开题报告马丽娟.docx

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1、争论生学位论文开题报告学号：20230194姓名：马丽娟导师姓名：黄永清争论方向：.口腔颌面外科MAFB 基因多态性在宁夏人群中与论文题目：非综合征型唇腭裂的相关性争论院系：口腔医学院入学时间：2023 年 9 月 5 日开题时间：2023 年 12 月 18 日二 一二 年 十二 月 十八 日13一、立论依据包括争论意义、国内外争论现状分析，并附主要参考文献及出处1、选题背景唇腭裂是人类最常见的一种诞生缺陷,其发病率在 1/5001/1000 之间, 不同种族和地域发病率有很大差异 1 , 其中美洲印第安人与亚洲人的发病率最高，约 1/500 2 ，高加索人居中，约 1/1000 ，非洲人最

2、低，约 1/2 50 0 ，我国发病率为 1.82/10003 ,在我国诞生缺陷的发生率中占第一位或其次位, 在宁夏 2023 年婴儿诞生缺陷的发生率中占第一位 4 ， 发病率为 2.19/1000。唇腭裂患者不仅存在外形上的缺陷，其饮食、语言等功能也伴有不同程度的障碍，常常造成性格缺陷，影响正常的社会交往，降低生活质量，又因其治疗程序简单、周期漫长、花费大，给家庭和社会带来沉重负担，严峻影响了诞生人口素养，因此查找该病的病因, 进而找到有效的预防手段显得格外重要。依据全身是否伴发其他畸形, 唇腭裂可以分为非综合征型唇裂伴或不伴腭裂( non-syndromic cleft lip with

3、or without cleft palate, NSCL/P)和综合征型唇腭裂。大约有 20%的唇腭裂与已经觉察的 400 多种综合征有关,这些综合征根本符合孟德尔单基因病遗传模式。大量争论说明 NSCL/P 病因是多因素的，可能由某些遗传易感因子和环境危急因子暴露所引起5-7 。Ardinger 等8 报道了第 1 个唇腭裂关联基因 TGF-，至今已有 20 余年。随着人类单倍型图谱的完成，单核苷酸多态性 ( sin2gle nucleotide polymorphism, SNP), 即单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性, 因其数量众多和易检测性,成为的第三代遗传标记。SNPs

4、 被认为是最重要的人类基因组变异形式,人类基因组中至少存在 1 千万个 SNPs，平均每 300 个核苷酸内就有一个 SNP,是造成正常表型个体间差异的主要缘由9 。很多涉及 NSCL/P 遗传学 病因的候选 基因分子流行 病学争论重复 性很差，说明NSCL/P 是一种具有简单遗传异质性病因的疾病。所以，在相对单一遗传学背景的人群中去验证 GWAS 争论结果，对于鉴定该人群特有的 NSCL/P 易感基因格外必要,目前基因的筛选、定位以及争论分析方法仍旧是 NSCL/P 病因学的争论难点和热点。2. 国内外争论现状人类对基因组变异的生疏也在逐步深入。1986 年,人类基因组的第一个完整的限制性片

5、段长度多态 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)图谱绘制完成,这是人类的第一张分子遗传图谱,标志着人类疾病发生气制的遗传学争论进入了一个的阶段。而后, 微卫星位点(short tandem repeat, STR)代替了 RFLP。此时, 基于家系连锁分析的疾病遗传学机制争论占据了统治地位。1996 年, Risch 和 Merikangas 指出, 通过对一般人群进展病例-比照争论,即关联分析,对捕获变异基因具有更高的效力，因而提出了构建人类基因全部变异图谱的全球打算,人类单倍型图谱打算得以启动目前各种遗传连锁和关联争论，包括全基因

6、组关联分析 genomewideassociation study， GWAS报道了越来越多的候选基因和染色体区域，如 IRF6、FOXE1、BCL3、MYH9、SUMO1、MSX1 和染色体 1p22、8q24、10q25、17q22、20q12 等 10-14 。 2023 年 Terri H Beaty 等15 在多个人群包括欧洲，亚洲和中国人群的多中心合作的 1965 个核心家系样本的 GWASIllumina HumanHap550 BeadChip争论也证明白 IRF6 基因和 8q24.21 区段与 NSCL/P 致病有很强相关性。同时还得出了 MAFB 和 ABCA4 两个基因

7、与 NSCL/P 致病有很强相关性。MAFB 基因又称为 KRML 基因，位于 20q12，编码亮氨酸拉链转录因子，此因子不仅在红细胞系的生成调整过程中扮演者重要的作用，还作为引起巨噬细胞活化因子表达骨髓瘤细胞的癌基因16.17 。动物试验同样说明 MAFB 基因可能参与鼠的颅面外胚层发育。Beaty 等18 的原位杂交试验检测到 MAFB 基因的 mRNA 和蛋白质信号在孕 13.5 14.5 d 胚鼠颚板上皮细胞强表达，推想其可能参与了颚板融合过程。假设某些个体存在由 SNP 介导的 MAFB 基因单倍缺乏， 则可能导致颚板融合障碍，进而导致 NSCL/P 发生。GWAS 扫描觉察在 MA

8、FB 整个基因内或其四周的 237 个 SNP 中有 6 个 SNPrs6072081，rs6065259，rs17820943，rs13041247， rs11696257，rs6102085到达了统计学意义 p5*10.8。rs13041247 在 MAFB 基因的下游区，外显子测序觉察了一个错义突变 H131Q,其影响了蛋白构造功能15Yuan 等19 在拉丁美洲人群重复源 GWAS 争论中也证明白另外 2 个与rs17820943 存在强连锁的位点rs11696257 和 rs13041247，与 NSCL/P 存在阳性关联。2023 年 5 月何运辅争论觉察华南汉族人群中 MAFB

9、SNPs rs6072081 、rs1 78 20943 和 rs6102085 以及IRF6 SNP rs10863790 与 NSCL/P 的发病有显著关联。这些争论结果均说明 MAFB 基因是一个牢靠的 NSCL/P 候选基因。我国的人口基数大，唇腭裂患者数量也多，这既是一个有利于争论的条件，也是一个需要解决的问题。随着现在微观领域技术的不断进步， NSCL/P 的基因争论已经取得了肯定的成果，目前的易感基因一个个被证明，并且的易感基因也在不断被觉察，所以在国内外很多机构、学者都致力于这方面的争论，由于唇腭裂病因的简单性、遗传模式的不确定性、不同地区甚至不同表型 NSCL/P 的候选基因

10、座差异性，使争论结果重复性差，消灭较多分歧， 有的甚至消灭背离。这仍是一个亟待解决的问题本 研 究 旨 在 了 解 中 国 宁 夏 地 区 回 汉 族 人 群 中 MAFBrs6072081.rs6065259.rs17820943.rs11696257与 NSCL/P 的相关性，探讨在宁夏地区回汉族人群中 NSCL/P 发病的可能作用，同时也为宁夏地区人群基因数据库积存资料，不断完善和进展其在唇腭裂发病机制，为临床基因诊断供给理论依据，以及为唇腭裂的产前诊断和预防供给科学依据，对有唇腭裂病人的家庭供给有效遗传询问，最终到达降低唇腭裂发生率的目的。参考文献1.Harville ,E.W.,Wi

11、lcox ,A.J.,Lie ,R.T.,etal.,Epidemiology of cleft pa late alone and cleft palate with accompanying defects .Eur JE pidemiol ,2023 .22 (6):p.38 9-952.Cooper,M.E.,Ratay J.S.and Marazita M.L.,Asianral-facialcleftbirthprevalence.Cleft Palate Craniofac J,2023.43(5):p.580-9.3 黄洪章.唇腭裂病因学争论的进展.口腔颌面外科杂志, 2023

12、, 17 (3) : 201 -204.4 Zhou Hou-De LiXiao-Ling Li Gui-Yuan. The reasearch development of Singlenucleotidepolymorphism. Foreign Med Sci Pathophysial Clin Med ，2023，23(5):4444475 Vieira AR. Unraveling human cleft lip and palate research. J Dent Res, 2023, 87(2): 119-125.6 Murray CJ. Gene/environment ca

13、uses of cleft lip and/or palate. Clin Genet, 2023, 61(4): 248-256.7 Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental infl uences. Nat Rev Genet, 2023,12(3): 167-178.可续页8 Ardinger HH, Buetow KH, Bell GI, et al. Association of genetic variation of t

14、he transforming growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet, 1989, 45(3): 348-353.9.Lander ES, Linton LM, Birren B, et al.Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2023, 409(6822): 860 921.10 Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory fac

15、tor6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate. NEngl J Med, 2023, 351(8): 769-780.11 Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat Genet, 2023, 41(4): 473-477.12 Mangold E, Lu

16、dwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association studyidentifi es two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet, 2023, 42(1): 24-26.13 Alkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haploinsuffi ciency leads to cleft lip and palate. Science, 2023, 313(579

17、4): 1751.14 Mangold E, Ludwig KU, Nthen MM. Breakthroughs in the genetics oforofacial clefting. Trends Mol Med, 2023, 17(12): 725-733.15 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. N

18、at Genet. 2023,42(6): 525529.16 Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, Zanocco Marani T, Vignudelli T, SienaM,Zini R, Salati S, Tagliaco E,Manfredini R, Grande A, Ferrari S. Virally mediated MafB transduction induces the monocyte commitment of human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells. Cell Death

19、Differ 2023. 13:16861696.19. Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identi cation of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2023. 37:7886.17 Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identi cation of primaryMAFB targ

20、et genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2023. 37:7886.18 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide associationstudy of cleft lip with and without cleft palate identifi es risk variantsnear MAFB and ABCA4. Nat Genet, 2023, 42(6): 525-529.19 Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of AB

21、CA4 and MAFB withnon-syndromiccleft lip with or without cleft palate. Am J Med GenetA, 2023, 155A(6): 1469-1471.二、争论方案1、争论目标、争论内容和拟解决的关键问题一、争论内容：(1) 标本收集收集 300 个宁夏地区非综合征型唇腭裂(NSCLP)核心家系【包括大家系和 3 人核心家系双亲和患者】以及 300 名匹配的正常比照组。按知情同意的原则，填写知情同意书， 签字。并具体填写唇腭裂遗传流行病学争论问卷及临床检查表。标原来自宁夏医科大学附属医院以及宁夏各地方的协作医院。(2) 进

22、展 SNPs 位点筛选。(3) 对已经确定的候选基因 SNPs 位点进展基因分型，应用病例比照和传递不平衡检验transmitted disquilibrium test,TDT的方法，争论确定的 SNPs 位点等位基因和单倍型与 NSCL/P 的相关性。二、争论目标：通过应用病例比照争论和传递不平衡检验TDT，比较候选基因 SNPs 位点等位基因频率的显著性差异，以进一步证明和准确定位与宁夏地区 NSCL/P 有相关性的 SNPs 位点，并计算有意义 SNPs 位点对宁夏地区人群 NSCL/P 发病的奉献率，觉察宁夏地区回汉族人群中这些位点与 NSCL/P 的相关性，同时也为宁夏地区人群基因

23、数据库积存资料， 不断完善和进展其在唇腭裂发病机制，为临床基因诊断供给理论依据。三、拟解决的关键问题：（1） 样本的收集【包括大家系和 3 人核心家系】及问卷表填写的认真和完善是本争论的根本保证。（2） 候选基因有意义 SNPs 位点的筛选以及基因分型方法的选择和结果的牢靠性。（3） TaqMan SNP 基因分型技术的学习及把握。（4） 用于遗传统计学分析的软件及其正确的应用。2、拟实行的争论方法、技术路线、试验方案及可行性分析1标本的采集：按知情同意的原则，填写知情同意书，签字。具体填写唇腭裂遗传流行病学争论问卷及临床检查表。采集外周静脉血 5ml,加 EDTA 抗凝剂，20C 保存备用。

24、临床鉴别综合征型唇腭裂SCL/P和非综合征型唇腭裂NSCL/P病例。并进展常规工程的统计、分析，如：NSCL/P 类型、性别、年龄，民族及母亲怀孕起始三个月吸烟分为主动和被动吸烟、饮酒，维生素补充及使用药物史等流行病学资料。病例组纳入标准 患儿为先天性非综合征型唇腭裂。 患儿不伴有其他系统器官的先天性畸形。 患儿家庭无其他遗传病家族史。 患儿双亲精神正常，能承受调查者。 患儿双亲须是患儿生物学父母。 患儿父母家庭至少三代为宁夏籍贯。比照组纳入标准安康儿童不伴有系统器官的先天性畸形和疾病。安康儿童家庭无遗传病家族史。安康儿童双亲精神正常，能承受调查者。安康儿童双亲须是患儿生物学父母。安康儿童父母

25、家庭至少三代为宁夏籍贯。2样本基因组 DNA 的提取：DNA 试剂盒提取法原理为苯酚抽提法。抽提好的 DNA 样本用紫外吸取法测定 DNA 的纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳技术加以确认，并将样品稀释至 20ng/l， -20C 冰箱储存备用。（3） 应用 Primer 5.0 软件对候选 SNPs 位点的引物、内切酶的设计。（4） 应用 TaqMan SNP 基因分型技术进展基因分型。（5） 选择 10%的分型结果直接测序，验证基因型的正确率。（6） 统计学方法Hard 一 Weinberg Equilibrium (H 一 W 平衡分析)：指在一个随机婚配的群体中，各基因频率和等位基因频率将保持

26、不变。如 p 和 q 分别代表一对等位基因频率，由这两个等位基因构成的基因频率将符合二项分布。候选基因各位点分析前提是基因分型数据必需符合Hardy-Weinber 平衡，不符合的将剔除于后分析CASE-CONTROL Comparison病例比照比较：依据基因型分别计算病例组和比照组间等位基因频率，承受卡方检验。Transmission-Disequilibrium Testing：传递不平衡检验主要针对的是家系样本的分析，可以用来检查家系分型的错误，相当于 UNPHASED 中的 pdtphase 模块。该软件的优点是可以计算特别小数目的家系，可以敏捷设定遗传的模式种类。HaPlotyPe

27、 Association 单倍型分析：单倍型是同一条染色体上严密相连的两个或两个以上多态位点的状态组合。以单倍型为根底的分析可以供给更多的信息量。每个等位基因或者突变与一个特别的历史进化有关，这样将有一个独特的染色体背景或者单倍型。与单个位点分型比较，单倍型分析更有力度。Linkage Disequilibrium calculation,LD(连锁不平衡检验)技术路线图标本的收集基因组 DNA 的抽取目标序列的常规 PCT 扩增直接测序验证分型TaqManSNP 基因分型病例-比照争论 TDTLD 单倍型及归因危急度的分析检验NSCL/P 与 SNPs 的相关性3 本课题的创之处首次将本课题

28、所选的 4 个位点 rs6072081.rs6065259.rs17820943.rs116962571q20，在宁夏地区回汉人群中进展大样本三人核心家系的 NSCL/P 相关争论，国内有关 NSCL/P 的发病与以上四个位点多态性的相关性并未有清楚的争论。4、争论打算及推测进展1第一阶段 2023 年 5 月2023 年 12 月：收集宁夏地区回汉族病例组 NSCL/P 核心家系【包括大家系和 3 人核心家系患者和双亲】以及同期匹配的正常比照组标本；并认真填写唇腭裂遗传流行病学争论问卷及临床检查表。同时尽快成批抽提基因组 DNA，具体登记编号，-20储存备用 。进展 SNPs 位点筛选，在导

29、师帮助下获得最国外相关文献资料，包括网络资源的利用， 最终确定 rs6072081.rs6065259.rs17820943.rs116962571q20多态位点。对已经确定的候选基因 SNPs 位点进展基因分型预试验，以确定基因分型方法的选择和保证分型结果牢靠性的直接测序方法的检验。2其次阶段 2023 年 12 月2023 年 6 月：进展候选基因 SNPs 基因分型。用于遗传统计学分析软件FBAT的进一步确定和娴熟其正确的应用。（3） 第三阶段 2023 年 6 月 2023 年 10 月全面统计分析，查漏补缺，增补试验。统计分析方法的选择： 病例比照的方差分析, H-W 平衡检验, 传

30、递不平衡检验，单倍型分析，连锁不平衡检验。（4） 第四阶段 2023 年 10 月 2023 年 2 月，论文撰写及修改发表。三、争论根底1、与本课题有关的，前期争论工作积存和已取得的争论工作成绩1 前期导师和师兄进展的基因多态性方面的相关争论，为本试验及后续试验积存了贵重的方法和阅历。（2） 对已收集的标本已经提取出 DNA 并测定 OD 值，稀释至一样浓度至 20ng/l 后-20C 冰箱储存备用。相关样本信息已经录入北京国家芯片中心宁夏分中心的样品库。（3） 已经初步把握了基因分型技术及测序技术2、已具备的试验条件，尚缺少的试验条件和拟解决的途径1本试验所需的病例组和比照组样本均可在安排

31、的时间内完成，所需试剂均已订购到位。2北京国家芯片中心宁夏分中心试验室具备本争论所需的主要试验仪器荧光定量 PCR 仪GeneAmp 7000，美国 PE 公司电泳仪 Model 250/ 2.5美国 Bio-Rad 公司ABI3730 遗传美国 ABI 公司低温冰箱日本 Sanyo 公司Du640 紫外分光光度计Beckman Coulter 公司3、近期已发表与本课题有关的主要论著名目*论文：作者题目刊名年份卷期页码专著：作者书名出版者年份四、经费预算支出科目金额万元计算依据及理由试验室治理费500试验收集标本的储存及保管费用试验材料费45000基因提取试剂盒、引物合成、探针合成等样本收集2023样本收集过程、合作劳务费、问卷调查等论文撰写发表1500论文发表所需评阅费、版面费总计49000注:预算支出科目按以下挨次填写： 1.科研业务费 2.试验材料费 3.仪器设备费 4. 协作费 5. 争论组织实施费