生物技术常用技术技术及应用精选课件.ppt

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1、关于生物技术常用关于生物技术常用技术技术及应用技术技术及应用第一页，本课件共有108页一、一、PCR的用途的用途体体外外扩增增特特异异DNA片片段段的的技技术，能能快快速速、特特异异地地扩增目的增目的DNA片段。片段。能能通通过试管管内内的的数数小小时反反应将将特特定定的的DNA片段片段扩增数百万倍。增数百万倍。迅迅速速获取取大大量量的的单一一核核酸酸片片段段，为分分子子生生物学研究提供了物学研究提供了强大的工具。大的工具。第二页，本课件共有108页1953年年，Watson和和Crick提提出出DNA双双螺螺旋旋结构构及及半保留复制半保留复制模型。模型。1958年年，Meselson和和St

2、ahl用用实验证实DNA半半保留复制模型。保留复制模型。70年年代代以以来来，人人们采采用用两两种种思思路路去去尝试建建立立基基因因的的无无性性繁繁殖殖体体系系，一一是是基基因因克克隆隆技技术，二是二是体外体外扩增增技技术。二、二、发展展历程程第三页，本课件共有108页1971年年，Khorana（美美国国MIT教教授授，1968年年诺贝尔医医学学奖得得主主）：“经过DNA变性性，与与合合适适引引物物杂交交，用用DNA聚聚合合酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该过程便可克隆程便可克隆tRNA基因。基因。”核酸体外核酸体外扩增最早增最早设想被想被遗忘原因忘原因:（1）很）很难进行行测序和合

3、成寡核苷酸引物；序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年年Smith等等发现了了II型型限限制制性性内内切切酶，体外克隆基因已成体外克隆基因已成为可能。可能。第四页，本课件共有108页1976年年，台台籍籍科科学学家家钱嘉嘉韵韵（AliceChien）从从黄黄石石国国家家公公园园的的嗜嗜热菌菌Thermusaquaticus中中分分离出离出热稳定的定的TaqDNA聚合聚合酶。1985年年，美美国国Cetus公公司司人人类遗传研研究究室室的的Mullis发明明聚聚合合酶链反反应（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等等首首次次应用用PCR法法成成功功地地扩增增了了人

4、人-珠珠蛋蛋白白的的DNA，并并应用用于于镰刀状刀状红细胞胞贫血的血的产前前诊断。断。第五页，本课件共有108页19881988年年年年SaikiSaiki开开开开始始始始将将将将耐耐耐耐热热性性性性TaqTaqDNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶应应用用用用于于于于PCRPCR，整整整整个个个个反反反反应应只只只只加加加加一一一一次次次次酶酶即即即即可可可可，扩扩增增增增特特特特异异异异性性性性和和和和效效效效率率率率都都都都明明明明显显改改改改善善善善，操操操操作作作作大大大大为简为简化。化。化。化。19891989年被誉年被誉年被誉年被誉为为“分子年分子年分子年分子年”，列，列，列，列PCR

5、PCR为为十余十余十余十余项发项发明之首。明之首。明之首。明之首。19931993年，年，年，年，MullisMullis荣荣荣荣获诺贝尔获诺贝尔化学化学化学化学奖奖。Kary Mullis 1993第六页，本课件共有108页三、三、PCR的基本原理的基本原理试管中管中进行的行的DNA复制反复制反应，依据，依据DNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变性性和和复复性性的性的性质；通通过人人为控制体外合成系控制体外合成系统的温度，使的温度，使双双链DNA变成成单链，单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，DNA聚聚合合酶使使引引物物

6、沿沿着着单链模模板板延延伸伸为双双链DNA。第七页，本课件共有108页待待扩增片段增片段第八页，本课件共有108页第九页，本课件共有108页高温高温变性性第十页，本课件共有108页低温退火低温退火第十一页，本课件共有108页中温延伸中温延伸第十二页，本课件共有108页第十三页，本课件共有108页第十四页，本课件共有108页第十五页，本课件共有108页第十六页，本课件共有108页第十七页，本课件共有108页第十八页，本课件共有108页第十九页，本课件共有108页第二十页，本课件共有108页第二十一页，本课件共有108页PCR每每一一步步的的转换通通过温温度度的的改改变控控制制。DNA模模板板解解

7、链（变性性）、引引物物与与模模板板结合合（退退火火）、DNA聚聚合合酶催催化化新新生生DNA的的合合成成（延伸延伸）三个步）三个步骤构成构成PCR反反应的一个循的一个循环。此此循循环反反复复进行行，可可使使目目的的DNA得得以以迅迅速速扩增。增。第二十二页，本课件共有108页理理论扩增增率率：2n递增增（n为循循环次次数数），2530循循环，目，目标DNA可增加可增加109倍。倍。实际扩增增率率：()n，X为PCR的的实际扩增增率，率，平均平均约为75%。由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗，酶活活力力的的下下降降等等因因素素，扩增增产物物的的增增加加，逐逐渐由由指指数数形形式式变为线性性

8、形形式式，所所以以实际上上进行行30个个循循环后后，扩增增倍倍数数一一般可达般可达106107。以以上上“变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为PCR一一轮循循环。第二十三页，本课件共有108页PCR扩增曲增曲线第二十四页，本课件共有108页必须的仪器设备必须的仪器设备第二十五页，本课件共有108页四、四、PCR反反应体系与流程体系与流程反反应体系体系模板模板（DNA或或RNA）引物引物TaqDNA聚合聚合酶10PCR缓冲液冲液1.54mMMg2+0.2mMdNTP反反应流程流程预变性性变性性退火退火延伸延伸延伸完全延伸完全终止止2535循循环第二十六页，本课件共有108页（一）（一）PC

9、R的反应体系的反应体系1.引物（引物（primer）2.酶（TaqDNApolymerase）3.dNTP4.模板模板（template）5.Mg2+（magnesium）第二十七页，本课件共有108页1 1、引物、引物引物：决定引物：决定PCR反反应的特异性的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板物的特异性取决于引物与模板DNA互互补的程度的程度理理论上，只要知道任何一段模板上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就能按其就能按其设计互互补的寡核苷酸的寡核苷酸链做引物，用做引物，用PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量在体外大量扩增增第二十八页，本课件共有108页u基基本本原原则是是

10、最最大大限限度度地地提提高高扩增增效效率率和和特特异异性，同性，同时尽可能抑制非特异性尽可能抑制非特异性扩增。增。引物设计的原则引物设计的原则第二十九页，本课件共有108页引物引物长度：度：15-30bp，常用，常用20bp左右左右引物的有效引物的有效引物的有效引物的有效长长度不能大于度不能大于度不能大于度不能大于 38bp38bp，否，否，否，否则则最适最适最适最适延伸温度会超延伸温度会超过TaqDNATaqDNA聚合聚合酶的最适温度的最适温度（7474），不能保），不能保），不能保），不能保证证PCR扩增增产物的特异性物的特异性引物引物扩增跨度：增跨度：以以500bp为宜宜特定条件下可特定

11、条件下可特定条件下可特定条件下可扩扩增增增增长长至至至至10kb的片段的片段的片段的片段第三十页，本课件共有108页引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜宜G+C太少太少扩增效果不佳，增效果不佳，G+C过过多易出多易出多易出多易出现现非特非特非特非特异条异条异条异条带带ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的个以上的个以上的个以上的嘌嘌呤或呤或呤或呤或嘧啶嘧啶核苷酸的成串排列，尤其核苷酸的成串排列，尤其核苷酸的成串排列，尤其核苷酸的成串排列，尤其3端不端不端不端不应应超超超超过过3个个个个连续连续的的的的G或或C，因，因，因，因为这样为这样会使引物在会使引物在会使

12、引物在会使引物在G+C富集区富集区引引发错误延伸延伸避免引物内部出避免引物内部出现二二级结构和引物构和引物间互互补特特别避免避免33端的互端的互补，否，否则会形成引物二聚体，会形成引物二聚体，产生非特异性的生非特异性的扩增条增条带第三十一页，本课件共有108页第三十二页，本课件共有108页引物引物3端的碱基要求端的碱基要求严格配格配对（不能做任何（不能做任何修修饰）特特特特别别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配碱基不配对而而导致致PCRPCR失失败引物引物5端可修端可修饰引物引

13、物55端限定着端限定着端限定着端限定着PCRPCR产物的物的长度，但度，但对扩增特增特异性影响不大；引物异性影响不大；引物55端碱基可不与模板端碱基可不与模板端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA互互补而呈游离状而呈游离状态；引物；引物55端最多可加端最多可加10个碱个碱基而基而对PCR反反反反应应无影响无影响无影响无影响第三十三页，本课件共有108页35 5 35 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记第三十四页，本课件共有108页引物

14、的特异性：引物的特异性：引物引物引物引物应应与核酸序列数据与核酸序列数据与核酸序列数据与核酸序列数据库库的其它序列无明的其它序列无明的其它序列无明的其它序列无明显显同源同源同源同源性性性性引物量：引物量：每条引物的每条引物的浓度度0.10.5 M，以最低引物量，以最低引物量产生所需要的生所需要的结果果为好好引物引物引物引物浓浓度偏高会引起度偏高会引起度偏高会引起度偏高会引起错错配和非特异性配和非特异性配和非特异性配和非特异性扩扩增，且可增增，且可增增，且可增增，且可增加引物之加引物之加引物之加引物之间间形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会第三十五页，本课件共有108

15、页2、酶及其浓度、酶及其浓度n n目前有两种目前有两种目前有两种目前有两种 TaqDNA聚合聚合酶供供应天然天然酶：从水生嗜：从水生嗜热杆菌中提杆菌中提纯 基因工程基因工程基因工程基因工程酶酶：大：大：大：大肠肠杆菌合成杆菌合成杆菌合成杆菌合成n n一个典型的一个典型的一个典型的一个典型的 PCR反反反反应约应约需需需需酶酶量量量量1-2.5U/100ul1-2.5U/100ul体系体系体系体系n n浓浓度度度度过过高可引起非特异性高可引起非特异性高可引起非特异性高可引起非特异性扩扩增，增，增，增，浓浓度度度度过过低低低低则则合成合成合成合成产产物量物量物量物量减少减少减少减少第三十六页，本课

16、件共有108页DNA聚合聚合酶Klenow片段片段T4DNA聚合聚合酶 TaqDNA聚合聚合酶（应用最广）用最广）其他其他DNA聚合聚合酶：TthDNA聚合聚合酶VentDNA聚合聚合酶 PfuDNA聚合聚合酶等等第三十七页，本课件共有108页Taq酶的保真性不高的保真性不高53聚合聚合酶活性和活性和53外切外切酶活性，无活性，无35外切活性外切活性;在在PCR反反应中如中如发生某些碱基的生某些碱基的错配，配，该酶是没有校正功能的。保真性不如是没有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚聚合合酶等。等。第三十八页，本课件共有108页3、dNTP的质量与浓度的质量与浓度 在在在在PCR反反应中，中，

17、dNTP应为应为5050200 MM，浓浓度度度度过过低会降低低会降低低会降低低会降低PCR产物的物的产量量 注意注意注意注意4种种dNTPdNTP的的的的浓浓度要相等（等摩度要相等（等摩度要相等（等摩度要相等（等摩尔尔配制配制配制配制）,如其如其如其如其中任何一种中任何一种中任何一种中任何一种浓浓度不同于其它几种度不同于其它几种度不同于其它几种度不同于其它几种时时（偏高或偏低），（偏高或偏低），（偏高或偏低），（偏高或偏低），就会引起就会引起就会引起就会引起错错配配配配 高高高高浓浓度的度的度的度的dNTPdNTP可与可与Mg2+结合，使游离的合，使游离的Mg2+浓度下降，影响度下降，影响D

18、NADNA聚合聚合聚合聚合酶酶的活性的活性的活性的活性 第三十九页，本课件共有108页4、模板、模板DNA模板模板模板模板DNADNA的来源：的来源：微生物中提取微生物中提取DNA从从细胞中提取胞中提取DNA：血：血：血：血细细胞、胞、胞、胞、绒绒毛、尿毛、尿毛、尿毛、尿样样、毛、毛、毛、毛发、精斑、口腔上皮、精斑、口腔上皮细胞胞固定和包埋的固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白本：脱蜡、蛋白酶K消化消化消化消化模板模板模板模板DNA的的的的浓浓度：度：度：度：0.10.12ug/100ul体系体系体系体系PCRPCR产产量随模板量随模板量随模板量随模板DNADNA浓浓度的增加而度的增加而度的增加而

19、度的增加而显显著升高著升高著升高著升高 模板模板DNADNA浓浓度度度度过过高高高高导导致非特异性致非特异性致非特异性致非特异性产产物增加物增加物增加物增加 第四十页，本课件共有108页5、Mg2+浓度浓度Mg2+对PCR扩增的增的特异性特异性和和产量量有有显著的著的影响影响在一般的在一般的PCR反反应中，各种中，各种dNTP浓度度为200umol/L时，Mg2+浓度度为1.52.0mmol/L为宜宜Mg2+浓度度过高，反高，反应特异性降低，出特异性降低，出现非特异非特异扩增，增，浓度度过低会降低低会降低TaqDNA聚合聚合酶的活性，使反的活性，使反应产物减少物减少第四十一页，本课件共有108

20、页PCRAgarose gel electrophoresis产物分析产物分析产物分析产物分析UV 检测检测3-4 hours（二）、（二）、PCR的反的反应流程流程第四十二页，本课件共有108页1.温度与温度与时间的的设置置2.循循环次数次数3.常常见问题第四十三页，本课件共有108页1、温度与时间的设置、温度与时间的设置设置置变性性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反准反应中采用中采用三温度点法三温度点法，双，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至性，再迅速冷却至4060退火，退火，然后快速升温至然后快速升温至7075延伸，延伸，对于于较短靶基因（短靶基因（长度度100300b

21、p）可采用）可采用二温度点法二温度点法，将退火与延伸温度合二将退火与延伸温度合二为一，一，一般采用一般采用94变性，性，65左右退火与延伸。左右退火与延伸。第四十四页，本课件共有108页变性温度与时间：变性温度与时间：一般一般9394，1min足以使模板足以使模板变性性 若低于若低于若低于若低于93则需延需延长时间但温度不能但温度不能过高，因高，因为高温高温环境境对酶的活性有的活性有影响。影响。第四十五页，本课件共有108页退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的重要因素特异性的重要因素退火温度与退火温度与时间，取决于引物的，取决于引物的长度、碱度

22、、碱基基组成及其成及其浓度，度，还有靶基因序列的有靶基因序列的长度度对于于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量含量约50%的引物，的引物，55作作为选择最适退火温度的起点最适退火温度的起点较为理理想想第四十六页，本课件共有108页引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm（解（解链温度）温度）4(G+C)+2(A+T)复性温度复性温度=Tm值（510）在在在在Tm值允允许范范围内，内，选择较高的复性温度可高的复性温度可大大减少引物和模板大大减少引物和模板间的非特异性的非特异性结合，提合，提高高PCRPCR反反应的特异性的特异性复性复性时间一般

23、一般为3060s，足以使引物与模，足以使引物与模板之板之间完全完全结合合第四十七页，本课件共有108页延伸温度与时间：延伸温度与时间：TaqDNA聚合聚合酶的生物学活性：的生物学活性：7080150核苷酸核苷酸/S/酶分子分子7060核苷酸核苷酸/S/酶分子分子5524核苷酸核苷酸/S/酶分子分子高于高于90时，DNA合成几乎不能合成几乎不能进行行第四十八页，本课件共有108页延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般延伸温度：一般选择在在7075之之间 常用温度常用温度常用温度常用温度为为72过高的延伸温度不利于引物和模板的高的延伸温度不利于引物和模板的结合。合。延伸反延伸反应时间：根据

24、待：根据待扩增片段增片段长度而定度而定1Kb以内的以内的以内的以内的DNA片段，延伸片段，延伸片段，延伸片段，延伸时间时间1min（足（足够）34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min 扩扩增增增增10kb10kb需延伸至需延伸至需延伸至需延伸至15min15min延伸延伸时间过长会会导致非特异性致非特异性扩增增对低低浓度模板的度模板的扩增，延伸增，延伸时间要稍要稍长些些第四十九页，本课件共有108页2、循环次数、循环次数循循环次数次数 决定决定决定决定PCRPCR扩扩增程度增程度增程度增程度循循环次数次数 主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板DNA的的浓度度循循环次

25、数：次数：选在在3040次之次之间循循环次数越多，非特异性次数越多，非特异性产物的量亦随之物的量亦随之增多增多第五十页，本课件共有108页如何提高如何提高PCR中的中的DNA聚合聚合酶的保真性？的保真性？在在在在PCR反反应体体系系中中，除除使使用用TaqDNA聚聚合合酶，掺入入少少量量的的具具具具有有有有35外外切切酶活活性性的的耐耐热DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶，如如如如PfuPfu，Vent，PwoPwo等等，错错配率可降配率可降配率可降配率可降为为原来的原来的原来的原来的 1/101/10；Mg2+2+浓浓度度度度尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响DNA合成；合成；合成；合成；减

26、少高温反减少高温反减少高温反减少高温反应时间应时间，这样这样DNADNA热损伤热损伤将减少；将减少；将减少；将减少；减少循减少循环数。数。第五十一页，本课件共有108页如何提高如何提高PCR扩增的特异性？增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板升高退火温度可增加引物与模板结结合的特异性；合的特异性；合的特异性；合的特异性；缩短短退退火火和和延延伸伸时间，可可减减少少错误引引发及及多多余余的的DNA聚合聚合酶分子参与分子参与酶促延伸的机会；促延伸的机会；降降降降低低低低引引引引物物物物和和和和酶酶的的的的浓浓度度度度也也也也可可可可以以以以

27、减减减减少少少少错错误误引引引引发发，尤尤尤尤其其其其是是是是能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引能减少引物二聚体的引发发；改改改改变变MgMg2+的的的的浓浓度可度可度可度可进进一步提高一步提高一步提高一步提高扩扩增的特异性。增的特异性。增的特异性。增的特异性。第五十二页，本课件共有108页引物引物引物引物设计设计的特异性；的特异性；的特异性；的特异性；减少循减少循减少循减少循环环次数；次数；次数；次数；热热启启启启动动（HotStart）。即即首首先先将将模模板板变性性，然然后后在在较高高温温度度时加加入入TaqDNA聚聚合合酶、引引物物及及MgClMgCl2 2等

28、等等等一一一一些些些些重重重重要要要要成成成成分分分分，这这样样使使使使得得得得引引引引物物物物在在在在较较高高高高温温温温度度度度下下下下与与与与模模模模板板板板退火，提高了反退火，提高了反退火，提高了反退火，提高了反应应的的的的严谨严谨性，使性，使性，使性，使扩扩增更特异；增更特异；增更特异；增更特异；采采采采用用用用二二二二对对引引引引物物物物即即即即外外外外引引引引物物物物和和和和内内内内引引引引物物物物进进行行行行扩扩增增增增来来来来提提提提高高高高扩扩增的特异性。增的特异性。增的特异性。增的特异性。第五十三页，本课件共有108页（三）、（三）、PCR扩增产物的检测方法扩增产物的检测

29、方法 凝胶凝胶凝胶凝胶电电泳：泳：泳：泳：琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳法泳法泳法泳法、聚丙、聚丙、聚丙、聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶电电泳法泳法泳法泳法 PCR-PCR-限制性片段限制性片段限制性片段限制性片段长长度多度多度多度多态态性分析法（性分析法（性分析法（性分析法（PCR-RFLPPCR-RFLP）单链单链构型多构型多构型多构型多态态性分析法（性分析法（性分析法（性分析法（PCR-SSCPPCR-SSCP）核酸探核酸探核酸探核酸探针杂针杂交法交法交法交法 PCRPCR产产物物物物测测序序序序 PCR-OLAPCR-OLA（PCR-oligonucleotideli

30、gationassay)PCR-oligonucleotideligationassay)荧荧光光光光PCRPCR 第五十四页，本课件共有108页1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 制胶制胶制胶制胶加加样电泳泳紫外光紫外光检测第五十五页，本课件共有108页 特点：特点：特点：特点：分辨力高，分辨力高，分辨力高，分辨力高，长长度度度度仅仅相差相差相差相差1bp1bp的的的的DNADNA分子即可分开；分子即可分开；分子即可分开；分子即可分开；上上上上样样量量量量远远大于大于大于大于琼琼脂糖凝胶；脂糖凝胶；脂糖凝胶；脂糖凝胶；回收的回收的回收的回收的DNADNA纯纯度高；度高；度高；度高；采采采采用用

31、用用银银染染染染色色色色DNADNA或或或或RNARNA，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，比比比比琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶电电泳泳泳泳中中中中EBEB染染染染色色色色法法法法高高高高2-52-5倍倍倍倍，而且避免而且避免而且避免而且避免EBEB易退色的弱点。易退色的弱点。易退色的弱点。易退色的弱点。用用用用途途途途：PCRPCR扩扩增增增增指指指指纹纹图图、多多多多重重重重PCRPCR、PCRPCR产产物物物物限限限限制制制制性性性性片片片片段段段段长长度度度度多多多多态态性性性性（PCR-RFLPPCR-RFLP）分析。）分析。）分析。）分析。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝

32、胶电泳第五十六页，本课件共有108页3.PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)据据据据目目目目的的的的基基基基因因因因序序序序列列列列可可可可查查出出出出所所所所包包包包含含含含的的的的酶酶切切切切位位位位点点点点，用用用用相相相相应应的的的的限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶消消消消化化化化PCRPCR扩扩增增增增产产物物物物，然然然然后后后后进进行行行行电电泳泳泳泳，观观察察察察消消消消化化化化片片片片段的大小是否与序列段的大小是否与序列段的大小是否与序列段的大小是否与序列资资料相符。料相符。料相符。料相符。

33、用途：用途：用途：用途：传传染病病原体基因分型染病病原体基因分型染病病原体基因分型染病病原体基因分型 人人人人类类基因的基因的基因的基因的变变异性研究。异性研究。异性研究。异性研究。第五十七页，本课件共有108页4.单链构型多态性分析法单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCPPCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）将将PCRPCR产产物双物双物双物双链链DNA（dsDNAdsDNA）变性性为单链DNA（ssDNAssDNA），加），加），加），加样样于于于

34、于变变性聚丙性聚丙性聚丙性聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶进进行行行行电电泳，由泳，由泳，由泳，由于于于于DNADNA分子在凝胶中的分子在凝胶中的分子在凝胶中的分子在凝胶中的电电泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空泳迁移率与其分子量和空间间结结构有关，而空构有关，而空构有关，而空构有关，而空间结间结构又与构又与构又与构又与ssDNA序列有关。因此，序列有关。因此，电泳泳结束后，束后，ssDNAssDNA带位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。物序列的差异。第五十八页，本课件共有108页5.核酸探针杂交法核酸探针杂交法点点杂交交反向点反向

35、点杂交交微孔板微孔板杂交交Southern印迹印迹杂交交第五十九页，本课件共有108页点杂交（点杂交（dotblot）原原原原理理理理：将将将将扩扩增增增增产产物物物物变变性性性性后后后后直直直直接接接接点点点点在在在在尼尼尼尼龙龙膜膜膜膜或或或或硝硝硝硝酸酸酸酸纤纤维维素素素素膜膜膜膜上上上上，再再再再用放射性或非放射性用放射性或非放射性用放射性或非放射性用放射性或非放射性标记标记物物物物标记标记的寡核苷酸探的寡核苷酸探的寡核苷酸探的寡核苷酸探针针与之与之与之与之杂杂交。交。交。交。探探探探针针：放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素标记标记探探探探针检测针检测的敏感、特异，具有不

36、的敏感、特异，具有不的敏感、特异，具有不的敏感、特异，具有不稳稳定性和放射性危害。定性和放射性危害。定性和放射性危害。定性和放射性危害。非非非非放放放放射射射射性性性性物物物物质质（如如如如生生生生物物物物素素素素、地地地地高高高高辛辛辛辛、荧荧光光光光素素素素等等等等）标标记记的的的的探探探探针针稳稳定定定定性性性性高高高高、使使使使用用用用安安安安全全全全、检检测测速度快速度快速度快速度快 用途：主要用于用途：主要用于用途：主要用于用途：主要用于PCRPCR产产物特异性物特异性物特异性物特异性鉴鉴定及定及定及定及变变异分析。异分析。异分析。异分析。第六十页，本课件共有108页反向点杂交反向

37、点杂交(reversedotblot)原原原原理理理理：使使用用带有有标记物物的的引引物物进行行PCR扩扩增增增增，然然然然后后后后将将将将扩扩增增增增产产物物物物变变性性性性。将将将将不不不不同同同同的的的的寡寡寡寡核核核核酸酸酸酸探探探探针针固固固固定定定定在在在在尼尼尼尼龙龙膜膜膜膜上上上上，用用用用变变性性性性的的的的PCR产产物与之物与之物与之物与之杂杂交。交。交。交。探探探探针针：严严格格格格设计设计，具有相同的，具有相同的，具有相同的，具有相同的杂杂交反交反交反交反应应条件。条件。条件。条件。用用途途：反反向向点点杂交交特特别适适用用于于遗传性性疾疾病病多多个个位位点点的的点点突

38、突变分析。分析。结结果分析：果分析：果分析：果分析：正常正常正常正常纯纯合子合子合子合子 突突突突变纯变纯合子合子合子合子 杂杂合子合子合子合子第六十一页，本课件共有108页微孔板杂交微孔板杂交(microplatehybridization)(microplatehybridization)夹夹心心杂杂交交第六十二页，本课件共有108页荧光探针杂交法荧光探针杂交法目前目前临床上常用床上常用荧光探光探针法来法来检测PCR产物，物，主要的方法有主要的方法有TaqMan技技术、分子信、分子信标技技术、复合探复合探针法等。法等。（定量（定量PCR详述）。述）。第六十三页，本课件共有108页South

39、ern印迹杂交印迹杂交(Southernblot)第六十四页，本课件共有108页6.PCR-ELISA引物双引物双标记：生物素：生物素/地高辛、地高辛、地高辛、地高辛、荧荧光素光素光素光素引物引物55端端端端标记标记生物素生物素生物素生物素+RNA+RNA探探针标记地高辛地高辛 将将将将一一一一寡寡寡寡核核核核酸酸酸酸探探探探针针固固固固定定定定于于于于微微微微孔孔孔孔板板板板作作作作为为捕捕捕捕获获探探探探针针，变变性性性性的的的的PCR产产物物物物单单链链的的的的某某某某一一一一区区区区域域域域与与与与之之之之杂杂交交交交后后后后，此此此此单单链链间间接接接接地地地地固固固固定定定定于于于

40、于微微微微孔孔孔孔板板板板上上上上。再再再再用用用用一一一一非非非非放放放放射射射射性性性性标标记记物物物物标标记记（如如如如生生生生物物物物素素素素）的的的的检检测测探探探探针针与与与与固固固固定定定定于于于于微孔板的微孔板的微孔板的微孔板的PCRPCR产产物物物物单链单链的另一区域的另一区域的另一区域的另一区域杂杂交。交。交。交。第六十五页，本课件共有108页7.PCR产物测序产物测序方法：方法：双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸链链末端末端末端末端终终止法止法止法止法 化学裂解法化学裂解法化学裂解法化学裂解法用途：目前一般多用于科研用途：目前一般多用于科研第六十六页，本课件

41、共有108页五、五、PCR常常见问题无扩增产物无扩增产物非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾假阳性假阳性第六十七页，本课件共有108页PCR常见问题之一常见问题之一无扩增产物无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短原因原因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整

42、浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚体和重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物链内二级结构）或者换一管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照正对照(marker?)(marker?)有条带，而样品则无有条带，而样品则无；第六十八页，本课件共有108页PCR常见问题之二常见问题之二 非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第六十九页，本课件共有108页PC

43、R常见问题之二常见问题之二1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多原因原因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢式重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增第七十页，本课件共有108页PCR常见问题之

44、三常见问题之三 拖尾(与非特异性扩增条带明显不同，非特异性扩增带有明显的条带分隔。)现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M12第七十一页，本课件共有108页PCR常见问题之三常见问题之三1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多原因原因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTP

45、dNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾第七十二页，本课件共有108页PCR常见问题之四常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。使用带有污染的试剂。使用带有污染的试剂。公用试剂如液体石蜡等污染。公用试剂如液体石蜡等污染。操作时手套引起的交叉污染。操作时手套引起的交叉污染。加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有PCRPCR产物污产物污染，可用有

46、滤筛的吸头避免此类污染。染，可用有滤筛的吸头避免此类污染。实验室污染。实验室污染。现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物第七十三页，本课件共有108页 对策：PCRPCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均高压除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均高压灭菌。灭菌。TipTip头、头、EppendorfEppendorf管等最好一次性使用。管等最好一次性使用。操作人员必须戴手套进行操作。操作人员必须戴手套进行操作。试剂小量分装保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，防试剂小量分装

47、保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖时液体止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖时液体溅出。溅出。第七十四页，本课件共有108页引物二聚体 vv两两两两个个个个相相相相同同同同的的的的或或或或不不不不同同同同的的的的引引引引物物物物分分分分子子子子之之之之间间有有有有较较多多多多的的的的碱碱碱碱基基基基配配配配对对，特特特特别别是是是是引物引物引物引物33端有互端有互端有互端有互补补区。区。区。区。vv引物模板比例太高，可增加模板用量。引物模板比例太高，可增加模板用量。引物模板比例太高，可增加模板用量。引物模板比例太高，可增加模板用量。vv退

48、火温度退火温度退火温度退火温度过过低。低。低。低。vv热热循循循循环环次数次数次数次数过过多。多。多。多。PCR常见问题之五常见问题之五第七十五页，本课件共有108页9.7PCR技术的发展技术的发展 巢式巢式巢式巢式PCRPCR（nestedPCRnestedPCR）逆逆逆逆转录转录PCRPCR（reversetranscription-PCRreversetranscription-PCR，RT-PCRRT-PCR）多重多重多重多重PCR(multiplexPCR)PCR(multiplexPCR)重重重重组组PCR(recombinantPCR)PCR(recombinantPCR)锚锚定

49、定定定PCRPCR（anchoredPCR,A-PCRanchoredPCR,A-PCR）不不不不对对称称称称PCRPCR（asymmetricPCRasymmetricPCR）反向反向反向反向PCRPCR（inversePCRinversePCR）扩扩增增增增长长片段片段片段片段PCRPCR（longPCRlongPCR，long-distancePCRlong-distancePCR）免疫免疫免疫免疫PCR(immuno-PCR)PCR(immuno-PCR)定量定量定量定量PCRPCR六、六、PCR技技术的主要的主要类型型第七十六页，本课件共有108页（1）巢式）巢式PCR（nested

50、PCR）第七十七页，本课件共有108页（2）逆逆 转转 录录RT-PCR（reverse transcription-PCR）原原原原理理理理：先先先先在在在在逆逆逆逆转转录录酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下、以以以以mRNA为模模板板合合成成互互补的的cDNA（complementarycomplementaryDNADNA），再再以以cDNA为为模板模板模板模板进进行行行行PCRPCR反反应。是是一一种种快快速速、简便便、敏敏感感性性极极高高的的检测mRNAmRNA表表达达的的方法。方法。第七十八页，本课件共有108页逆转录酶：逆转录酶：AMV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为4