质粒载体.ppt

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1、三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒定义：定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋是一类小型闭合环状核外双螺旋DNADNA分子，能独立于细胞核分子，能独立于细胞核进行自主复制。进行自主复制。大小：大小：约为约为2100102100106 6DaltonDalton，上面携带有数个到数十个甚至上百上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。个基因。性质：性质：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以通过交换掺入染色体上，以附加体（附加体（episomeepisome）的的形式存在；形式存在；质粒是一种质粒是一种复

2、制子（复制子（repliconreplicon），根据自我复制能力的不同，可根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒严紧型质粒的复的复制受细胞核控制，与染色体制受细胞核控制，与染色体DNADNA复制相伴随复制相伴随,一般一个寄主细胞内只一般一个寄主细胞内只有少数几个（有少数几个（1515）个拷贝；）个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒的复制不受细胞核控制，的复制不受细胞核控制，在染色体在染色体DNADNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到可以达到1020

3、010200个或更多。个或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的对于细菌的生存并不是必要的功能多样化功能多样化三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒功能：功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生进行细胞间接合，并带有

4、一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围存在范围：很多细菌如：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等根癌土壤杆菌等制备：制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。和蛋白质等步骤。鉴定：鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切

5、图谱等方法切图谱等方法三、原核生物的质粒三、原核生物的质粒几种代表性质粒：几种代表性质粒：1.F因子（因子（fertility factor）：又称致育又称致育因子或性因子，因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体相当于核染色体DNA2%的环状双链的环状双链DNA，足以编码足以编码94个中等大小多肽，其个中等大小多肽，其中中1/3基因（基因（tra区）与接合作用有关。存区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。别。Figure.Represent

6、ative FERTILITY PLASMID.A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.最初发现于痢疾志贺氏菌（最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），），后来发后来发现还存在于现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和和Staphy

7、lococcus中。中。R因子由相连的两个因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定和抗性决定R因子因子（r-determinant），），RTF为分子量约为为分子量约为11106Dalton，控制质粒控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。性基因。R-因子在细胞内的因子在细胞内的copy数可从数可从12个到几十个，分为严个到几十个，分为严紧型

8、和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个个/细胞。细胞。2.R因子（因子（resistence factor）产大肠杆菌素因子。产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约它肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌大肠杆菌素都是由素都是由Col因子编码的。因子编码的。Col因子可分为两类，分别以因子可分为两类，分别以C

9、olE1和和ColIb为代表。为代表。ColE1分子量约为分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多无接合作用，是多copy的；的；ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为分子量约为80106Dalton，它与它与F因子相似，因子相似，具有通具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个个copy。凡带凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受

10、其伤害。从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。3.Col因子因子（colicinogenic factor）v降解性质粒降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解解CAMCAM（樟脑）质粒，樟脑）质粒，XYLXYL（二甲苯）质粒，二甲苯）质粒，SALSAL（水杨酸）质粒，水杨酸）质粒，MDLMDL（扁桃酸）质粒，扁桃酸）质

11、粒，NAPNAP（奈）质粒和奈）质粒和TOLTOL（甲苯）质粒等。甲苯）质粒等。4.降解性质粒降解性质粒即诱癌质粒。即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中中,可引起许多双子叶植物的根癌可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转

12、变成癌细胞。制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借外源基因可借DNA重组技术设法插入到重组技术设法插入到Ti质粒中，并进质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。达到培育植物优良品种的目的。5.Ti质粒质粒（tumor inducing plasmid）是近年来在是近年来在Rhizobi

13、um（根瘤菌属）中发现的根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。上有一系列固氮基因。6.6.巨大质粒巨大质粒（mega质粒）质粒）基基因因：能能够够表表达达和和产产生生基基因因产产物物（蛋蛋白白质质或或RNA）的的DNA序列。序列。原核生物基因系统：原核生物基因系统：启动子（基因）启动子（基因）操纵子操纵子 操纵子（基因）操纵子（基因）基因调控系统基因调控系统 结构基因结构基因 调节基因调节基因细细胞胞水水平平：大大部部分分或或全全部部DNA

14、都都集集中中于于细细胞胞核核或或核核质质体体中中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。学显微镜下不能看到的环状染色体。一些真核生物和原核生物基因组的比较一些真核生物和原核生物基因组的比较生生 物物 单倍体的分子量单倍体的分子量 核苷酸核苷酸 已知染色体数已知染色体数 约数（约数（DaDa）对数对数 基因数基因数

15、 人人 32 32 35 10 35 101212 57 10 57 109 9 4000 4000 黑腹果蝇黑腹果蝇 4 4 7.9 10 7.9 101010 8.0 10 8.0 107 7 50006000 50006000粗糙脉孢菌粗糙脉孢菌7 7 2.8 10 2.8 101010 4.5 10 4.5 107 7 500 500 大肠杆菌大肠杆菌1 1 2.5 10 2.5 109 9 3.8 10 3.8 106 6 1027 1027 噬菌体噬菌体T4T41 1 1.1 10 1.1 108 8 2.0 10 2.0 105 5 135 135 噬菌体噬菌体 1 1 3.2

16、3.2 10107 7 4.8 4.8 10104 4 35 35噬菌体噬菌体MS2MS21 1 1.1 10 1.1 106 6 3.5 10 3.5 103 3 3 3遗传密码遗传密码：指：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序链上各个核苷酸的特定排列顺序密码子（密码子（codencoden）：由由3 3个核苷酸顺序决定，负个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位载遗传信息的基本单位不对称转录不对称转录：只有：只有DNADNA双链的一股才作为有意双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。义链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子起始密码子：AUGAUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨

17、酸甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子终止密码子：UAAUAA、UGAUGA、UAGUAG核外核外DNA的种类的种类核外染色核外染色体体真真核核生生物物的的“质质粒粒”原原核核生生物物的质粒的质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体（质体）（质体）中心体中心体动动 体体共生生物：共生生物：卡巴颗粒卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 突变（突变（突变（突变（mutationmutation ）：）：）：）：指生物体的表型突然发生的可遗传的指生物体的表型突然发

18、生的可遗传的变化。变化。染色体畸变染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化细胞学上可以看到染色体的变化突变突变 基因突变基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化细胞学上看不到遗传物质的变化突变体突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（野生型（wild type）：）：从自然界分离到的任何微生物在其发从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株生突变前的原始菌株依表型的改变分为：依表型的改变分为：形态突变型形态突变型营养缺陷型营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才

19、能生长的突变并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。类型。发酵突变型发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性理因子的抗性条件致死突变型条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变因突变而引起的抗原结构发生改变产量突变型产量突变型 （一）基因突变的类型（一）基因突变的类型按按是否比较

20、容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（选择性突变株（selective mutant）：）：具有选择标记（如营养缺具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离值等，就比较容易检出和分离到。到。非选择性突变株（非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体量突变型、抗原突变型、形态突

21、变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。定义：定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为突变率为101088是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株突变株（mutantmutant，即突变型）的数目来表示。如一个含即突变型）的数目来表示。如一个含10108 8个细胞的群体，当其分裂为个细胞的群体，当其分裂为2102108 8个细胞时，即可平

22、均个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是发生一次突变的突变率也是101088 。突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数突变是突变是独立独立独立独立的的的的。某一基因发生突变。某一基因发生突变不会影响不会影响不会影响不会影响其它基因其它基因其它基因其它基因的突的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变

23、株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（back mutantback mutant或或reverse mutantreverse mutant）或抗性突变株特别是或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。抗药性突变株的方法来加以确定。（二）突变率（二）突变率若干细菌某一性状的自发突变率若干细菌某一性状的自发突变率菌菌 名名 突变性状突变性状突变率突变率E.coliE.coli抗抗T1T1噬菌体噬菌体3 3 101088E.coliE.coli抗抗T3T3噬菌体噬菌体1 1 101077 E.coliE.coli不发酵乳糖不发酵乳

24、糖1 1 10101010E.coliE.coli 抗抗紫外线紫外线1 1 101055Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus 抗青霉素抗青霉素1 1 101077S.aureusS.aureus 抗链霉素抗链霉素1 1 101099 Salmonella typhiSalmonella typhi抗抗2525 g/Lg/L链霉素链霉素1 1 10106 6 Bacillus megateriumBacillus megaterium 抗异烟肼抗异烟肼5 5 101055 （三）突变的特点（三）突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。适用于

25、整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性稀有性：突变率低且稳定。：突变率低且稳定。独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。可逆性可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（变（forw

26、ard mutation），），从突变株回到野生型的从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（过程则称为回复突变或回变（back mutation或或reverse mutation）。）。（四）基因突变的自发性和不对应性的证明（四）基因突变的自发性和不对应性的证明在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的

27、，突变的原因和突变的性状（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是间是相对应的，并认为这就是“定向变异定向变异”，也有人称它为，也有人称它为“驯化驯化”或或“驯养驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。在一起，所以难以探究问题的实质。从从19431943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在年起，经过几个严密而

28、巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。变量试验变量试验又称波动又称波动试验或彷试验或彷徨试验。徨试验。19431943年，年，S.E.S.E.Luria Luria 和和M.M.Delbrck Delbrck 根据统计根据统计学原理，学原理，设计了左设计了左方的实验。方的实验。1.变量试验变量试验fluctuation test2.涂布试验原原理理与与变变量量试试验验相相同同，方方法法更更为为简简便便，且且可可计计算算突突变变率率。涂布试验中突变率的计算涂布试验中突变率的计算初始接

29、种量：初始接种量：5 105 104 4 个个/皿皿培养培养5 5小时，繁殖了小时，繁殖了12.312.3代，每个微菌落约含代，每个微菌落约含51005100个细菌个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：这时，每个平皿上的细胞数为：5100 5 105100 5 104 4 2.6 10 2.6 108 8个个/皿皿在在6 6个平板上，比接种时增加的细胞数为：个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 6（2.6 102.6 108 8 5 5 10 104 4）=15.6 10=15.6 108 8在未涂布的平板上共发现在未涂布的平板上共发现2828个突变，故个突变，故突变率突变率=28/15.6 10

30、=28/15.6 108 8=1.8 10=1.8 10 8 83.平板影印培养试验平板影印培养试验（replica plating）19521952年，年，J.LederbergJ.Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。干。平板影印培养法平板影印培养法，是一种能达到在，是一种能达到在一系列培养皿一系列培养皿的的相同位置相同位置上上出现出现相同遗传型

31、菌落相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章印章”上的菌落一上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上型菌株。据报道，用此法可把母平板上1020%1020%量的细菌转移量的细

32、菌转移到丝绒布上，并可利用这一到丝绒布上，并可利用这一“印章印章”接种接种8 8个子培养皿。因个子培养皿。因此，通过影印培养法，就可以此，通过影印培养法，就可以从从从从在非选择性条件下生长的细在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。菌群体中，分离出各种类型的突变株。平平板板影影印印培培养养法法在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。（五）基因突变的机制（五）基因突变的机制基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又变又可分为点突变和畸变。具体类型可分为点突变和畸变。具体类型可归纳如下：可归纳如下：