生物技术常用技术技术及应用精选PPT.ppt

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1、关于生物技术常用技关于生物技术常用技术技术及应用术技术及应用第1页，讲稿共108张，创作于星期二一、一、PCR的用途的用途体体外外扩增增特特异异DNA片片段段的的技技术，能能快快速速、特特异异地地扩增目的增目的DNA片段。片段。能能通通过试管管内内的的数数小小时反反应将将特特定定的的DNA片段片段扩增数百万倍。增数百万倍。迅迅速速获取取大大量量的的单一一核核酸酸片片段段，为分分子子生生物物学研究提供了学研究提供了强大的工具。大的工具。第2页，讲稿共108张，创作于星期二1953年年，Watson和和Crick提提出出DNA双双螺螺旋旋结构构及及半保留复制半保留复制模型。模型。1958年年，Me

2、selson和和Stahl用用实验证实DNA半半保保留复制模型。留复制模型。70年年代代以以来来，人人们采采用用两两种种思思路路去去尝试建建立立基基因因的的无无性性繁繁殖殖体体系系，一一是是基基因因克克隆隆技技术，二二是是体外体外扩增增技技术。二、二、发展展历程程第3页，讲稿共108张，创作于星期二1971年年，Khorana（美美国国MIT教教授授，1968年年诺贝尔医医学学奖得得主主）：“经过DNA变性性，与与合合适适引引物物杂交交，用用DNA聚聚合合酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该过程便可克隆程便可克隆tRNA基因。基因。”核酸体外核酸体外扩增最早增最早设想被想被遗忘原因忘原因

3、:（1）很）很难进行行测序和合成寡核苷酸引物；序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年年Smith等等发现了了II型型限限制制性性内内切切酶，体体外克隆基因已成外克隆基因已成为可能。可能。第4页，讲稿共108张，创作于星期二1976年年，台台籍籍科科学学家家钱嘉嘉韵韵（AliceChien）从从黄黄石石国国家家公公园园的的嗜嗜热菌菌Thermusaquaticus中中分分离离出出热稳定的定的TaqDNA聚合聚合酶。1985年年，美美国国Cetus公公司司人人类遗传研研究究室室的的Mullis发 明明 聚聚 合合 酶 链 反反 应（Polymerase ChainReaction，PCR），Sai

4、ki等等首首次次应用用PCR法法成成功功地地扩增增了了人人-珠珠蛋蛋白白的的DNA，并并应用用于于镰刀刀状状红细胞胞贫血的血的产前前诊断。断。第5页，讲稿共108张，创作于星期二19881988年年年年SaikiSaiki开开开开始始始始将将将将耐耐耐耐热热性性性性TaqTaqDNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶应应用用用用于于于于PCRPCR，整整整整个个个个反反反反应应只加一次只加一次只加一次只加一次酶酶即可，即可，即可，即可，扩扩增特异性和效率都明增特异性和效率都明增特异性和效率都明增特异性和效率都明显显改善，操作大改善，操作大改善，操作大改善，操作大为简为简化。化。化。化。19891989

5、年被誉年被誉年被誉年被誉为为“分子年分子年分子年分子年”，列，列，列，列PCRPCR为为十余十余十余十余项发项发明之首。明之首。明之首。明之首。19931993年，年，年，年，MullisMullis荣荣荣荣获诺贝尔获诺贝尔化学化学化学化学奖奖。Kary Mullis 1993第6页，讲稿共108张，创作于星期二三、三、PCR的基本原理的基本原理试管中管中进行的行的DNA复制反复制反应，依据，依据DNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变性性和和复复性性的的性性质；通通过人人为控制体外合成系控制体外合成系统的温度，使的温度，使双双链DNA变成

6、成单链，单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，DNA聚聚合合酶使使引引物物沿沿着着单链模模板板延延伸伸为双双链DNA。第7页，讲稿共108张，创作于星期二待待扩增片段增片段第8页，讲稿共108张，创作于星期二第9页，讲稿共108张，创作于星期二高温高温变性性第10页，讲稿共108张，创作于星期二低温退火低温退火第11页，讲稿共108张，创作于星期二中温延伸中温延伸第12页，讲稿共108张，创作于星期二第13页，讲稿共108张，创作于星期二第14页，讲稿共108张，创作于星期二第15页，讲稿共108张，创作于星期二第16页，讲稿共108张，创作于星期二第17页，讲稿共108张，创作

7、于星期二第18页，讲稿共108张，创作于星期二第19页，讲稿共108张，创作于星期二第20页，讲稿共108张，创作于星期二第21页，讲稿共108张，创作于星期二PCR每每一一步步的的转换通通过温温度度的的改改变控控制制。DNA模模板板解解链（变性性）、引引物物与与模模板板结合合（退退火火）、DNA聚聚合合酶催催化化新新生生DNA的的合合成成（延延伸伸）三个步）三个步骤构成构成PCR反反应的一个循的一个循环。此循此循环反复反复进行，可使目的行，可使目的DNA得以迅速得以迅速扩增。增。第22页，讲稿共108张，创作于星期二理理论扩增增率率：2n递增增（n为循循环次次数数），2530循循环，目，目标

8、DNA可增加可增加109倍。倍。实际扩增增率率：()n，X为PCR的的实际扩增增率，率，平均平均约为75%。由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗，酶活活力力的的下下降降等等因因素素，扩增增产物物的的增增加加，逐逐渐由由指指数数形形式式变为线性性形形式式，所所以以实际上上进行行30个个循循环后后，扩增增倍数一般可达倍数一般可达106107。以以上上“变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为PCR一一轮循循环。第23页，讲稿共108张，创作于星期二PCR扩增曲增曲线第24页，讲稿共108张，创作于星期二必须的仪器设备必须的仪器设备第25页，讲稿共108张，创作于星期二四、四、PCR反反应体系

9、与流程体系与流程反反应体系体系模板模板（DNA或或RNA）引物引物TaqDNA聚合聚合酶10PCR缓冲液冲液1.54mMMg2+0.2mMdNTP反反应流程流程预变性性变性性退火退火延伸延伸延伸完全延伸完全终止止2535循循环第26页，讲稿共108张，创作于星期二（一）（一）PCR的反应体系的反应体系1.引物（引物（primer）2.酶（TaqDNApolymerase）3.dNTP4.模板模板（template）5.Mg2+（magnesium）第27页，讲稿共108张，创作于星期二1 1、引物、引物引物：决定引物：决定PCR反反应的特异性的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板物的特异性

10、取决于引物与模板DNA互互补的程度的程度理理论上，只要知道任何一段模板上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就能按其就能按其设计互互补的寡核苷酸的寡核苷酸链做引物，用做引物，用PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量在体外大量扩增增第28页，讲稿共108张，创作于星期二u基基本本原原则是是最最大大限限度度地地提提高高扩增增效效率率和和特特异异性，同性，同时尽可能抑制非特异性尽可能抑制非特异性扩增。增。引物设计的原则引物设计的原则第29页，讲稿共108张，创作于星期二引物引物长度：度：15-30bp，常用，常用20bp左右左右引物的有效引物的有效引物的有效引物的有效长长度不能大于度不能大于

11、度不能大于度不能大于 38bp38bp，否，否，否，否则则最适最适最适最适延伸温度会超延伸温度会超延伸温度会超延伸温度会超过过TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶酶的最适温度的最适温度的最适温度的最适温度（7474），不能保），不能保），不能保），不能保证证PCRPCR扩扩增增增增产产物的特异性物的特异性物的特异性物的特异性引物引物扩增跨度：增跨度：以以500bp为宜宜特定条件下可特定条件下可特定条件下可特定条件下可扩扩增增增增长长至至至至10kb10kb的片段的片段的片段的片段第30页，讲稿共108张，创作于星期二引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜宜G+CG+C太少

12、太少太少太少扩扩增效果不佳，增效果不佳，增效果不佳，增效果不佳，G+CG+C过过多易出多易出多易出多易出现现非特异非特异非特异非特异条条条条带带ATGCATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免5 5个以上的个以上的个以上的个以上的嘌嘌呤或呤或呤或呤或嘧啶嘧啶核核核核苷酸的成串排列，尤其苷酸的成串排列，尤其苷酸的成串排列，尤其苷酸的成串排列，尤其33端不端不端不端不应应超超超超过过3 3个个个个连续连续的的的的GG或或或或C C，因，因，因，因为这样为这样会使引物在会使引物在会使引物在会使引物在G+CG+C富集区富集区富集区富集区 引引引引发错误发错误延伸

13、延伸延伸延伸避免引物内部出避免引物内部出现二二级结构和引物构和引物间互互补特特特特别别避免避免避免避免 33端的互端的互端的互端的互补补，否，否，否，否则则会形成引物二聚体，会形成引物二聚体，会形成引物二聚体，会形成引物二聚体，产产生非特异性的生非特异性的生非特异性的生非特异性的扩扩增条增条增条增条带带 第31页，讲稿共108张，创作于星期二第32页，讲稿共108张，创作于星期二引物引物3端的碱基要求端的碱基要求严格配格配对（不能做任何修（不能做任何修饰）特特特特别别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱

14、基，以避免因末端碱基不配碱基不配碱基不配碱基不配对对而而而而导导致致致致PCRPCR失失失失败败引物引物5端可修端可修饰引物引物引物引物55端限定着端限定着端限定着端限定着PCRPCR产产物的物的物的物的长长度，但度，但度，但度，但对扩对扩增特增特增特增特异性影响不大；引物异性影响不大；引物异性影响不大；引物异性影响不大；引物55端碱基可不与模板端碱基可不与模板端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNADNA互互互互补补而呈游离状而呈游离状而呈游离状而呈游离状态态；引物；引物；引物；引物55端最多可加端最多可加端最多可加端最多可加1010个碱个碱个碱个碱基而基而基而基而对对PCRPCR反反反反应应

15、无影响无影响无影响无影响第33页，讲稿共108张，创作于星期二35 5 35 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记第34页，讲稿共108张，创作于星期二引物的特异性：引物的特异性：引物引物引物引物应应与核酸序列数据与核酸序列数据与核酸序列数据与核酸序列数据库库的其它序列无明的其它序列无明的其它序列无明的其它序列无明显显同源性同源性同源性同源性引物量：引物量：每条引物的每条引物的每条引物的每条引物的浓浓度度度度0.10.50.10.5 M

16、M，以最低引物量，以最低引物量，以最低引物量，以最低引物量产产生所生所生所生所需要的需要的需要的需要的结结果果果果为为好好好好引物引物引物引物浓浓度偏高会引起度偏高会引起度偏高会引起度偏高会引起错错配和非特异性配和非特异性配和非特异性配和非特异性扩扩增，且可增，且可增，且可增，且可增加引物之增加引物之增加引物之增加引物之间间形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会第35页，讲稿共108张，创作于星期二2、酶及其浓度、酶及其浓度n n目前有两种目前有两种目前有两种目前有两种 TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶酶供供供供应应 天然天然天然天然酶酶：从水生嗜：从水生嗜

17、：从水生嗜：从水生嗜热热杆菌中提杆菌中提杆菌中提杆菌中提纯纯 基因工程基因工程基因工程基因工程酶酶：大：大：大：大肠肠杆菌合成杆菌合成杆菌合成杆菌合成n n一个典型的一个典型的一个典型的一个典型的 PCRPCR反反反反应约应约需需需需酶酶量量量量1-2.5U/100ul1-2.5U/100ul体系体系体系体系n n浓浓度度度度过过高可引起非特异性高可引起非特异性高可引起非特异性高可引起非特异性扩扩增，增，增，增，浓浓度度度度过过低低低低则则合成合成合成合成产产物物物物量减少量减少量减少量减少第36页，讲稿共108张，创作于星期二DNA聚合聚合酶 Klenow片段片段 T4DNA聚合聚合酶 Ta

18、qDNA聚合聚合酶（应用最广）用最广）其他其他DNA聚合聚合酶：TthDNA聚合聚合酶VentDNA聚合聚合酶 PfuDNA聚合聚合酶等等第37页，讲稿共108张，创作于星期二Taq酶的保真性不高的保真性不高53聚合聚合酶活性和活性和53外切外切酶活性，无活性，无35外切活性外切活性;在在PCR反反应中如中如发生某些碱基的生某些碱基的错配，配，该酶是是没有校正功能的。保真性不如没有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合聚合酶等。等。第38页，讲稿共108张，创作于星期二3、dNTP的质量与浓度的质量与浓度 在在在在PCRPCR反反反反应应中，中，中，中，dNTPdNTP应为应为50502002

19、00 MM，浓浓度度度度过过低低低低会降低会降低会降低会降低PCRPCR产产物的物的物的物的产产量量量量 注意注意注意注意4 4种种种种dNTPdNTP的的的的浓浓度要相等（等摩度要相等（等摩度要相等（等摩度要相等（等摩尔尔配制配制配制配制）,如其中如其中如其中如其中任何一种任何一种任何一种任何一种浓浓度不同于其它几种度不同于其它几种度不同于其它几种度不同于其它几种时时（偏高或偏低），就（偏高或偏低），就（偏高或偏低），就（偏高或偏低），就会引起会引起会引起会引起错错配配配配 高高高高浓浓度的度的度的度的dNTPdNTP可与可与可与可与MgMg2+2+结结合，使游离的合，使游离的合，使游离的合

20、，使游离的MgMg2+2+浓浓度度度度下降，影响下降，影响下降，影响下降，影响DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶的活性的活性的活性的活性 第39页，讲稿共108张，创作于星期二4、模板、模板DNA模板模板模板模板DNADNA的来源：的来源：的来源：的来源：微生物中提取微生物中提取微生物中提取微生物中提取DNADNA从从从从细细胞中提取胞中提取胞中提取胞中提取DNADNA：血：血：血：血细细胞、胞、胞、胞、绒绒毛、尿毛、尿毛、尿毛、尿样样、毛、毛、毛、毛发发、精斑、口腔上皮、精斑、口腔上皮、精斑、口腔上皮、精斑、口腔上皮细细胞胞胞胞 固定和包埋的固定和包埋的固定和包埋的固定和包埋的组织标组织标本：

21、脱蜡、蛋白本：脱蜡、蛋白本：脱蜡、蛋白本：脱蜡、蛋白酶酶KK消化消化消化消化模板模板模板模板DNADNA的的的的浓浓度：度：度：度：0.10.12ug/100ul2ug/100ul体系体系体系体系 PCRPCR产产量随模板量随模板量随模板量随模板DNADNA浓浓度的增加而度的增加而度的增加而度的增加而显显著升高著升高著升高著升高 模板模板模板模板DNADNA浓浓度度度度过过高高高高导导致非特异性致非特异性致非特异性致非特异性产产物增加物增加物增加物增加 第40页，讲稿共108张，创作于星期二5、Mg2+浓度浓度Mg2+对PCR扩增的增的特异性特异性和和产量量有有显著的影著的影响响在一般的在一般

22、的PCR反反应中，各种中，各种dNTP浓度度为200umol/L时，Mg2+浓度度为1.52.0mmol/L为宜宜Mg2+浓度度过高，反高，反应特异性降低，出特异性降低，出现非特异非特异扩增，增，浓度度过低会降低低会降低TaqDNA聚合聚合酶的活的活性，使反性，使反应产物减少物减少第41页，讲稿共108张，创作于星期二PCRAgarose gel electrophoresis产物分析产物分析产物分析产物分析UV 检测检测3-4 hours（二）、（二）、PCR的反的反应流程流程第42页，讲稿共108张，创作于星期二1.温度与温度与时间的的设置置2.循循环次数次数3.常常见问题第43页，讲稿共

23、108张，创作于星期二1、温度与时间的设置、温度与时间的设置设置置变性性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反准反应中采用中采用三温度点法三温度点法，双，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至性，再迅速冷却至4060退火，然退火，然后快速升温至后快速升温至7075延伸，延伸，对于于较短靶基因（短靶基因（长度度100300bp）可采用）可采用二温度点法二温度点法，将退火与延伸温度合二将退火与延伸温度合二为一，一，一般采用一般采用94变性，性，65左右退火与延伸。左右退火与延伸。第44页，讲稿共108张，创作于星期二变性温度与时间：变性温度与时间：一般一般9394，1min足以使模板足以

24、使模板变性性 若低于若低于若低于若低于9393则则需延需延需延需延长时间长时间 但温度不能但温度不能但温度不能但温度不能过过高，因高，因高，因高，因为为高温高温高温高温环环境境境境对酶对酶的活性有影响。的活性有影响。的活性有影响。的活性有影响。第45页，讲稿共108张，创作于星期二退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的重要因素特异性的重要因素退火温度与退火温度与时间，取决于引物的，取决于引物的长度、碱基度、碱基组成及其成及其浓度，度，还有靶基因序列的有靶基因序列的长度度对于于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量含量约50%的引物，的引物，55作作为

25、选择最适退火温度的起点最适退火温度的起点较为理想理想第46页，讲稿共108张，创作于星期二引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm（解（解链温度）温度）4(G+C)+2(A+T)复性温度复性温度=Tm值（510）在在在在TmTm值值允允允允许许范范范范围围内，内，内，内，选择较选择较高的复性温度可大大减高的复性温度可大大减高的复性温度可大大减高的复性温度可大大减少引物和模板少引物和模板少引物和模板少引物和模板间间的非特异性的非特异性的非特异性的非特异性结结合，提高合，提高合，提高合，提高PCRPCR反反反反应应的的的的特异性特异性特异性特

26、异性复性复性时间一般一般为3060s，足以使引物与模板，足以使引物与模板之之间完全完全结合合第47页，讲稿共108张，创作于星期二延伸温度与时间：延伸温度与时间：TaqDNA聚合聚合酶的生物学活性：的生物学活性：7080150核苷酸核苷酸/S/酶分子分子7060核苷酸核苷酸/S/酶分子分子5524核苷酸核苷酸/S/酶分子分子高于高于90时，DNA合成几乎不能合成几乎不能进行行第48页，讲稿共108张，创作于星期二延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般延伸温度：一般选择在在7075之之间 常用温度常用温度常用温度常用温度为为7272 过过高的延伸温度不利于引物和模板的高的延伸温度不利于引

27、物和模板的高的延伸温度不利于引物和模板的高的延伸温度不利于引物和模板的结结合。合。合。合。延伸反延伸反应时间：根据待：根据待扩增片段增片段长度而定度而定 1Kb1Kb以内的以内的以内的以内的DNADNA片段，延伸片段，延伸片段，延伸片段，延伸时间时间1min1min（足（足（足（足够够）3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需的靶序列需的靶序列需3 34min4min 扩扩增增增增10kb10kb需延伸至需延伸至需延伸至需延伸至15min15min延伸延伸时间过长会会导致非特异性致非特异性扩增增对低低浓度模板的度模板的扩增，延伸增，延伸时间要稍要稍长些些第49页，讲稿共108张，创作于星期二2、

28、循环次数、循环次数循循环次数次数 决定决定决定决定PCRPCR扩扩增程度增程度增程度增程度循循环次数次数 主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的的的的浓浓度度度度循循环次数：次数：选在在3040次之次之间循循环次数越多，非特异性次数越多，非特异性产物的量亦随之增物的量亦随之增多多第50页，讲稿共108张，创作于星期二如何提高如何提高PCR中的中的DNA聚合聚合酶的保真性？的保真性？在在在在PCRPCR反反反反应应体体体体系系系系中中中中，除除除除使使使使用用用用TaqTaq DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶，掺掺入入入入少少少少量量量量的的的的具具具具有有有有3

29、535外外外外切切切切酶酶活活活活性性性性的的的的耐耐耐耐热热DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶，如如如如PfuPfu，VentVent，PwoPwo等等等等，错错配率可降配率可降配率可降配率可降为为原来的原来的原来的原来的 1/101/10；MgMg2+2+浓浓度度度度尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响DNADNA合成；合成；合成；合成；减少高温反减少高温反减少高温反减少高温反应时间应时间，这样这样DNADNA热损伤热损伤将减少；将减少；将减少；将减少；减少循减少循减少循减少循环环数。数。数。数。第51页，讲稿共108张，创作于星期二如何提高如何提高PCR

30、扩增的特异性？增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板结结合的特异性；合的特异性；合的特异性；合的特异性；缩缩短短短短退退退退火火火火和和和和延延延延伸伸伸伸时时间间，可可可可减减减减少少少少错错误误引引引引发发及及及及多多多多余余余余的的的的DNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶分子参与分子参与分子参与分子参与酶酶促延伸的机会；促延伸的机会；促延伸的机会；促延伸的机会；降降降降低低低低引引引引物物物物和和和和酶酶的的的的浓浓度度度度也也也也可可可可以以以以减减减减少少少少错错误误引引引引发发，尤尤尤尤其其其其是是是

31、是能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引发发；改改改改变变MgMg2+2+的的的的浓浓度可度可度可度可进进一步提高一步提高一步提高一步提高扩扩增的特异性。增的特异性。增的特异性。增的特异性。第52页，讲稿共108张，创作于星期二引物引物引物引物设计设计的特异性；的特异性；的特异性；的特异性；减少循减少循减少循减少循环环次数；次数；次数；次数；热热启启启启动动（HotHotStartStart）。即即即即首首首首先先先先将将将将模模模模板板板板变变性性性性，然然然然后后后后在在在在较较高高高高温温温温度度度度时时加加加加入入入入TaqTaq DNADNA

32、聚聚聚聚合合合合酶酶、引引引引物物物物及及及及MgClMgCl2 2等等等等一一一一些些些些重重重重要要要要成成成成分分分分，这这样样使使使使得得得得引引引引物物物物在在在在较较高高高高温温温温度度度度下下下下与与与与模模模模板板板板退退退退火火火火，提高了反提高了反提高了反提高了反应应的的的的严谨严谨性，使性，使性，使性，使扩扩增更特异；增更特异；增更特异；增更特异；采采采采用用用用二二二二对对引引引引物物物物即即即即外外外外引引引引物物物物和和和和内内内内引引引引物物物物进进行行行行扩扩增增增增来来来来提提提提高高高高扩扩增增增增的的的的特异性。特异性。特异性。特异性。第53页，讲稿共10

33、8张，创作于星期二（三）、（三）、PCR扩增产物的检测方法扩增产物的检测方法 凝胶凝胶凝胶凝胶电电泳：泳：泳：泳：琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳法泳法泳法泳法、聚丙、聚丙、聚丙、聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶电电泳法泳法泳法泳法 PCR-PCR-限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段长长度多度多度多度多态态性分析法（性分析法（性分析法（性分析法（PCR-RFLPPCR-RFLP）单链单链构型多构型多构型多构型多态态性分析法（性分析法（性分析法（性分析法（PCR-SSCPPCR-SSCP）核酸探核酸探核酸探核酸探针杂针杂交法交法交法交法 PCRPCR产产物物物物测测序序序序

34、PCR-OLAPCR-OLA（PCR-oligonucleotideligationassay)PCR-oligonucleotideligationassay)荧荧光光光光PCRPCR 第54页，讲稿共108张，创作于星期二1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 制胶制胶制胶制胶 加加加加样样 电电泳泳泳泳 紫外光紫外光紫外光紫外光检测检测第55页，讲稿共108张，创作于星期二 特点：特点：特点：特点：分辨力高，分辨力高，分辨力高，分辨力高，长长度度度度仅仅相差相差相差相差1bp1bp的的的的DNADNA分子即可分开；分子即可分开；分子即可分开；分子即可分开；上上上上样样量量量量远远大于大于大于大

35、于琼琼脂糖凝胶；脂糖凝胶；脂糖凝胶；脂糖凝胶；回收的回收的回收的回收的DNADNA纯纯度高；度高；度高；度高；采采采采用用用用银银染染染染色色色色DNADNA或或或或RNARNA，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，比比比比琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电电泳泳泳泳中中中中EBEB染染染染色色色色法法法法高高高高2-52-5倍倍倍倍，而而而而且且且且避避避避免免免免EBEB易退色的弱点。易退色的弱点。易退色的弱点。易退色的弱点。用用用用途途途途：PCRPCR扩扩增增增增指指指指纹纹图图、多多多多重重重重PCRPCR、PCRPCR产产物物物物限限限限制制制制性性性性片片片片段段段段长长度度度

36、度多多多多态态性性性性（PCR-PCR-RFLPRFLP）分析。）分析。）分析。）分析。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第56页，讲稿共108张，创作于星期二3.PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)据据据据目目目目的的的的基基基基因因因因序序序序列列列列可可可可查查出出出出所所所所包包包包含含含含的的的的酶酶切切切切位位位位点点点点，用用用用相相相相应应的的的的限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶消消消消化化化化PCRPCR扩扩增增增增产产物物物物，然然然然后后后后进进行行行行电电泳泳泳泳，观观察察察察消

37、消消消化化化化片片片片段段段段的的的的大小是否与序列大小是否与序列大小是否与序列大小是否与序列资资料相符。料相符。料相符。料相符。用途：用途：用途：用途：传传染病病原体基因分型染病病原体基因分型染病病原体基因分型染病病原体基因分型 人人人人类类基因的基因的基因的基因的变变异性研究。异性研究。异性研究。异性研究。第57页，讲稿共108张，创作于星期二4.单链构型多态性分析法单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCPPCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）将将将

38、将PCRPCR产产物双物双物双物双链链DNADNA（dsDNAdsDNA）变变性性性性为单链为单链DNADNA（ssDNAssDNA），加），加），加），加样样于于于于变变性聚丙性聚丙性聚丙性聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶进进行行行行电电泳，泳，泳，泳，由于由于由于由于DNADNA分子在凝胶中的分子在凝胶中的分子在凝胶中的分子在凝胶中的电电泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空间结间结构有关，而空构有关，而空构有关，而空构有关，而空间结间结构又与构又与构又与构又与ssDNAssDNA序列有关。因此，序列有关。因此，序列有关。因此，序列有关

39、。因此，电电泳泳泳泳结结束后，束后，束后，束后，ssDNAssDNA带带位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出PCRPCR产产物序列的差异。物序列的差异。物序列的差异。物序列的差异。第58页，讲稿共108张，创作于星期二5.核酸探针杂交法核酸探针杂交法点点杂交交反向点反向点杂交交微孔板微孔板杂交交Southern印迹印迹杂交交第59页，讲稿共108张，创作于星期二点杂交（点杂交（dotblot）原原原原理理理理：将将将将扩扩增增增增产产物物物物变变性性性性后后后后直直直直接接接接点点点点在在在在尼尼尼尼龙龙膜膜膜膜或或或或硝硝硝硝酸酸酸酸纤纤维维素素素

40、素膜膜膜膜上上上上，再再再再用用用用放射性或非放射性放射性或非放射性放射性或非放射性放射性或非放射性标记标记物物物物标记标记的寡核苷酸探的寡核苷酸探的寡核苷酸探的寡核苷酸探针针与之与之与之与之杂杂交。交。交。交。探探探探针针：放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素标记标记探探探探针检测针检测的敏感、特异，具有不的敏感、特异，具有不的敏感、特异，具有不的敏感、特异，具有不稳稳定性和放射性危害。定性和放射性危害。定性和放射性危害。定性和放射性危害。非非非非放放放放射射射射性性性性物物物物质质（如如如如生生生生物物物物素素素素、地地地地高高高高辛辛辛辛、荧荧光光光光素素素素等等等等）标标记

41、记的的的的探探探探针针稳稳定定定定性性性性高高高高、使使使使用用用用安安安安全全全全、检检测测速度快速度快速度快速度快 用途：主要用于用途：主要用于用途：主要用于用途：主要用于PCRPCR产产物特异性物特异性物特异性物特异性鉴鉴定及定及定及定及变变异分析。异分析。异分析。异分析。第60页，讲稿共108张，创作于星期二反向点杂交反向点杂交(reversedotblot)原原原原理理理理：使使使使用用用用带带有有有有标标记记物物物物的的的的引引引引物物物物进进行行行行PCRPCR扩扩增增增增，然然然然后后后后将将将将扩扩增增增增产产物物物物变变性性性性。将将将将不不不不同同同同的的的的寡寡寡寡核核

42、核核酸酸酸酸探探探探针针固固固固定定定定在在在在尼尼尼尼龙龙膜膜膜膜上上上上，用用用用变变性性性性的的的的PCRPCR产产物与之物与之物与之物与之杂杂交。交。交。交。探探探探针针：严严格格格格设计设计，具有相同的，具有相同的，具有相同的，具有相同的杂杂交反交反交反交反应应条件。条件。条件。条件。用用用用途途途途：反反反反向向向向点点点点杂杂交交交交特特特特别别适适适适用用用用于于于于遗遗传传性性性性疾疾疾疾病病病病多多多多个个个个位位位位点点点点的的的的点点点点突突突突变变分析。分析。分析。分析。结结果分析：果分析：果分析：果分析：正常正常正常正常纯纯合子合子合子合子 突突突突变纯变纯合子合子

43、合子合子 杂杂合子合子合子合子第61页，讲稿共108张，创作于星期二微孔板杂交微孔板杂交(microplatehybridization)(microplatehybridization)夹夹心心杂杂交交第62页，讲稿共108张，创作于星期二荧光探针杂交法荧光探针杂交法目前目前临床上常用床上常用荧光探光探针法来法来检测PCR产物，物，主要的方法有主要的方法有TaqMan技技术、分子信、分子信标技技术、复合探复合探针法等。法等。（定量（定量PCR详述）。述）。第63页，讲稿共108张，创作于星期二Southern印迹杂交印迹杂交(Southernblot)第64页，讲稿共108张，创作于星期二6

44、.PCR-ELISA 引物双引物双引物双引物双标记标记：生物素：生物素：生物素：生物素/地高辛、地高辛、地高辛、地高辛、荧荧光素光素光素光素 引物引物引物引物55端端端端标记标记生物素生物素生物素生物素+RNA+RNA探探探探针标记针标记地高辛地高辛地高辛地高辛 将将将将一一一一寡寡寡寡核核核核酸酸酸酸探探探探针针固固固固定定定定于于于于微微微微孔孔孔孔板板板板作作作作为为捕捕捕捕获获探探探探针针，变变性性性性的的的的PCRPCR产产物物物物单单链链的的的的某某某某一一一一区区区区域域域域与与与与之之之之杂杂交交交交后后后后，此此此此单单链链间间接接接接地地地地固固固固定定定定于于于于微微微微

45、孔孔孔孔板板板板上上上上。再再再再用用用用一一一一非非非非放放放放射射射射性性性性标标记记物物物物标标记记（如如如如生生生生物物物物素素素素）的的的的检检测测探探探探针针与固定于微孔板的与固定于微孔板的与固定于微孔板的与固定于微孔板的PCRPCR产产物物物物单链单链的另一区域的另一区域的另一区域的另一区域杂杂交。交。交。交。第65页，讲稿共108张，创作于星期二7.PCR产物测序产物测序 方法：方法：双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸链链末端末端末端末端终终止法止法止法止法 化学裂解法化学裂解法化学裂解法化学裂解法用途：目前一般多用于科研用途：目前一般多用于科研第66页，讲稿共1

46、08张，创作于星期二五、五、PCR常常见问题无扩增产物无扩增产物非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾假阳性假阳性第67页，讲稿共108张，创作于星期二PCR常见问题之一常见问题之一无扩增产物无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延伸时退火温度太高，延伸时间太短间太短原因原因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取模纯化模板或者使用试剂盒提取模板板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferB

47、uffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚体和链重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物内二级结构）或者换一管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照正对照(marker?)(marker?)有条带，而样品则无有条带，而样品则无；第68页，讲稿共108张，创作于星期二PCR常见问题之二常见问题之二 非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或或小小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第69页，讲

48、稿共108张，创作于星期二PCR常见问题之二常见问题之二1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多原因原因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二二阶段温度法阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增第70页，讲稿

49、共108张，创作于星期二PCR常见问题之三常见问题之三 拖尾(与非特异性扩增条带明显不同，非特异性扩增带有明显的条带分隔。)现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M12第71页，讲稿共108张，创作于星期二PCR常见问题之三常见问题之三1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多原因原因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.

50、适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的浓的浓度度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾第72页，讲稿共108张，创作于星期二PCR常见问题之四常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。使用带有污染的试剂。使用带有污染的试剂。公用试剂如液体石蜡等污染。公用试剂如液体石蜡等污染。操作时手套引起的交叉污染。操作时手套引起的交叉污染。加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有加样器通道易形