微生物农药细菌精选PPT.ppt

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1、关于微生物农药细菌第1页，讲稿共115张，创作于星期日微生物可分为：1 1、无细胞结构无细胞结构的：的：真病毒、亚病毒；2、具有原原核核细细胞胞结结构构的：真细菌（细菌、放线菌、蓝细菌、立克次氏体、支原体、衣原体）、古细菌；3、具有真真核核细细胞胞结结构构的：真菌（酵母菌、霉菌）、单细胞藻类、原生动物等。第2页，讲稿共115张，创作于星期日微微生生物物农农药药是指应用生物活体（包括细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫或基因修饰的微生物）制成的防治作物病、虫、草、鼠等有害生物的制剂，也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂。微生物农药是目前生物农药的一个最主要的组成部分，其基础研究和产业化研究均走在

2、整个生物农药研究领域的前列。第3页，讲稿共115张，创作于星期日按微生物种类分类：按微生物种类分类：细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌 真菌类：白僵菌、绿僵菌真菌类：白僵菌、绿僵菌 病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒 寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫 微孢子原虫类微孢子原虫类第4页，讲稿共115张，创作于星期日用于制备生物农药的主要微生物类群用于制备生物农药的主要微生物类群 生物类别生物类别致病生活阶段及传播致病生活阶段及传播作用方式作用方式适用环境适用环境形成孢子的细菌杀虫剂晶体毒

3、素，抗性强的孢子胃毒，侵染植物表面，水，土壤原生动物杀虫剂抗性强的孢子中肠侵染植物表面昆虫病毒抗性强的包涵体中肠侵染植物表面枝霉菌素杀虫剂相对弱或抗性强的孢子接触侵染土壤、植物表面，水、昆虫表皮霉菌除草剂相对弱的孢子接触侵染土壤、植物表面细菌除草剂弱的细菌细胞，抵抗力强的孢子接触侵染土壤、植物表面拮抗植物病原菌的真菌、细菌抗性强的或弱的孢子接触侵染或抑制土壤、植物表面细菌真菌共生体细菌，传播能力弱接触侵染土壤嗜虫线虫传染阶段（相关的细菌），传播能力弱寻找寄主后侵染土壤、水第5页，讲稿共115张，创作于星期日 第一节第一节 细菌农药细菌农药电子显微镜下的细菌三型球菌杆菌螺旋菌第6页，讲稿共115

4、张，创作于星期日细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜夹膜夹膜细胞质细胞质DNA鞭毛鞭毛细菌的结构模式图细菌的结构模式图第7页，讲稿共115张，创作于星期日染色法染色法 革兰氏染色革兰氏染色 Gram stain：由丹麦细菌学家革兰：由丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。采用创建的一种鉴别染色法。采用4 4 种试剂分种试剂分4 4 步：步：结晶紫结晶紫 碘液碘液 95%95%乙醇乙醇 复红复红 （初染）（初染）（媒染）（媒染）（脱色）（脱色）（复染）（复染）革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 （菌体为紫色（菌体为紫色 ）（菌体为菌体为红色）红色）第

5、8页，讲稿共115张，创作于星期日革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌第9页，讲稿共115张，创作于星期日有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。第10页，讲稿共115张，创作于星期日细菌农药按用途分细菌杀虫剂细菌杀菌剂细菌杀鼠剂微生态制剂芽孢杆菌类非芽孢杆菌类按是否产芽孢分细菌农药的分类细菌农药的分类细菌杀线虫剂第11页，讲稿共115张，创作于星期日一、细菌性杀虫剂蜡状芽孢杆菌杆状菌假单孢菌链球菌第12页，讲稿共115张，创作于星期日昆虫疾病：昆虫疾病：非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理

6、失非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理失调及先天性不足。调及先天性不足。传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫、立传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫、立次克体。次克体。第13页，讲稿共115张，创作于星期日具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于3个科：个科：芽孢杆菌科芽孢杆菌科（Bacillaceae）、）、肠杆菌科（肠杆菌科（Enterobacillaceae）、）、假单胞菌科（假单胞菌科（Pseudomonodaceae）。）。其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的2个属：个属：芽孢杆菌属芽孢杆菌属

7、（Bacillus）梭状芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属（Clostridium）。）。第14页，讲稿共115张，创作于星期日1、细菌性杀虫剂的特性、细菌性杀虫剂的特性(1)细细菌菌属属于于原原核核生生物物，单单细细胞胞的的有有机机体体，个个体体较较小小，一一般般体体长长都都在在微微米米级级，缺缺乏乏完完整整的的细细胞胞核核，有有的的可可以以运运动动，有有些些种种在在有有氧氧和和无无氧氧的的条条件件下下都都能能生生存存。多多数数以以二二分分裂裂法法进进行行无无性性生生殖殖，有有些些也也可可以以进进行行有有性性生生殖殖。许许多多细细菌菌具具有有质质粒粒可可以以把把基基因因导导入入菌菌体中体中 。第15页

8、，讲稿共115张，创作于星期日(2)大大多多数数的的昆昆虫虫病病原原细细菌菌是是通通过过口口和和消消化化道道感感染染昆昆虫虫的的，只只有有少少数数通通过过卵卵、体体壁壁和和气气管管感感染染。细细菌菌也也可可以以通通过过寄生虫和捕食昆虫携带感染。寄生虫和捕食昆虫携带感染。第16页，讲稿共115张，创作于星期日(3)细菌细菌繁殖速度极快繁殖速度极快，种类繁多种类繁多，广泛分布在自然界中，因此其与昆，广泛分布在自然界中，因此其与昆虫接触的机会很多，容易感染昆虫。虫接触的机会很多，容易感染昆虫。昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如活动缓慢，食欲减活动缓慢

9、，食欲减退，腹泻和呕吐退，腹泻和呕吐等。等。大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起败血病败血病导致导致昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐色和黑色，虫体昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐色和黑色，虫体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带有臭味的黏稠液体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带有臭味的黏稠液体 。第17页，讲稿共115张，创作于星期日(4)(4)在昆虫病原菌中，有寄主范围很窄的在昆虫病原菌中，有寄主范围很窄的专性病原细菌专性病原细菌和寄主范围很宽的和寄主范围很宽的兼性病原细菌兼性病原细菌。专性细菌专性细菌一般

10、在合成培养基上不能生长，一般在合成培养基上不能生长，对特定的昆对特定的昆虫具有很强的致病力虫具有很强的致病力；兼性细菌兼性细菌在培养基上能生长，具有在培养基上能生长，具有易繁殖、易生产易繁殖、易生产等特点，等特点，是微生物农药的主要病原菌是微生物农药的主要病原菌。目前应用较广的目前应用较广的专性病原细菌专性病原细菌有有日本金龟子芽孢杆日本金龟子芽孢杆菌菌和和缓病芽孢杆菌缓病芽孢杆菌，兼性病原细菌兼性病原细菌有有芽孢杆菌属芽孢杆菌属和和沙雷铁沙雷铁杆菌属杆菌属。第18页，讲稿共115张，创作于星期日(5)细细菌菌杀杀虫虫剂剂有有独独特特的的作作用用方方式式和和杀杀虫虫机机理理，通通过过营营养养体

11、体、芽芽孢孢在在体体内内繁繁殖殖并并产产生生生生物物活活性性蛋蛋白白、毒毒素素等等杀杀死目标昆虫。具有死目标昆虫。具有很高的选择性很高的选择性和和很少的交互抗性很少的交互抗性。第19页，讲稿共115张，创作于星期日(6)实际应用的部分细菌农药的实际应用的部分细菌农药的缺点缺点 1)1)杀虫谱比较窄杀虫谱比较窄 2)2)不具内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫不具内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫 3)3)作用速度比较慢作用速度比较慢 4)4)生产工艺比较复杂生产工艺比较复杂 5)5)持持效效期期比比较较短短，受受日日光光照照射射容容易易失失效效等等，从从而而影影响响了该类农药的发展。了该类农

12、药的发展。第20页，讲稿共115张，创作于星期日19011901年，石渡繁胤年，石渡繁胤 (Ishiwata)(Ishiwata)，生病的蚕蛾。生病的蚕蛾。19111911年年，BerlinerBerliner在在德德国国苏苏云云金金地地区区的的面面粉粉厂厂里里的的地地中中海海粉粉螟螟中中分分离离出出Bt Bt，并并于于19151915年年首首次次对其命名。对其命名。2020世世纪纪2020年年代代中中期期，才才首首次次用用BtBt对对鳞鳞翅翅目目幼幼虫虫(欧欧洲洲玉玉米米螟螟)进进行行了了田田间间药药效效试试验验，引引起起了了当当时许多昆虫学家的注意。时许多昆虫学家的注意。19381938年

13、年 法法 Sporeine Sporeine 第一个商品制剂。第一个商品制剂。1953.Hannay 伴孢晶体伴孢晶体 杀虫作用杀虫作用1971.日本农林省解除禁令，植保局成立日本农林省解除禁令，植保局成立Bt研究会研究会 相相继继发发现现了了对对鞘鞘翅翅目目，螨螨类类、同同翅翅目目、膜膜翅翅目目、直直翅翅目目昆昆虫虫，动动植植物物寄寄生生线线虫虫，鞭鞭毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的BtBt菌株。菌株。1、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)第21页，讲稿共115张，创作于星期日中国：中国：

14、1940年代：用苏云金杆菌防治菜粉蝶（中大蒲蛰龙）1950年代：从法国引进苏云金杆菌 1964年，湖北和湖南两省设厂生产 1970年代初，大规模群众性生产 1980年代后：“七五”“九五”“十五”攻关，863，2010年中长期规划年中长期规划:资源调查、生产工艺改进、质量标准化、蛋白基因克隆、转BT基因植物。第22页，讲稿共115张，创作于星期日(1)Bt形态特征及生理生化形态特征及生理生化1)形态特征：形态特征：3个阶段个阶段 营养体营养体：杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。芽芽孢孢囊囊：菌菌体体老老熟熟时时，一一端端斜斜生生一一个个椭椭圆圆形形芽芽孢孢，另另一一端端同

15、同时时出出现现伴伴孢孢晶晶体体。晶晶体体典典型型为为菱菱形形、也也有有圆圆形形、方方形形、椭椭圆圆形形、不不规规则则形形，通通常常1 1个，也有几个毒素主成分，但亦有发现对昆虫无毒。个，也有几个毒素主成分，但亦有发现对昆虫无毒。芽孢和伴孢晶体的释放芽孢和伴孢晶体的释放：芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。第23页，讲稿共115张，创作于星期日苏云金芽孢杆菌的特征第24页，讲稿共115张，创作于星期日Vegetative cell of Bacillus thuringiensis第25页，讲稿共115张，创作于星期日细菌的芽孢类型细菌的芽孢类型苏云金

16、芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体苏云金芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体第26页，讲稿共115张，创作于星期日Crystal diversity of B.thuringiensis第27页，讲稿共115张，创作于星期日晶体毒素蛋白晶体毒素蛋白晶体蛋白空间结构第28页，讲稿共115张，创作于星期日Spore and parasporal crystal sporeCrystal第29页，讲稿共115张，创作于星期日2)生理生化生理生化 Bt对营养条件要求不高。所需主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种N源，碳源和无机盐中正常发育。通常所利用的营养:碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖、直接为Bt吸收利用 N源：牛肉

17、膏、蛋白胨、酵母粉、花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、玉米浆等。第30页，讲稿共115张，创作于星期日 无无机机盐盐：K K2 2HPOHPO4 4、MgSOMgSO4 4、CaCOCaCO3 3。主主要要元元素素有有磷磷、硫硫、镁镁、钾钾、钠钠、钙钙6 6种种，微微量量元元素素的的锰锰、锌锌、硅硅、铁铁等等，微微量量元元素素所所需需甚甚微微，水水中中含含的的微微量量无无素素即即可可满满足足，多多了了有有毒。毒。温温度度：10-4010-40都都能能生生长长，以以28-3228-32较较适适。35-4035-40生生长长很很快快，但但易易衰衰老老，温温度度低低则则生生长长缓缓慢慢。因因此此在在一一定定范

18、范围围内内提提高高温温度度会会缩缩短短生生长长期期，但但菌菌数数量量会会降降低低；而而温温度度低低则则生生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。第31页，讲稿共115张，创作于星期日 pH：与与其其他他细细菌菌类类似似，该该菌菌适适于于微微碱碱性性条条件件，最最适适pHpH是是7.57.5，当当pHpH达达8.58.5时时还还能能形形成成芽芽孢孢，如如pHpH降降至至5 5以以下下则则不能形成芽孢。不能形成芽孢。氧氧:是是一一种种好好氧氧细细菌菌，需需要要充充足足的的空空气气才才能能生生长长发发育育良良好好。尤尤其其当当芽芽孢孢形形成成时时，若若缺缺乏乏足

19、足够够的的空空气气时时会会延延迟迟芽芽孢孢的的形形成成或或不不能能形形成成。它它还还影影响响到到生生长长速速度度、菌菌数数和和晶晶体体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。第32页，讲稿共115张，创作于星期日 紫紫外外线线:阳阳光光对对芽芽孢孢有有致致死死作作用用。芽芽孢孢暴暴露露在在紫紫外外光光下下很很快快失失活活:1:1分分钟钟失失活活12%12%、2 2分分钟钟50%50%失失活活、1010分分钟钟99%99%失失活活。在在自自然然阳阳光光下下，3030分分钟钟50%50%失失活活，6060分分钟钟80%80%失失活活。在在2

20、90-290-400nm400nm处死亡率最高。处死亡率最高。抗抗生生素素及及化化学学物物:放放线线菌菌素素、氯氯霉霉素素、红红霉霉素素及及一一些些化化学学物物质质都都有有影影响响。乳乳化化剂剂对对芽芽孢孢萌萌发发有有抑抑制制作作用用，TritonX-100TritonX-100在在100g/ml100g/ml时，全部抑制了芽孢萌发。时，全部抑制了芽孢萌发。第33页，讲稿共115张，创作于星期日(2)分类、命名及来源分类、命名及来源1)分类分类 苏苏云云金金杆杆菌菌亚亚种种在在生生物物化化学学、血血清清学学、孢孢子子体体、抗抗原原、抗抗生生素素的合成、酶、噬菌体和外原凝集素组成的合成、酶、噬菌

21、体和外原凝集素组成等方面都有差异。等方面都有差异。Krieg等等人人在在1983年年提提出出了了一一种种非非常常简简单单的的利利用用致致病病类类型型对对细细菌菌类类微微生生物物杀杀虫虫剂剂进进行行分分类类的的方方法法，虽虽然然这这种种方方法法不不太太适适合合Bt（例例如如，许许多多亚亚种种产产生生的的毒毒素素涵涵盖盖了了多多种种不不同同致致病病型型），但但是是对对于于Bt商商品品化化产产品品来来说是一种比较适合的分类方式。说是一种比较适合的分类方式。第34页，讲稿共115张，创作于星期日 致病型致病型A:包括对包括对鳞翅目鳞翅目的致病菌（的致病菌（BTSBTS在美国已注册应用于在美国已注册应用

22、于5050多种蔬菜、多种蔬菜、3030多种水果、多种水果、3030种田间谷物、种田间谷物、1515种牧草及香种牧草及香料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，如黏虫、这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心虫等）虫等）另外有些公司利用遗传工程技术使得另外有些公司利用遗传工程技术使得BtBt菌寄主范围扩大，并菌寄主范围扩大，并且延长了其在田且延长了其在田间的存活时

23、间。同时利用融合两个不同株系发间的存活时间。同时利用融合两个不同株系发展出一些新产品，甚至新的株系。展出一些新产品，甚至新的株系。第35页，讲稿共115张，创作于星期日致病型致病型B:包括对包括对双翅目双翅目的致病菌（以色列亚种，首先在美国注的致病菌（以色列亚种，首先在美国注册，已在全球范围内作为控制蚊虫和蚋的人工合成有机杀虫剂册，已在全球范围内作为控制蚊虫和蚋的人工合成有机杀虫剂的替代品使用。在德国广泛用于控制当地的顽固性公共卫生害的替代品使用。在德国广泛用于控制当地的顽固性公共卫生害虫虫伊蚊，该菌同时也被伊蚊，该菌同时也被WHOWHO和和UNUN纳入到其蚊虫控制计划中。作纳入到其蚊虫控制计

24、划中。作用机理都为芽孢中的四个主要活性蛋白起作用）用机理都为芽孢中的四个主要活性蛋白起作用）第36页，讲稿共115张，创作于星期日致病型致病型C:则主要包括对则主要包括对鞘翅目鞘翅目的致病菌（日本金龟子芽孢杆菌的致病菌（日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，对鞘翅目害和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，对鞘翅目害虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或单独的作用）。虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或单独的作用）。第37页，讲稿共115张，创作于星期日2)鉴定鉴定 种以下可按鞭毛抗原、生理生化，酯酶电泳分为变种(var.)或亚种(subsp.)，现在已有60

25、多个血清型80多个亚种。第38页，讲稿共115张，创作于星期日生理生化生理生化:细菌、病毒常用对生理生化反应的正负和强细菌、病毒常用对生理生化反应的正负和强弱来区分。弱来区分。BtBt可利用各亚种间生理生化上的差异，如对碳源可利用各亚种间生理生化上的差异，如对碳源和氮源的利用及某些酶类和代谢产物的有无来区分。这种方和氮源的利用及某些酶类和代谢产物的有无来区分。这种方法简便易行常用，但亲缘较近的变种之间差别往往很小，容法简便易行常用，但亲缘较近的变种之间差别往往很小，容易导致错误。易导致错误。第39页，讲稿共115张，创作于星期日 酯酯酶酶电电泳泳:比比一一般般生生化化反反应应具具有有较较高高的

26、的特特异异性性，实实验验条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。PCR技术用于技术用于Bt基因分类基因分类 第40页，讲稿共115张，创作于星期日H抗抗原原:H H为为德德语语Hauch(Hauch(扩扩散散)之之意意，不不同同亚亚种种抗抗原原分分析析的的血血清清学学反反应应则则具具有有较较高高的的鉴鉴别别能能力力，是是利利用用细细菌菌或或其其某某一一部部分分构构造造具具有有的的特特异异性性抗抗原原注注射射动动物物体体内内，促促使使动动物物血血清清中中产产生生和和抗抗原原起起作作用用的的抗抗体体，抗抗体体存存在在于于动动物物血血清清中中，利利用用已已知知的的抗抗

27、血血清清可可以以检检定定未未知知的的菌菌种种。抗抗原原和和抗抗体体可可以以发发生生多多种种不不同同的的作作用用，常常用用凝凝集集反反应应。根根据据未未知知菌菌种种和和已已知知抗抗血血清清在在试试管管中中有有无无凝凝集集现现象象便便可可判判别别此此菌菌是是否否为为与与抗抗血血清清相相应应的的菌菌种种。BtBt鞭鞭毛毛具具有有这这种种特特异异抗抗原原性性，能能用用血血清清方法加以鉴别。方法加以鉴别。第41页，讲稿共115张，创作于星期日苏云金杆菌的分类方式第42页，讲稿共115张，创作于星期日3)命名命名 苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据四条苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据四条:根根据据采

28、采集集地地:如如苏苏云云金金亚亚种种、肯肯尼尼亚亚亚亚种种、加加拿拿大大亚亚种种、以以色色列列亚亚种种、九九州州亚亚种种、东东北北亚亚种种(九九州州和和东东北北为为日日本本省省名名)、云云南南亚亚种种、武武汉汉亚种、华中亚种、山东亚种等。亚种、华中亚种、山东亚种等。根据根据寄主虫名寄主虫名:如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。根据根据分离者分离者名字：名字：如如Kurstak、Thompson、Morrison等。等。根据根据病症病症进行命名：进行命名：如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种等。如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种等。第43页，讲稿共115张，创作于星

29、期日4)苏云金芽胞杆菌的来源与分离苏云金芽胞杆菌的来源与分离 MartinMartin等等19901990年年在在澳澳洲洲AdelaideAdelaide举举行行的的第第五五届届ICIPICIP会会议议上上，统统计计了了BtBt菌菌株株的的分分离离情情况况：22%22%来来于于昆昆虫虫体体、44%44%来来源源于于土土壤壤，18%18%来来自自贮贮藏藏物物，其其他他(粉粉尘尘、植植物等物等)占占16%16%。地理区域地理区域：目前目前除南极洲除南极洲未见报道外，其他地区均有发现未见报道外，其他地区均有发现BTBT。在。在海拔海拔近近4 4英里的高处英里的高处几乎没有昆虫生存，而在那里科学家仍发

30、现了能几乎没有昆虫生存，而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的杀死毛虫、蚊子和甲虫的BtBt菌种。菌种。第44页，讲稿共115张，创作于星期日存在环境：存在环境：昆虫：昆虫：许多许多BtBt分离自蚕分离自蚕(场场)等饲养昆虫体上。等饲养昆虫体上。贮贮藏藏产产品品：第第一一株株正正式式命命名名的的BtBt分分离离于于德德国国苏苏云云金金地地区面粉厂的地中海粉螟上。区面粉厂的地中海粉螟上。植植物物体体表表面面：近近年年来来随随着着研研究究的的不不断断深深入入，发发现现植植物物体表面亦存在体表面亦存在BtBt。第45页，讲稿共115张，创作于星期日 土土壤壤：土土壤壤是是微微生生物物的的大大

31、本本营营，苏苏云云金金芽芽胞胞杆杆菌菌是是一一种种土土壤壤习习居居菌菌。MartinMartin和和TraversTravers从从土土壤壤中中找找到到新新的的BtBt菌菌种种，这这一一事事实实改改变变了了BtBt菌菌的的历历史史。因因为为起起初初科科学学家家们们认认为为，只只有有找找到到死死昆昆虫虫才才能能找找到到这这些些细细菌菌。本本来来以以为为它它是是一一种种昆昆虫虫病病，但但实实践践证证明明，BtBt实实际际上上是是多多种种土土壤中的正常组份壤中的正常组份。第46页，讲稿共115张，创作于星期日(3)苏云金芽胞杆菌的菌种保藏苏云金芽胞杆菌的菌种保藏 1)原理和要求原理和要求 BtBt芽

32、芽孢孢具具有有高高度度的的抗抗逆逆性性，经经几几十十年年后后仍仍保保持持萌萌发发能能力，并能正常发育成营养细胞。力，并能正常发育成营养细胞。菌菌种种保保藏藏要要求求的的总总原原则则是是代代谢谢速速度度尽尽量量低低，同同时时又又不不失失活。活。主主要要有有采采用用液液氮氮、冷冷冻冻等等的的低低温温保保藏藏、石石蜡蜡油油的的隔隔氧氧保保藏藏和和砂土管的砂土管的干燥保藏干燥保藏等方法。等方法。第47页，讲稿共115张，创作于星期日2)保存方法保存方法砂土管保藏：砂土管保藏：取取干干净净河河沙沙，用用0.1N0.1N盐盐酸酸和和0.1N0.1N氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液交交替替处处理理后后，用用自自来来

33、水水冲冲洗洗至至中中性性，烘烘干干后后用用磁磁铁铁吸吸去去其其中中铁铁屑屑，6060目目过过筛筛后后待待用用。同同时时取取有有机机质质少少的的砂砂壤壤土土烘烘干干、研研碎碎、120120目目过过筛筛。按按2:12:1混混合合砂砂和和土土，2-3g/2-3g/管管装装入入110cm110cm厚厚壁壁指指形形管管，用用棉棉塞塞塞塞好好，湿湿热热灭灭菌菌2 2次次，干干热热灭灭菌菌1 1次次，用用LBLB液液体体培养基检查无菌后使用。培养基检查无菌后使用。在在无无菌菌条条件件下下，在在每每支支砂砂土土管管吸吸入入0.3ml0.3ml左左右右芽芽孢孢悬悬液液，塞塞上上棉棉塞塞。置真空干燥器内用真空泵抽

34、干。置真空干燥器内用真空泵抽干。第48页，讲稿共115张，创作于星期日冷冻干燥法：冷冻干燥法：美美国国农农业业部部Brownsville Brownsville LabLab常常采采用用此此法法。它它的的原原理理是是首首先先使使微微生生物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。滤纸条保藏法：滤纸条保藏法：法法国国PasteurPasteur研研究究所所采采用用此此法法。将将BtBt芽芽孢孢悬悬液液吸吸附附到到滤滤纸纸条条上上，干干燥后加以保存。燥后加以保存。将将滤滤纸纸剪剪成成长长条条，每每支支安安瓿瓿管管内内放放1-31-3条条，

35、湿湿热热灭灭菌菌后后烘烘干干备备用用。用用脱脱脂脂牛牛奶奶制制成成浓浓的的菌菌悬悬液液后后，再再用用灭灭菌菌注注射射器器或或长长的的毛毛细细管管把把悬悬液液滴滴在在滤滤纸纸条条上上，以以滤滤纸纸条条完完全全湿湿润润为为止止。将将安安瓿瓿管管置置于于真真空空干干燥燥器器内内抽真空使其干燥再封口保存。抽真空使其干燥再封口保存。第49页，讲稿共115张，创作于星期日液体石蜡斜面保藏法：液体石蜡斜面保藏法：日日本本九九州州大大学学常常用用斜斜面面橡橡皮皮塞塞法法保保存存，此此法法主主要要是是利利用用低低湿湿和和缺缺氧氧来来保保藏藏菌菌种种。当当菌菌种种接接种种于于LBLB斜斜面面3030培培养养727

36、2小小时时后后，倾倾入入已已灭灭菌菌的的液液体体石蜡至完全淹没斜面为止。石蜡至完全淹没斜面为止。菌膜保藏法：菌膜保藏法：该该法法存存活活力力高高，便便于于邮邮寄寄，使使菌菌种种保保藏藏微微型型化化。把把菌菌种种膜膜片片干干燥燥后后装入无菌乙烯薄膜，菌种袋封口后即可邮寄。装入无菌乙烯薄膜，菌种袋封口后即可邮寄。第50页，讲稿共115张，创作于星期日3)研究和保存机构研究和保存机构 目前国内外许多研究和生产单位均保藏有大量目前国内外许多研究和生产单位均保藏有大量BtBt菌种。菌种。美美 国国EcogenEcogen公公 司司 保保 存存 90009000株株 左左 右右BtBt菌菌，美美 国国 农

37、农 业业 部部Brownsville Brownsville LabLab保保存存了了HD-XHD-X系系列列，俄俄亥亥俄俄州州州州立立大大学学保保存存的的大大量量的突变株。的突变株。法法国国巴巴斯斯德德研研究究所所昆昆虫虫病病原原研研究究中中心心亦亦是是WHOWHO昆昆虫虫病病原原细细菌参考中心，保藏有菌参考中心，保藏有35003500株芽孢杆菌。株芽孢杆菌。第51页，讲稿共115张，创作于星期日 英国英国温室作物研究所温室作物研究所H.BurgesH.Burges博士以博士以HB-XHB-X系列编号保藏。系列编号保藏。日日本本九九州州大大学学AizawaAizawa和和OhhaOhha博博

38、士士及及北北海海道道大大学学IIZUKAIIZUKA教授均保存有较多的教授均保存有较多的BtBt资源。资源。国内国内的的华中农大华中农大农业部微生物重点实验室芽孢杆菌研究农业部微生物重点实验室芽孢杆菌研究室、室、中国林业科学院中国林业科学院、湖北农科院湖北农科院BtBt研究及开发中心、研究及开发中心、中国中国科学院武汉病毒所科学院武汉病毒所、福建农林大学福建农林大学生物中心均保存有一定数量生物中心均保存有一定数量的的BtBt菌株。菌株。第52页，讲稿共115张，创作于星期日(4)(4)作用机制作用机制主要是毒素发挥作用主要是毒素发挥作用 伴孢晶体伴孢晶体（最早发现）（最早发现）随后发现的：苏云

39、金素、营养期随后发现的：苏云金素、营养期杀虫蛋白（杀虫蛋白（VIPsVIPs）、几丁质酶、卵磷脂酶、）、几丁质酶、卵磷脂酶、肠毒素等。肠毒素等。第53页，讲稿共115张，创作于星期日生物活性物质生物活性物质苏云金芽胞杆苏云金芽胞杆菌活性因子菌活性因子胞内胞内胞外胞外苏云金素苏云金素双效菌素双效菌素营养期杀虫蛋白营养期杀虫蛋白活芽胞活芽胞死芽胞死芽胞芽胞衣芽胞衣芽胞芽胞杀虫晶体蛋白杀虫晶体蛋白免疫抑制因子免疫抑制因子A肠毒素肠毒素辅助蛋白辅助蛋白自身诱导物抑制蛋白自身诱导物抑制蛋白蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质核苷类核苷类多元醇类多元醇类酶类酶类几丁质酶几丁质酶卵磷酯酶卵磷酯酶C溶血素溶血素第54页，

40、讲稿共115张，创作于星期日原生动物原始后生动物海绵动物 扁形动物门轮虫纲 腹毛纲 线虫动物门软体动物门环节动物门节肢动物门鳞翅目双翅目鞘翅目膜翅目螨类 等9个目纽形动物门 棘皮动物门苔藓动物门腕足动物门半索动物门脊椎动物门癌细胞植物线虫动物线虫丝虫 活活 性性 谱谱疟原虫血吸虫,肺吸虫第55页，讲稿共115张，创作于星期日主要的活性因子：主要的活性因子：杀虫晶体蛋白（ICPs，主要杀虫毒素）：包括晶体蛋白（Cry）和溶细胞蛋白（Cyt）苏云金素 营养期杀虫蛋白（VIPs）第56页，讲稿共115张，创作于星期日杀虫晶体蛋白的作用机制杀虫晶体蛋白的作用机制 五个环节五个环节：昆虫肠道溶解、酶解活

41、化、与受体结合、膜昆虫肠道溶解、酶解活化、与受体结合、膜孔形成、细胞裂解。孔形成、细胞裂解。昆虫取食后，内毒素首先在昆虫中肠昆虫取食后，内毒素首先在昆虫中肠水解为具有活性的小分子肽水解为具有活性的小分子肽，通过围，通过围食膜与中肠上皮细胞上的食膜与中肠上皮细胞上的受体结合受体结合。昆虫中肠被麻痹，停止取食。昆虫中肠被麻痹，停止取食。毒素毒素插入膜内并引起损伤或穿孔插入膜内并引起损伤或穿孔。这种穿孔。这种穿孔破坏了钾离子梯度平衡破坏了钾离子梯度平衡，从，从而而导致细胞表面突起膨胀，坏死导致细胞表面突起膨胀，坏死，使昆虫中肠的完整性受到破坏，其中的，使昆虫中肠的完整性受到破坏，其中的内含物渗漏到体

42、腔中。内含物渗漏到体腔中。第57页，讲稿共115张，创作于星期日作用机制作用机制伴孢晶体伴孢晶体鳞翅目幼虫口服鳞翅目幼虫口服伴孢晶体在肠道迅速溶解伴孢晶体在肠道迅速溶解（中肠（中肠pHpH为为9.0-10.59.0-10.5）吸附于上皮细胞，引起渗透性丧失，肠道穿孔吸附于上皮细胞，引起渗透性丧失，肠道穿孔昆虫不再进食，昆虫不再进食，1 13 3天后饿死天后饿死 第58页，讲稿共115张，创作于星期日(5)安全性安全性 国内外进行了一系列大量而细致的试验，证明对脊椎动物是安全的，故WHO和FAO极力推荐生产应用。使使用用Bt制制剂剂仍仍需需慎慎重重：产-外毒素（苏云金素）菌株对哺乳动物有害。Bt

43、Bt近近缘缘种种有能产生食物毒素、引起腹泻、呕吐、恶心的蜡蜡螟螟芽芽孢孢杆杆菌菌和引起人、畜炭疽病和肺损伤和肠道感染的炭炭疽疽芽芽孢杆菌；以色列亚种溶液孢杆菌；以色列亚种溶液的的伴孢晶体毒素对动物有毒。对于Bt制剂的开发，从长期的眼光来考虑仍需注意安全性问题。第59页，讲稿共115张，创作于星期日(6)毒力评价标准与质量标准毒力评价标准与质量标准 早早先先，BtBt质质量量是是以以芽芽孢孢含含量量为为标标准准的的。但但不不同同制制剂剂的的毒毒力力并并不不与与芽芽孢孢的的含含量量成成正正相相关关。一一些些芽芽孢孢含含量量相相等等的的制制剂剂其其毒毒力力并并不不相相同同，有有时时芽芽孢孢含含量量高

44、高的的制剂毒力反不如芽孢含量低的制剂。制剂毒力反不如芽孢含量低的制剂。产产生生这这种种情情况况的的原原因因是是因因为为BtBt杀杀虫虫活活性性是是由由晶晶体体毒毒素素、芽芽孢孢及及其其他他因因素素共共同同决决定定的的，而而且且晶晶体体是是主主要要的的杀杀虫虫因因素素，芽芽孢孢是是较较次次要要的的杀杀虫虫因因素素，单单是芽孢含量高并不能决定毒力也高。是芽孢含量高并不能决定毒力也高。另另外外，芽芽孢孢数数随随产产品品贮贮存存时时间间延延长长而而降降低低，特特别别是是液液剂剂下下降降速速度度更更快快。所所以以发发展展了了用用生生物物测测定定的的方方法法来来检检测测制制剂剂的的毒毒力力（IUIU单单位

45、位，国国际际标标准单位）。准单位）。第60页，讲稿共115张，创作于星期日 1966年国际昆虫病理和微生物防治学会建议：年国际昆虫病理和微生物防治学会建议：法国巴斯德研究所生产的法国巴斯德研究所生产的E-61E-61作为国际标准制剂作为国际标准制剂，该剂的毒力效价定，该剂的毒力效价定为为1000IU(1000IU(国际单位国际单位)，试虫试虫为为地中海粉螟地中海粉螟。其它其它BTBT制剂用生测方法与制剂用生测方法与E-61E-61比较毒力，用比较毒力，用IU/mgIU/mg来毒力效价。来毒力效价。样品的毒力效价样品的毒力效价=(=(标准品的标准品的LCLC5050/样品的样品的LCLC5050

46、)*)*标准品的毒效标准品的毒效(IU/mg)(IU/mg)第61页，讲稿共115张，创作于星期日(7)生产生产 自自19381938年年法法国国第第一一个个产产品品SporeineSporeine面面世世以以来来，6060年年代代后后，美美国国、前前苏苏联联、加加拿拿大大、捷捷克克、比比利利时时、法法国国、德德国国、罗罗马马尼尼亚亚、朝朝鲜鲜、芬芬兰兰、泰泰国等国均相继办厂。国等国均相继办厂。中中国国在在农农业业部部的的注注册册厂厂家家已已超超过过7676家家(2010(2010年年)，年年产产量量达达20-3020-30万万吨吨，在国内的东西南北地区均有建厂。在国内的东西南北地区均有建厂。

47、目目前前BtBt生生产产主主要要有有液液体体深深层层发发酵酵和和半半固固体体发发酵酵两两种种。生生产产工工艺艺主主要要牵牵涉涉到菌种、培养基和培养条件，后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。到菌种、培养基和培养条件，后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。第62页，讲稿共115张，创作于星期日产品登记要求：产品登记要求：综综合合WHOWHO、Burges(1982)Burges(1982)、SIPSIP协协议议、EPAEPA（美美国国环环保保署署）、EECEEC（欧欧洲洲经经济济共共同同体体）等等方方面面法法规规，在在产产品品登登记记时时应应提提供供以以下下1010个个方方面面的的材料材料:产品资料

48、产品资料:名称、类型、含菌数、稀释剂、惰性成份、保护剂名称、类型、含菌数、稀释剂、惰性成份、保护剂 细菌鉴定细菌鉴定:学名学名、俗名、鉴定标准及程序、俗名、鉴定标准及程序 细细菌菌生生物物学学特特性性:目目标标寄寄主主种种类类、病病原原性性、应应用用历历史史、最最高高、适适宜宜温温度度、天然发生、地理分布、寄主范围、稳定性天然发生、地理分布、寄主范围、稳定性第63页，讲稿共115张，创作于星期日 质量检验质量检验:标准化方法等 应应用用和和应应用用方方法法:农业、园林、森林保护种类、控制害虫阶段、应用时间、方法和比例 有效性的实验数据有效性的实验数据:室内、野外、田间、抗性资料 残留残留 对哺

49、乳动物感染和毒性对哺乳动物感染和毒性 对人的影响对人的影响 对环境和野生动物的危险第64页，讲稿共115张，创作于星期日(8)剂型剂型1)液剂：包括液剂：包括悬浮剂悬浮剂、乳剂乳剂、水剂水剂和和油剂油剂等等 使使用用普普遍遍和和方方便便的的剂剂型型，是是经经发发酵酵后后收收获获到到的的芽芽孢孢和和晶晶体体以以水水悬悬液液保保存存，再再加加适适当当的的展展着着剂剂，粘粘着着剂剂及及防防腐腐剂剂而而成成。除除水水剂剂外外，尚尚有有乳乳剂剂。乳乳剂剂是是将将离离心心收收集集到到的的芽芽孢孢、晶晶体体加加入入乳乳化化剂剂中中均均匀匀混混合合而而成成。此此外外，还还有有以以油油类类作作为为载体的油剂，它

50、多用于空中喷雾防治森林害虫。载体的油剂，它多用于空中喷雾防治森林害虫。液剂保存时间不太长，一般液剂保存时间不太长，一般3-63-6个月内不会沉淀失效。个月内不会沉淀失效。第65页，讲稿共115张，创作于星期日2)可湿性粉剂：可湿性粉剂：100亿个芽孢亿个芽孢/克可湿性粉、克可湿性粉、16000国际单位国际单位WP 其其用用途途是是制制成成悬悬液液喷喷雾雾用用，为为此此，产产品品中中加加入入了了湿湿润润剂剂。其其作作用用在在于于使使菌菌剂剂的的微微小小颗颗粒粒有有亲亲水水性性，能能在在水水中中很很好好地地溶溶化化和分散，并使菌悬液能在植物表面展着和附着。和分散，并使菌悬液能在植物表面展着和附着。