA 与经典的蛋白酶 K 法提取的 DNA 比较电泳结果基本一致。三、实验材料、试剂及主要器材 1.实验材料 冷冻的新鲜动物肝脏。2.试剂 氯仿/异戊醇（241）:异戊醇 21 mL 加入到 500 mL 的氯仿试剂瓶中，混匀；5 mol/L 碘化钾：（41.5 克碘化钾溶于 50 mL 纯水中）；0.9%NaCl：4.5 克 NaCl 溶于 500 mL 纯水中；无水乙醇。3.主要器材 台式高速(冷冻)离心机、移液器（10,100，1000 L），旋涡混合器、Eppendorf 管等。四、实验步骤 1.取黄豆粒

35、大小冷冻肝组织于 EP 管中（EP 管上写上自己学号的最后两位数），有眼科剪捣碎；2.加 50 L 5 mol/L KI，旋涡振荡 30 s，静置 3 min；3.加 0.9%NaCl 375 L，氯仿/异戊醇(24:1)600 L，充分振荡 10 min，10 000 r/min 离心 5 min；4.吸取水相层(上清)于另一 Ependorf 管中，加-20 度预冷乙醇 1000 L，轻轻混匀（此时应能看到 DNA 的絮状沉淀），12 000 r/min 离心 5 min 弃上清；5.加冷无水乙醇 1000 L，12，000 r/min 离心 3 min 弃净乙醇，待干（可在 37 烘干约

36、10 min）；以 50 L 无菌双蒸水溶解 DNA，备用。2.加 50 L 5 mol/L KI，旋涡振荡 30 s，将沉淀物混匀 3 min；3.加 0.9%NaCl 250 L，氯仿/异戊醇(241)375 L，充分振荡 10 min，10 000 r/min 离心 5 min；4.吸取水相层(上清)于另一 Ependorf 管中，加-20 度预冷乙醇（-20 度）300 L，轻轻混匀（此时应能看到 DNA 的絮状沉淀），-20 度冰箱静置 5 min 后 12 000 r/min 离心 5 min 弃上清；批阅教师：年 月 日 5.加冷无水乙醇 1000 L，12，000 r/min

37、离心 3 min 弃净乙醇，待干（可在 37烘干约 10 min）；以 50 L 无菌双蒸水溶解 DNA，备用。五、思考题 1）在 DNA 提取过程中乙醇的作用是什么？为什么用-20 度预冷的乙醇效果更好？2）实验所用的 EP 管和枪头等需要高温灭菌吗，为什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验 八 琼脂糖凝胶电泳技术DNA 样品检测 一、实验目的 学习与掌握琼脂糖凝胶电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 含量以及分子量，分离不同大小 DNA 片段。二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支撑物的区带电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相

38、同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的 DNA 可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。三、试剂配制 1.5TBE：Tris 54g；硼酸 27.5g；0.5 M EDTA（pH 8.0）20 mL；加双蒸水至 1 L。用时5倍稀释。2.EB：用水配制成 10 mg/mL 的贮存液，分装，避光，4保存（1g 溴乙锭于 100 mL 水中）。3.6加样 buffer：0.25%溴酚蓝；40%（W/V）蔗糖；溶于水中，贮存于 4。四、实验操作 1.胶模 水平放置胶模。2.制胶 量取 200 mL

39、1TBE 缓冲液倒入三角烧瓶中，称取 1.6 克琼脂糖加入，在微波炉上加热至全熔（清澈透明）。凝胶加热时间不宜过长，以免蒸干。3.倒胶 用琼脂糖封好胶模，待凝胶冷至 50左右时（手感容器能耐受），缓缓倒入制胶模中，迅速放好梳子。凝胶的厚度在 35 mm 之间。避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡，可用吸管小心吸去。4.凝胶条件 凝胶通常需要在室温中放置030 分钟。5.电泳缓冲液 凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中（点样孔在负极），加入 1TBE 电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面 1 mm。6.拔梳子 小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整。7.点样 用移液器取 1-2 L 配制好的 L

40、oading Buffer，分别与需要电泳的样品或 Marker 混合(5-10 L)，点样，记录点样次序。注意：每次电泳每块胶需留一孔点 DNA marker。加样时 Tip头不必插入孔中，可对准加样孔，在孔的上方加样，样品会沉入孔内。8.电泳 开启电泳仪电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则表示电泳槽已经接通电源。电泳起始时需采用低压（80100V），待电泳几分钟后溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中，可调整电压至 200V 恒压电泳，当溴芬兰接近胶的先端，停止电泳。9.观测将胶在溴化乙锭（EB）溶液中浸泡约 10 分钟后，在用凝胶成像仪积分成像后观察并拍照。批阅教师：年 月 日 五、实验结果 DNA 样品琼脂糖凝胶电泳检测图（在自己的点样孔上做上记号）。六、思考题 1、如果实验成功了，请总结经验；如果实验失败了，请分析原因。2、谈谈对生物化学实验的看法和建议。