2022年淮海工学院生物化学大实验报告niujun .pdf

《2022年淮海工学院生物化学大实验报告niujun .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年淮海工学院生物化学大实验报告niujun .pdf（16页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、海 洋 学 院综合大实验报告专业：生物技术班级生技 121 班姓名： newjhon 学号：2 1题目：生物化学大实验指导教师：孙玉英2014-2015 学 年第 1 学期2014 年 12 月 22 日 - 2015 年 1 月 2 日精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 16 页1 酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响班级：生技 121 ：牛军学号： 20121211111 【摘要】本实验采用控制变量法分别研究唾液淀粉酶的特异性以及温度、pH对该酶活性的影响，得出结论：唾液淀粉酶对淀粉有水解作用；在37和，酶的作用效果分别

2、是最好的。【关键词】唾液淀粉酶，温度，pH ，特异性1 前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一种水解酶，具有水解可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等 -1,4- 葡聚糖，水解 -1,4- 糖苷键的酶。本实验通过比较在不同条件下唾液淀粉酶对淀粉水解后的显色反应颜色的不同，进而了解不同温度、pH对唾液淀粉酶活性的影响以及该酶的特异性。2 材料及方法主要材料为人的唾液以及淀粉溶液试剂蒸馏水NaCl分析纯，中国上海试剂一厂，可溶性淀粉化学纯，广州医药站化学试剂公司，蔗糖分析纯，国药集团化学试剂，CuSO4分析纯，上海试一化学试剂，柠檬酸钠分析纯，中国上海试剂一厂，无水 Na2CO3分析纯，南京化学试剂一厂，KI化学

3、纯，南京化学试剂，Na2HPO42H2O 分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂，浓 HCl分析纯，南京化学试剂，NaOH 。配制试剂唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，12 分钟后，吐入 50mL烧杯中，备用。Benedict 试剂A、取 CuSO417.3g 溶于 100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL ；B、取柠檬酸钠 173g 及无水 Na2CO3100g，加水 600mL加热使之溶解，冷后稀释至 850mL ；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 16 页2 C、将 A 液缓慢注入 B液中，混匀备用。可

4、长期保存。pH 1.5 溶液：取 Na2HPO42H2柠檬酸钠 38.8mL，然后用浓 HCl 调至 pH1.5 左右；pH 6.8 溶液：取 Na2HPO42H2柠檬酸钠 18.2mL；pH 9.8 溶液：取 Na2HPO4柠檬酸钠 2.2mL，然后用 0.1MNaOH 调至 pH9.8 左右；0.3%NaCl的 0.5%的淀粉液：称取可溶性淀粉、 NaCl 于烧杯中，加入 200mL水，于电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直至液体澄清。待冷却后转移至250mL容量瓶，定容。0.5%的蔗糖溶液：称取蔗糖，加水溶解，定容至100mL 。KI-I溶液：称取碘化钾 3g 溶于蒸馏水中，待全部溶解后

5、再加I1g ，振荡溶解，定容至 100mL 。仪器试管 10 支移液管 7 支胶头滴管，小烧杯 50，100ml大烧杯 1000mlBP221S型电子天平HW YS型电子恒温水浴 37A型 50Hz 220V800W双层铁皮电炉石棉网pH试纸，洗耳球容量瓶玻璃棒试管架酶的特异性1取两支试管编号、，号加入0.5%的淀粉液 2mL,号加入 0.5%的蔗糖液 2mL ；2与两支试管各加入制备好的唾液1mL ；3将两支试管同时放入37恒温水浴锅中保温；415 分钟后，取出两试管，各加入Benedict 试剂 1mL ；5将两试管同时放入沸水中煮沸6 分钟；6取两支试管，观察记录颜色的变化，并注意是否有

6、红棕色产生。表 1 酶的特异性验证试剂管号精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 16 页3 0.5%的淀粉液 mL 2 0.5%的蔗糖液 mL 2 制备好的唾液 mL 1 1 37恒温水浴保温15min Benedict 试剂 mL 1 1 沸水浴 6 分钟观察记录颜色的变化温度对酶活性的影响取三支试管并编号、 、，同时加入 5mL0.5% 淀粉液及 1mL唾液混匀；将管 、管 、管 同时分别放入冰浴、 37水浴、沸水浴中；15 分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化。表 2 温度对酶活性的影响试剂管号0.

7、5%淀粉液 mL 5 5 5 唾液 mL 1 1 1 水浴 15min冰浴37沸水浴碘液数滴数滴数滴2.2.3 pH 对酶活性的影响取试管 3 支编号 6、7、8，按下表加入试剂；3 支试管同时放入 37恒温水浴锅内保温；15 分钟后，取出 3 支试管，分别加入碘试剂数滴，每加一滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。表 3 pH 对酶活性的影响试剂管号0.5%淀粉液 mL 2 2 2 pH1.5 溶液 mL 1 pH6.8 溶液 mL 1 pH9.8 溶液 mL 1 唾液 mL 1 1 1 37恒温水浴保温15min 碘液数滴数滴数滴3 结果与分析31 实验结果酶的特异性精选学习资料 - - -

8、- - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 16 页4 实验现象：号试管经沸水浴后，试管内颜色仍为蓝色，但在试管底部可以看出有些许砖红色沉淀出现；号试管经沸水浴后颜色没有发生变化( 仍为浅蓝色。如图 1图 1 酶的特异性实验现象说明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。说明唾液淀粉酶具有特异性。温度对酶活性的影响实验现象：号试管加5 滴碘液并混匀后颜色趋近与碘液原来的颜色，但较号试管颜色较深； 号试管加 5 滴碘液并混匀后也趋近碘液本身颜色，但比碘液颜色浅；号试管加5 滴碘液并混匀后变成深蓝紫色。如图2。图 2 温度对酶活性的影响实验现象说明：经过冰水浴后

9、，唾液淀粉酶活性降低，但仍能将淀粉分解成葡萄糖；而在37条件下唾液淀粉酶活性较高，将淀粉分解成葡萄糖。说明低温对唾液淀粉酶活性有一定影响。经过沸水浴后， 唾液淀粉酶变性， 不能分解淀粉。3.1.3 pH 对酶活性的影响实验现象：号试管逐滴加入3 滴碘液并混匀后变成酒红色；号试管逐滴加入 3 滴碘液并混匀后接近碘液本身的颜色；号试管逐滴加入3 滴碘液并混匀后变成浅蓝黄色。如图3。号试管号试管精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 16 页5 图 3 pH 对酶活性的影响实验现象说明： pH 为 1.5 强酸性条件下，唾液淀粉酶可以

10、水解淀粉；pH 为 6.8 接近中性条件下，唾液淀粉酶活性较高，能水解淀粉；pH 为 9.8碱性条件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是较pH 1.5 和 pH 9.8 相比，酶的活性较弱。本实验研究酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响得到以下结果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，验证了酶的特异性， 与理论相符。 在温度对酶活性影响实验中， 由颜色变化可以得出结论： 高温降低酶活性， 低温对酶活有较小的抑制作用。 在 pH对酶活性影响实验中， 得出的结论是： 高 pH对酶活抑制较大，低 pH对酶活抑制较小。4 讨论从实验中可以得出结论：唾液淀粉酶具有高度特异性，其活性受温度、pH值等多种因素

11、影响。但本组实验所得砖红色沉淀较少， 有些实验组没有沉淀产生，导致实验与预期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明显的个体差异，因而为了确定恰当的唾液稀释倍数和反应时间，建议在原实验项目之前增加唾液稀释倍数确定实验。唾液淀粉酶活性存在明显的性别差异1和个体差异，不同个体的酶活性相差到达上百倍， 其主要是由于编码该酶的基因在体内的拷贝数差异所决定的2-3在进行该实验操作过程中会发现不同同学的唾液淀粉酶活力不同，在实验过程中所用的唾液的稀释倍数也不同。本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果有差异，且发现有实验证明酶的活性在沸水浴( 95 ) 中并没有受到影响，反而比恒温水浴( 37 ) 反应

12、的更彻底4；本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果不一，需要改进实验方案：不要检测反应物( 淀粉) ，用斐林试剂检测产物 ( 复原糖 )进行判断，且注意斐林试剂的用量为 5%HCl 用量的 2 倍5。因此，要进一步探究温度、pH对酶活性的影响，确定酶的最适温度和最适 pH ，需要更加严格周密的实验方案。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 16 页6 5 参考文献1 归改霞 . 性别不同对唾液淀粉酶活性影响的研究. 卫生职业 2013,31(24):110-11 2 Perry GH, Dominy NJ, Claw

13、KG, et al. Diet and the evolution of human amylase gene copy number variation J. Nat Genet, 2007,39:1256-1260. 3 Mandel AL, Peyrot des Gachons C, Plank KL, et al. Individual Differences in AMY1 gene copy number, salivary a-amylase levels and the perception of oral starch J. PLoS ONE, 2010, 5: 13352.

14、 学院学报 ,2013,25(5):613-616 5 范淑秋 .pH 影响淀粉酶活性的探究 . 生物学通报 ,2008,43(10):49-50 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 16 页7 血红蛋白凝胶过滤层析班级：生技 121 ：牛军学号： 20121211111 【摘要】本实验利用Sephadex G 25 制备凝胶柱，通过凝胶过滤层析的方法，从新鲜鸡血中制备鸡的血红蛋白， 经洗脱液不断洗脱最终收集到含有鸡血红蛋白的样液。【关键词】 凝胶过滤层析，血红蛋白, 别离纯化1 前言别离和提纯蛋白质方法多种多样，其中最为重

15、要的两种方法就是电泳和层析， 在这些方法中主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其他分子的生物学亲和力1 。凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小别离物质的层析方法，又称分子排阻层析、 分子筛层析等 , 它是利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质( 凝胶) 为填料 , 通过洗脱液的连续洗脱 , 使混合物中的各种物质按其分子体积大小和形状的差异而得到别离, 已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、别离提纯及分子量测定等方面2。凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、别离迅速和不影响样品生物活性等优点 , 但凝胶过滤层析对蛋白混合物的最正确别离效果受许多因

16、素的影响。通过本实验的学习， 了解凝胶柱层析的原理及应用， 掌握凝胶柱层析的基本操作技术，为进一步掌握离子交换柱层析、 亲和层析及吸附层析等其它别离方法打下良好基础。2 材料与方法实验材料新鲜鸡血药品Na2HPO42H2O 分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂；NaH2PO42H2O 分析纯，天津市福晨化学试剂厂；蒸馏水；乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na2分析纯，国药集团化学试剂；硫酸亚铁 FeSO47H2O 分析纯，江苏徐州试剂二厂；Sephadex G 25；固体铁氰化钾 K3FeCN 6；柠檬酸钠分析纯，中国上海试剂一厂配置试剂精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结

17、- - - - - - -第 8 页，共 16 页8 磷酸缓冲液 pH7.0：称取 Na2HPO42H2O2.172g，NaH2PO42H2O1.076g ，溶于蒸馏水中，定容至 1000mL 。Na2HPO4EDTA Na2溶液：Na22HPO42H2O ，加蒸馏水溶解并定容至100mL 。40m mol/L FeSO4溶液：称取 FeSO47H2O1.11g 溶于 100mL水中现配现用。 凝血：添加抗凝剂 150g2的新鲜鸡血仪器BP221S型电子天平层析柱 1cm 20cm 玻璃棒烧杯 50ml,100ml,500ml 容量瓶 100ml,1000ml，2000ml胶头滴管洗耳球移液管

18、 1mL ，5mL ，10ml凝胶溶胀3取 10g Sephadex G 25，加 200mL蒸馏水充分溶胀。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的pH 7.0 磷酸缓冲液，在真空干燥器中减压除气过夜，准备装柱。装柱将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。装柱后形成的凝胶床长约20cm ，使胶床外表保持 2-3cm 液层。平衡继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速，平衡20-30 分钟。样品制备1取 1mL鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5mL pH7

19、.0 的磷酸缓冲液，再加入 27.5mg K3Fe(CN)6固体，用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。2吸取 lmL FeSO4溶液和 lmL EDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。上样旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶即缓冲液液面与胶床平面相切 时，立即加入 0.4mL 上述混合液， 待其进入胶床外表仅留约lmm液层时，加入 0.5mL缓冲液，再当胶床外表仅留约lmm液层时，吸取 0.5mL血红蛋白样品溶液， 小心地注入层析柱胶床面中央。慢慢打开螺旋夹， 待大部分精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - -

20、- -第 9 页，共 16 页9 样品进入胶床、床面上仅有lmm 液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心加入35cm 高的洗脱缓冲液。洗脱继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6 滴。等有红色液体滴出时开始收集液体，直至滴出液体颜色变浅。凝胶的回收。实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用。3 结果与分析凝胶经溶胀、装柱、沉降后形成胶床，用磷酸缓冲液平衡后，沿层析柱内壁加入 FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其进入胶后往胶床面中央加入鸡血血红蛋白，等其进入胶床后加入磷酸缓冲液。血红蛋白在胶床中缓慢层析，分为

21、三层：上层呈现黄色，是铁氰化钾；中层呈现暗红色，是鸡血中的小分子物质及少量血红蛋白；最下层呈现鲜红色。收集层析柱中的红色的液体部分即为血红蛋白。本次实验收集的血红蛋白的量大约2mL 。本次实验中，层析的样品在胶床内分三层，符合理论；在实验过程中，样品洗脱速度较为合适， 流速基本控制在每分钟6 滴，洗脱获得的血红蛋白较其他实验组颜色略浅，总体而言，本实验是比较成功的，但在一些方面仍需要改进：成功之处： 层析速度控制准确，样品的条带清晰，分层清楚； 层析过程中操作标准，加样准确，层析结果较好。不足之处： 配制 FeSO4溶液时，由于操作不及时，导致FeSO4被氧化，进而重新配制；精选学习资料 -

22、- - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 16 页10 有血红蛋白层析出时未能及时收集，导致部分血红蛋白损失。 层析后的柱子污染较为严重，抗凝血在层析前能离心处理下最好。 实验后，没有保持柱子处于缓冲体系中，出现柱子变干的情况。4 讨论凝胶层析主要根据被测样品分子量的差异, 在固定相上受到阻滞程度不同而到达别离的目的。 分子量大的物质随流动相移动速度较快, 先流出层析床。 反之,分子量小的物质移动速度较慢, 后流出4。凝胶过滤层析的操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，葡聚糖凝胶的吸附力弱， 不需要有机溶剂， 并且对别离成分理化性质的保持

23、有独到之处。对于高分子物质有很好的别离效果，也可用于去除高分子物质如核酸、蛋白质、多糖等中的一些小分子杂质。测定已知分子量的物质通过凝胶过滤层析洗脱体积，再测定未知分子量的大分子物质体积，从而测定高分子物质的分子量。鉴于凝胶层析法的高别离率、高灵敏度及操作简单 , 保持样品的生物活性等优点, 这种方法已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、别离提纯及分子量测定。5 参考文献1史 伟，禹 婷.蛋白质的层析别离内蒙古农业科技 ,2011 1：110-1122 方福德 , 周吕, 丁濂, 等. 现代医学实验技巧全书 M. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 ,1995 3 王 璞 ,

24、林 红 ,Sephadex的 溶 胀 与 回 收 保 存 . 中 国 科 技 论 文 统 计 源 期刊,2006,23(2):24-25 4 杨歌德 , 姜玉梅, 周宏博 . 凝胶过滤层析别离蛋白质实验中三种过滤介质别离效果的比较 . 哈尔滨医科大学学报 ,2002,36(3):242-243 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 16 页11 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子量的测定班级：生技 121 ：牛军学号： 20121211111 【摘要】本实验利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定凝胶过滤别离的鸡血血红蛋白的分子量

25、。通过电泳后的条带计算样品迁移率，比照标准标准蛋白曲线，估算血红蛋白分子量。【关键词】 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，血红蛋白，分子量1 前言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法。 它的基本原理是 SDS与蛋白质分子结合 ,形成复合物。而且各种蛋白 -SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量有关系。用这种方法测定蛋白质的分子量 ,操作简便 ,快速,所需设备廉价 ,所得结果在分子量为15kD-200kD 的范围内,与用其他方法测得的分子量相比,误差一般在正负 10%以内1:聚丙烯酰胺凝胶是网状结构 ,具有分子筛效应 ,可以根据蛋白质分子大小的不同而别离

26、蛋白质。电泳时 ,分子量小的蛋白质跑得快在下面,而分子量大的蛋白质跑得慢在上面SDS-PAGE 在蛋白质研究领域有着重要作用。2 材料与方法鸡血血红蛋白试剂SDS 十二烷基硫酸钠化学纯，国药集团化学试剂丙烯酰胺 Acr化学纯，北京拜尔迪生物技术N,N甲叉双丙烯酰胺 Bis 化学纯，北京拜尔迪生物技术Tris 化学纯，北京拜尔迪生物技术甘氨酸 Gly分析纯，国药集团化学试剂NaH2PO4分析纯，天津市福晨化学试剂厂Na2HPO4分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂考马斯亮蓝 R 250分析纯，国药集团化学试剂50% 甲醇分析纯，国药集团化学试剂冰乙酸分析纯，国药集团化学试剂蒸馏水过硫酸铵化学纯，国药

27、集团化学试剂HCl分析纯，南京化学试剂巯基乙醇化学纯，国药集团化学试剂甘油分析纯，宜兴市钮家化学试剂厂溴酚蓝分析纯，上海化学试剂总厂精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 16 页12 四甲基乙二胺 TEMED化学纯，国药集团化学试剂配置试剂10%过硫酸铵：称取1.002g过硫酸铵固体粉用蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。 凝胶注液：称取Acr 29g，Bis 1g于烧杯中，然后加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。 样品溶解液：SDS ，巯基乙醇 0.4mL，甘油4

28、mL，溴酚兰， pH7.2磷酸缓冲液 2mL。加蒸馏水溶解，转移至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。4X浓缩胶 buffer：称取Tris 6.0153g,用HCl 调pH到6.8，然后加入 SDS0.4070加水至 100mL。4X别离胶 buffer：称取Tris 36.3598g,用80mL蒸馏水溶解， 再用浓 HCl调pH到8.8，然后加入SDS0.808g ，60水浴溶解，加蒸馏水至200mL。电泳 buffer：称取Tris 12.1875g， Gly 57.748g和柠檬酸 4.0149g,放入到 500mL大烧杯中，加蒸馏水 60水浴溶解，转移至 2

29、000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒。0.2mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氢钠溶液， 加入720mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后在 pH计上调至 pH7.2。染色液：称取0.25g考马斯亮蓝 R-250，454mL50%甲醇， 46mL冰乙酸于烧杯中，转移至 500mL容量瓶中。 脱色液：75mL冰乙酸， 875mL蒸馏水与 50mL 甲醇混合。仪器DYC2-24D型垂直板型电泳槽；DYY-2C型直流稳压电泳仪；移液管 1mL 、5mL 、10mL ；烧杯 25mL 、50mL、100mL；微量进样器50 L；细长滴管

30、；培养皿直径120mm ；手术刀片；电吹风 ；电炉。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 16 页13 安装垂直板电泳槽、凝胶制备先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽， 两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由 1 个 U形硅胶框、 长与短的玻璃板及样品槽模板 梳子所组成。先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。通过 U形胶带将两块玻璃板封好，由此便形成一个“夹心”凝胶腔，再将封好的玻璃板插入电泳槽。注意操作过程中勿用手接触灌胶的玻璃面。为了检验装好的电泳槽是否漏胶，可以先加少量水检验

31、封好的玻璃板是否会漏胶，确定不漏后将水倒出，并用吸水纸吸干凝胶腔中的水分。按照表 1 所示制备凝胶表 1 凝胶制备方法15% 别离胶4% 浓缩胶水 mL 凝胶贮液 mL 1 4别离胶Buffer mL 4浓缩胶Buffer mL TEMED L25 50 10% 过硫酸铵L50 50 总体积各为5mL ，根据需要可调整用吸管吸取别离胶，沿壁缓缓注入已准备好的胶室中，胶液加到离胶室顶部1.5 厘米处。注胶后应立即覆盖3-5 毫米的水层，垂直静止聚合30 分钟左右。聚合后将覆盖的水层倒出，并吸干。加样一般每个凹形样品槽内，只加一个种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，将样品与已知分子量的标准蛋白加在

32、同一块凝胶上，加样体积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，本实验加样体积为20L。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器， 注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶外表形成样品层。电泳加样后，将电极缓冲液分别倒入上下电泳槽，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，先将电流调至 25mA ，10min候，将电流调至 75mA ，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1 处停止电泳，关闭电源，一般电泳过程需5-6h。染色3与脱色精选学习资料 - - - -

33、 - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 16 页14 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用解剖刀撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志， 将凝胶从玻璃板上取下， 放入大的培养皿中染色3060min，用蒸馏水漂洗数次，然后放入脱色液中脱色。勤换脱色液，12 小时后可清晰地识别出蛋白质区带，48 小时后可脱至背景无色。假设蛋白质区带清晰，可将电泳图谱照相保存。通常以相对迁移率Mr来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算：）染料迁移距离（）样品迁移距离（相对迁移率cmcmMr以标准蛋白质 Mr

34、的对数对相对迁移以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。3 结果与分析点样时， 从右往左的顺序依次：， 前三组为本组实验条带；，为温奇秦组为Marker 。很明显， marker 带没有跑出，各组的蛋白条带也没有跑出. 样品迁移率没法计算，所以蛋白的分子量无法计算。本组制备的血红蛋白样液没有跑出条带，标准蛋白marker 及其他组血红蛋白样液均没有跑出条带，说明蛋白样液的制备没有问题。纵观整个实验流程，本次实验没有成功的原因可能有以下几点： Temed 药品作用效果不明显，加大剂量后对蛋白电泳产生了影响 由于 Temed在低 pH

35、值时失效，会使聚合作用延迟，所以可能是别离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液的pH偏低精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 16 页15 由于浓缩胶凝固太慢，煮好的标准蛋白marker 没有即时使用，过夜后再次进行沸水煮，很大可能使标准蛋白失效，依此推断，样品蛋白也失效。 凝胶中存在SDS,SDS 的存在干扰了考马斯亮蓝与蛋白质的结合，虽然甲醇可以破坏SDS ， 但可能是样品溶解液中SDS过多导致染色失败。4 讨论聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验最常用的支持介质 2，通过使用强阴离子 SDS 建立的 SDS-PAGE 技术已成为蛋白质别

36、离、分析的常用方法 3 4在用 SDS凝胶电泳测定蛋白质分子量时应注意：要保证蛋白质-SDS复合物到达1.4gSDS/g蛋白质的比率并具有相同构像；要根据所测蛋白质分子量的范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择蛋白质分子量范围与性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质；在凝胶电泳中，影响迁移率的隐私较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线；不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。因此，这一方法需要我们不断探索创

37、新，从而对其改进5，以发挥其优越性，防止其不良方面。5 参考文献1 张龙翔 , 张庭芳 , 李令媛 . 生化实验方法和技术北京 : 高等教育出版社,1987.86. 2郭晓君蛋白质电泳实验技术M 北京 : 科学出版社，19993 范培昌生物大分子印渍术和应用M 上海 : 上海科学技术文献出版社， 1989:106 1074 陈亚飞，孙宇SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛇毒抗瘤蛋白的相对分子质量 J中国生化药物，2004，25(5):300 3035 叶长春 . SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进湖北工业大学学报,2009,24(4):16-18 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 16 页