生物化学实验.pdf

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1、生物化学实验.1/45 生物化学实验讲义化学工程与技术学院基础部生物化学实验.2/45 实验一酪蛋白的制备一、目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。二、原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。三、器材1、离心机2、抽滤装置3、精密 pH 试纸或酸度计4、电炉5、烧杯6、温度计四、试剂与材料1、牛奶2500mL 2、95乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL 生物化学实验.3/45 4、0.2mol

2、L pH 4.7 醋 酸 醋 酸 钠 缓 冲 液3000mL 5、乙醇乙醚混合液2000mL 五、操作1、将 100mL 牛奶加热至 40。在搅拌下慢慢加入预热至 40、pH 4.7 的醋酸缓冲液 100 mL。用精密pH 试纸或酸度计调 pH 至 4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟(3 000rmin)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、用水洗沉淀 3 次，离心 10 分钟(3000rmin)，弃去上清液。3、在沉淀中加入 30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀 2 次。最后用乙醚洗沉淀2 次，抽干。4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋

3、白纯晶。5、准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白 g100mL 牛乳(g)生物化学实验.4/45 得率：%100理论含量测得含量思考题1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验二小麦萌发前后淀粉酶活力的比较一、目的1.学习分光光度计的原理和使用方法。2.学习测定淀粉酶活力的方法。3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。二、原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。2（C6H10O5）n+nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的 3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。生物化学实验.5/45 OHCOOHNO2O2N

4、OHCOOHO2NNH23,5 二硝基水杨酸还原反应（棕色）休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。三、器材1.25mL刻度试管 2.吸管3.离心管 4.乳钵5.分光光度计 6.恒温水浴7.离心机四、试剂和材料1、小麦种子2、o.1 标准麦芽糖溶液精确称量 100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。3.pH6.9，0.02mol/L 磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钾 67.5mL与 0.2mol/L 磷酸氢二钾 82.5 混合，稀释 10 倍。生物化学实验.6/45 4

5、、1淀粉溶液1g 可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L 磷酸缓冲液中，其中含有 0.0067mol/L 氯化钠。5、13，5二硝基水杨酸试剂将 1.00g3，5二硝基水扬酸溶于20ml 2M L1NaOH溶液和 50ml 水中，加入 30g 酒石酸钾钠定容至100ml。6、1氯化钠溶液五、实验操作1、种子发芽小麦种子浸泡2.5 小时后，放入25恒温箱内或在、室温下发芽。2、酶液提取取发芽第 3 或第 4 天的幼苗 15 株，放入乳钵内，加入 1%氯化钠溶液 10mL，用力磨碎。在室温下 放 置 20 分 钟，搅 拌 几 次。然 后 将提 取 液 离心（1500r/min）67 分钟。将上

6、清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3 或第 4 天的幼苗稀释 10 倍。取干燥种子 15 粒作对照（提取步骤同上）。3、酶活力测定生物化学实验.7/45（1）取 25mL 刻度试管 4 支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25预热 10 分钟）试管标号试剂1 2 3 4 干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4天的幼苗的酶提取液标准管空白管酶液（mL）0.5 0.5 标 准 麦 芽糖溶液（mL）0.5 1淀粉溶液（mL）1 1 1 1 水（mL）0.5 将各管混匀，放在25水浴中，保温 3 分钟后，立即向各管加入 13，5二硝基水杨酸溶液2mL。（2）取

7、出各试管，放入沸水浴加热5 分钟。冷却至室温，加水稀释至 25mL。并混匀。在 A500nm处测定各管的吸光度。填入表中生物化学实验.8/45 试管号干燥种子的酶提取液发芽第 3 或第 4 天的幼苗的酶提取液标准管空白管A500nm吸光度4、计算根 据 溶 液 的 浓 度 与 光 吸 收 值 成 正 比 的 关 系，标准标准酶酶ACAC本实验规定：25时 3min 内水解淀粉释放 1mg 麦芽糖所需的酶量为1 个酶活力单位（u）。酶活力计算公式为：酶酶酶酶活力nVC式中：C酶酶液麦芽糖的浓度，V酶提取酶液的总体积，n酶酶液稀释倍数。思考题1、为什么此酶提纯整个过程在05 条件下进行？生物化学实

8、验.9/45 而测酶的活力时要在25 预保温？反应后又放入沸水浴中？2、实验结果说明什么？实验三纸层析法分离鉴定氨基酸一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：abRf原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距溶剂前沿层析点原点ab生物化学实验.10/45 在一定的条件下某种物质的只Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材1.层析缸2.毛细管3.喷雾

9、器4.培养皿5.层析滤纸(新华一号)四、试剂1、扩展剂650mL 4 份水饱和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。将 20mL正丁醇和 5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约 5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。2、氨基酸溶液0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5)。各 5mL 3、显色剂50100mL 生物化学实验.11/45 0.1水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2.取层析滤纸(长 22cm、宽 14 cm)一张。在

10、纸的端距边缘23cm 处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm 作一记号如图。3.点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6 个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过 3 mm。4.扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升1520 cm 时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5.显色用喷雾器均匀喷上O.1 茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤 5分钟(100)或用热风吹干即可显出各层析斑点。1 2 3 4 5 6生

11、物化学实验.12/45 6.计算各种氨基酸的只Rf值。思考题1、何谓纸层析法?2、何谓片 Rf值?影响 Rf值的主要因素是什么?3、怎样制备扩展剂?3、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四酶的特性一、目的加深对酶的性质的认识。二、内容本实验由温度对酶活力的影响；pH 对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专性4 组实验组成。(一)温度对酶活力的影响1、原理酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40，生物化学实验.13/45 植物酶的最适温度为5060。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性井无明显改变，但在

12、100的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2、器材(1)试管及试管架(2)恒温水浴(3)冰浴(4)沸水浴3、试剂和材料(1)0.2淀粉的 0.3氯化钠溶液150mL 需新鲜配制(2)稀释 200 倍的唾液50mL 用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200 倍(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用。(3)碘化钾碘溶液50mL 将碘化钾 20g 及碘 l0g 溶于 100mL 水中。使用前稀释 10 倍。4、操作生物化学实验.14/45 淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或

13、红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取 3 支试管，编号后按下表加入试剂：管号1 2 3 淀粉溶液(mL)1.5 1.5 1.5 稀释唾液(mL)1 1 煮拂过的稀释唾液(mL)1 摇匀后，将 1、3 号两试管放入 37恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10 分钟后取出(将 2 号管内液体分为两半)，用碘化钾碘溶液来检验1、2、3 号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2 号管剩下的一半溶液放人37水浴中继续保温10 分钟后，再用碘液实验，结果如何?(二)pH 对酶活性的影响生物化学实验.1

14、5/45 1、原理酶的恬力受环境 pH 的影响极为显著。不同酶的最适 pH值不同。本实验观察pH 对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适 pH 约为 6.8。2器材(1)试管及试管架(2)吸管(3)滴管(4)50mL 锥形瓶5)恒温水浴 3、试剂和材料(1)新配制的溶于0.3氯化钠的0.5淀粉溶液250 mL(2)稀释 200 倍的新鲜唾液100mL(3)0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液600mL(4)0.1 mol/L 柠檬酸溶液400Ml(5)碘化钾碘溶液50mL(6)pH 试纸pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8 四种4、操作取 4 个标有号码的 50mL 锥形瓶。用吸管按下

15、表添加0.2molL 磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L 柠檬酸溶液以制备 pH5.08.0的 4 种缓冲液。生物化学实验.16/45 锥形瓶号码0.2molL 磷酸氢二钠0.1 mol/L 柠檬酸pH 1 5.15 4.85 5.0 2 6.05 3.95 5.8 3 7.72 2.28 6.8 4 9.72 0.28 8.0 从 4 个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入 4 支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5淀粉溶液 2 mL 和稀释 200 倍的唾液 2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1 分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于 37恒温水浴中保温。待向第 4 管加入唾

16、液 2 分钟后，每隔 1 分钟由第 3 管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1 小滴碘化钾碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加12 滴碘化钾碘溶液。添加碘化钾碘溶液的时间间隔，从第 1 管起，亦均为 1 分钟。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH 对唾液淀粉酶活性的影响。生物化学实验.17/45 三)唾液淀粒酶的活化和抑制1、原理酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。2、器材(1)恒温水浴(2)试管及试管架3、试剂和材料(1)0.1淀粉溶液150mL(2)稀释 200倍的新鲜唾液150mL(3)1氯化钠溶液50mL(4)1硫

17、酸铜溶液50mL(5)1硫酸钠溶液50mL(6)碘化钾碘溶液100mL 4、操作管号1 2 3 4 0.1淀粉溶液(mL)1.5 1.5 1.5 1.5 生物化学实验.18/45 稀释唾液(mL)0.5 0.5 0.5 0.5 l硫酸铜溶液(mL)0.5 1氯化钠溶掖(mL)0.5 1硫酸钠溶液(mL)0.5 蒸馏水(mL)0.5 37恒温水浴、保温10 分钟碘化钾碘溶液(滴)23 23 23 23 现象解释结果；说明本实验第3 管的意义。（四）酶的专一姓1.原理酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有

18、还生物化学实验.19/45 原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用 Benedict 试剂检查糖的还原性。2、器材(1)恒温水浴(2)沸水浴(3)试管及试管架3、试剂和材料(1)2蔗糖溶液150mL(2)溶于 0.3氯化钠的1%淀粉溶液150mL需新鲜配制间隔各为1 分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于 37恒温水浴中保温。(3)稀释 200 倍的新鲜唾液100mL(4)蔗糖酶溶液100mL 将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤23 次(离心法)，然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100 g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取

19、约1 小生物化学实验.20/45 时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10 倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。(5)Benedict 氏试剂200 mL 无水硫酸铜 17.4 g溶于 100 mL 热水中，冷却后稀释至 150mL。取柠檬酸钠 173g，无水碳酸钠 100g和 600 mL水共热，溶解后冷却并加水至850 mL。再将冷却的 150 mL 硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。4、操作（1）淀粉酶的专一性管号1 2 3 4 5 6 1淀粉溶液(滴)4 4 4 2%蔗糖溶液(滴)4 4 4 稀释唾液(mL)1 1 煮沸过的稀释唾液(mL)1 1 蒸馏水(mL)1 1 37恒温水浴 15

20、 分钟Benedict 试剂1 1 1 1 1 1 生物化学实验.21/45(mL)沸水浴 23 分钟现象解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶)。（2）蔗糖酶的专一性管号1 2 3 4 5 6 1淀粉溶液(滴)4 4 4 2%蔗糖溶液(滴)4 4 4 蔗糖酶溶液(mL)1 1 煮沸过的蔗糖酶溶液(mL)1 1 蒸馏水(mL)1 1 37恒温水浴 15 分钟Benedict 试剂(mL)1 1 1 1 1 1 沸水浴 23 分钟现象解释实验结果。生物化学实验.22/45 思考题1、什么是酶的最适温度及其应用意义?2、什么是酶反应的最适pH?对酶活性有什么影响?3、什么是酶的活化

21、剂?4、什么是酶的抑制剂?与变性剂有何区别?5、本实验结果如何证明酶的专一性?实验五菜花中核酸的分离和鉴定一、目的初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和 RNA、DNA的定性检定。二、原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10氯化钠溶液)和0.5 molL 高氯酸(70)分别提取 DNA 和 RNA，再进行定性检定。生物化学实验.23/45 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核

22、酸。1、核糖的测定测定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5二羟甲苯法)。当含有核糖的 RNA 与浓盐酸及 3，5二羟甲苯在沸水浴中加热1020 分钟后，有绿色物产生，这是因为 RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与 3，5二羟甲苯作用产生绿色物质。DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。2脱氧核糖的测定测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA 在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热 10 分钟后，产生蓝色。这是因为DNA生物化学实验.24/45 嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成羟基6酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。100DNA+二苯胺试剂蓝色物此法易受多种糖类及其衍

23、生物和蛋白质的干扰。上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别 DNA 与 RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。三、器材1恒温水浴2电炉3，离心机4布氏漏斗装置5吸管6烧杯7量筒8剪刀四、试剂和材料1、新鲜菜花2、95已醇600 mL 3、丙酮400 mL 4、5高氯酸溶液200 mL 5、0.5mo1/L 高氯酸溶液200 mL 6、10氯化钠溶液400 mL 7、标准 RNA 溶液(5 mgl00mL)50mL 生物化学实验.25/45 8、标准 DNA 溶液(15 mg100mL)50mL 9粗氯化钠250g 10海砂5 g 11二苯胺试剂60 mL 将 1 g 二苯胺溶于 1

24、00mL 冰醋酸中，再加入2.75mL浓硫酸(置冰箱中可保存 6个月。使用前，在室温下摇匀)。12三氯化铁浓盐酸溶液25 mL 13苔黑酚乙醇溶液200 mL 1、核酸的分离(1)取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95%乙醇和 400 mg 海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。(2)滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。(3)再向滤渣中加入 20mL 丙酮，搅拌 5 分钟后抽干(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。(4)在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。(5)将滤渣悬浮于 20 mL 95 乙醇中，抽滤，弃去滤生物

25、化学实验.26/45 液。(6)滤渣中加人 20 mL 丙酮，搅拌 5 分钟，抽滤至于，用力压滤渣尽量除去丙酮。(7)将干燥的滤渣重新悬浮在40 mL 10氯化钠溶液中。在沸水浴中加热 15 分钟。放置，冷却，抽滤，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。(8)将滤渣重新悬浮在20mL 0.5 molL 高氯酸溶液中。加热到 70、保温 20 分钟(恒温水浴)后抽滤，留滤液(提取物二)。2RNA，DNA 的定性检定(1)二苯胺反应管号1 2 3 4 5 蒸馏水(mL)1-DNA 溶液(mL)-1-RNA 溶液(mL)-1-提取物一(mL)-1-摄取物二(mL)-1 生物化学

26、实验.27/45 二苯胺试剂（mL）2 2 2 2 2 放沸水浴中 10 分钟后的现象（2）苔黑酚反应管号1 2 3 4 5 蒸馏水(mL)1-DNA 溶液(mL)-1-RNA 溶液(mL)-1-提取物一(mL)-1-摄取物二(mL)-1 三氯化铁浓盐酸溶液(mL)2 2 2 2 2 苔黑酚乙醇溶液(mL)0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 放沸水浴中 10 分钟后的现象生物化学实验.28/45 思考题1核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?本实验是怎样除掉的?2实验中呈色反应时RNA 为什么能产生绿色复合物?DNA 产生蓝色物质?实验六紫外分光光度法测定核酸的含量一、目的1.了解紫

27、外分光光度计的基本原理和使用方法。2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理生物化学实验.29/45 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA 和 DNA 的紫外吸收高峰在A260nm波长处。一般在 A260nm波长下，每 mL 含 1gDNA 溶液的光吸收值约为 0.020，每 mL 含 1gRNA 溶液的光吸收值约为 0.022。故测定未知浓度RNA 或 DNA 溶液 A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预先除去。三、器材1.分析天平

28、2.离心机3.容量瓶4.紫外分光光度计5.吸管6.冰浴或冰箱四、试剂1、5%6%氨水2、钼酸铵高氯酸试剂(沉淀剂)如配制200mL可在 193mL 蒸馏水中加入 7mL 70%高氯酸和 0.5g钼酸铵。生物化学实验.30/45 五、操作1.用分析天平准确称取待测的核酸样品500 mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%6%氨水调至 pH7，定容到 50mL。2.取 2 支离心管，向第一支管内加人2mL 样品溶液和 2mL 蒸馏水；向第二支管内加入 2mL 样品溶液和 2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置 30 分钟后离心(3000 rmin，10

29、分钟)。从第一管和第二管中分别吸取0.5mL 上清液，用蒸馏水定容到 50mL。用光程为 1cm 的石英比色杯，于260mn 波长处测其光吸收值(A1和 A2)。六、计算为光吸收值）（）样品浓度（AmLgmLgAARNADNA100/)/()022.0.(02.0)%(21生物化学实验.31/45 mLgmLgmLmg/5010105.05.050245050046样品浓度如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(2050 g/mL)在紫外分光光度计上直接测定。实验七总氮量的测定凯氏定氮法一、目的学习凯氏定氮法的原理和操作技术。二、原理常用凯

30、氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸）的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，此反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催生物化学实验.32/45 化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程表示如下：弄 浓浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸留到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据使用的标准酸的摩尔数计算出待测物中的

31、总氮量。三、仪器1.50 mL 消化管或 100 mL 凯氏烧瓶2.改进型凯氏定氮仪350 mL 容量瓶43 mL 微量滴定管5 分析天平6 烘箱7 电炉8 1000mL蒸馏烧瓶9.小玻璃珠10远红外消煮炉CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2+NH32NH3+H2SO4（NH4）2SO4生物化学实验.33/45 四、试剂1.消化液(过氧化氢：浓硫酸：水二3：2：1)200mL 2粉末硫酸钾硫酸铜混合物16g K2S04 与 CuS045H20 以 3：1 配比研磨混合。330氢氧化钠溶液1 000mL 42硼酸溶液500mL 5标准盐酸溶液(约 001 molL)600mL

32、6混合指示剂(田氏指示剂)50mL 由 50mL 01甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7市售标准面粉和富强粉.各 2g 五、操作方法改进型凯氏定氮仪改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构生物化学实验.34/45 基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。改进型凯氏蒸馏装置的结构如图所示。图改 进 型凯氏蒸馏装置1.水蒸汽发生器2.反应室3水蒸汽排气孔4排水排气孔5.外源水入口6进样口7加样漏斗8冷凝器9冷凝器出口10.自来水入口11通

33、气室出口13.通气室出口14排水柱15排水柱入口16排水柱入口17.冷凝水和废水出生物化学实验.35/45 口 自由夹可分成 3 部分来叙述：(1)水蒸汽发生器和反应室水蒸汽发生器有 3个开口，3、4、5，反应室有 1 个开口，6。2)冷凝器和通气室冷凝器有 2 个开口，9、10，通气室有有 2 个开口，12、13(3)排水柱排水柱有 3 个开口，15、16、17。安装时，先将主体部分固定在支架上，其底部放上电炉。然后将 5 与 13；4 与 16；12 与 15；6 与 7 用橡皮管连接，并放上自由夹。最后长橡胶管连接进水口10 和出水口 17 2样品处理某一固体样品中的含氮量是用l00g

34、该物质(干重)中所含氮的 g 数来表示(%)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105，因为非游离的水都不能在100以下烘干。在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105生物化学实验.36/45 的烘箱内干燥 4 小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1 小时后，称重次，直到两次称量数值不变，即达恒重。精确称取0.1g 左右的干燥面粉作为本实验的样品。3消化取 4 个 100 mL 凯氏烧瓶或 50mL 消化管并标号。各加 1 颗玻璃珠，在 1 及 2 号瓶中各加样品 0.1g，催化剂(K2S04CuS045H20

35、)200 mg，消化液 5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及 4号瓶中各加 0.1 mL 蒸馏水和与 1 及 2 号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出S02白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消生物化学实验.37/45 化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾入50 mL 的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度，

36、混匀备用。4，蒸馏(1)蒸馏器的洗涤接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)用电炉将其加热烧开。然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或者将电炉移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗35 次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，12硼酸溶液和12 滴指示剂的混合液。蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。(2)蒸馏取 50 mL 锥形瓶数个，各加入5 mL 12硼酸溶液和 12 滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。生物

37、化学实验.38/45 将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。用移液管取 5 mL 消化液，细心地由加样室下端加入反应室，随后将已准备好的30NaOH 溶液 5mL 加入，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。关闭自由夹打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约 23 分钟)，开始计时，蒸馏 3 分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约 1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏 1 分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。打开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此35

38、次。最后将自由夹、同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。(3)滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形生物化学实验.39/45 瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。(4)计算%100014.021）测定时消化液用量（）消化液总量（）（总氮量mLmLWVVcc 为标准盐酸溶液摩尔浓度；v1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL 数；v2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；w 为样品重量(g)。14 为氮的相对量子质量。若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中蛋白质含量()

39、=总氮量 x625 若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氟=总氮非蛋白氮生物化学实验.40/45 蛋白质含量(g%)=蛋白氮 6.25 思考题1、何谓消化?如何判断消化终点?2、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么?3固体样品为什么要烘干?4蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中?5如何证明蒸馏器洗涤干净?6本实验应如何避免误差?实验八血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理二、原理

40、醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。生物化学实验.41/45 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120 m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。三、器材1醋酸纤维薄膜(28 cm)2常压电泳仪3点样器(市售或自制)4培养皿(染色及漂洗用)5粗滤纸6，玻璃板7竹镊8白磁反应板四、试剂1 巴 比 妥 缓 冲 液(pH8.6，离 子强 度0.07)1000 mL：巴比妥 2.76

41、g，巴比妥钠 15.45 g，加水1 000 mL。2染色液300 mL 生物化学实验.42/45 含氨基黑 10B 0.25 g，甲醇 50 mL，冰醋酸 10 mL，水 40 mL(可重复使用)。3漂洗液2 000 mL 含甲醇或乙醇 45 mL、冰醋酸 5 mL、水 50 mL。4，透明液300 mL 含无水乙醇 7 份，冰醋酸 3 份。五、操作 浸泡用镊子取醋酸纤维薄膜1 张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。2点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下

42、，再在膜条一端23cm 处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。生物化学实验.43/45 3电泳在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160 V，电流强度 0.40.7mAcm(毫安厘米)膜宽，电泳时间约为25 分钟。酸纤维裹薄膜电泳装置示意

43、生物化学实验.44/45 图4染色电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡 10 分钟。5漂洗将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。醋酸纤维薄膜血清蛋白电泳图谱从左至右，依次为：血清清蛋白1，球蛋白，2球蛋白，球蛋白，球蛋白定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段生物化学实验.45/45 剪开，分别浸在体积0.4 mol/L 氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放人透明液中浸泡23 分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。思考题1用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点?2电泳图谱清晰的关键是什么?如何正确操作?