《质粒与载体》PPT课件.ppt

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1、第三章第三章 质粒与载体质粒与载体1.1.质粒概述质粒概述质粒（质粒（plasmidplasmid）：）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。因子，主要存在于各种微生物细胞中。1.1 1.1 质粒的分子结构质粒的分子结构通常以通常以共价闭合环状的超螺旋双链共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中分子存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNA质粒和质粒和RNA质粒；质粒；疏螺旋体、链霉菌和酵母菌疏螺旋体、链霉菌和酵母菌1.2 1.2 质粒的检测质粒的检测t 提取所有胞内提取所有胞内DNA后电

2、镜观察；后电镜观察；t 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；通常用碱裂解法提取质粒通常用碱裂解法提取质粒1.3 1.3 质粒的命名质粒的命名第第1个字母个字母(小写小写)：p，质粒（质粒（plasmid）;第第2，3 个字母（大写）：人名，实验室名，表型个字母（大写）：人名，实验室名，表型性状或其他特征的英文缩写性状或其他特征的英文缩写;编号（阿拉伯数字）编号（阿拉伯数字）：区别同一类型的不同质粒：区别同一类型的不同质粒例：例：pUC18,pUC191.4 1.4 质粒的主要类型质粒的主要类型质粒与宿主的关系：质粒与宿主的关系：质粒所含的基因对宿主细胞一般是质粒所含

3、的基因对宿主细胞一般是非必需非必需的的；在某些特殊条件下，质粒有时能在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的赋予宿主细胞以特殊的机能机能，从而使宿主得到生长优势从而使宿主得到生长优势。质粒的主要类型质粒的主要类型（P202）质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子致育因子(Fertility factor，F因子因子)抗性因子抗性因子(Resistance factor，R因子因子)产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒毒性质粒(virulence plasmid)代谢质粒代谢质粒(

4、Metabolic plasmid)隐秘质粒隐秘质粒(cryptic plasmid)1.5 1.5 质粒的一般特性质粒的一般特性 非必要遗传物质非必要遗传物质一般控制次要性状，能自我复制并稳定遗传。质粒的一般控制次要性状，能自我复制并稳定遗传。质粒的存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长；存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长；在细胞内的大小和数量不相同在细胞内的大小和数量不相同一般大质粒（分子量一般大质粒（分子量60M60M道尔顿）拷贝数少，小质粒道尔顿）拷贝数少，小质粒（分子量（分子量15M15M道尔顿）拷贝数较多。氯霉素等可抑制道尔顿）拷贝数较多。氯霉素等可抑制染色体染色体DNADNA

5、复制而使质粒拷贝数扩增；复制而使质粒拷贝数扩增；互不相容性互不相容性属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞并存；胞并存；具有可转移性及稳定性具有可转移性及稳定性以较高频率（以较高频率（1010-6-6），通过细胞间的接合作用或其），通过细胞间的接合作用或其它机制从供体转移至受体，在细胞分裂前复制，均等它机制从供体转移至受体，在细胞分裂前复制，均等分配至子细胞中；分配至子细胞中；可整合性可整合性在一定条件下，质粒可以整合到染色体在一定条件下，质粒可以整合到染色体DNADNA上，并可重上，并可重新脱落下来新脱落下来 可重组性可重组性不同质粒或质粒

6、与染色体上的基因可以在细胞内或细不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换并形成新的重组质粒；胞外进行交换并形成新的重组质粒；可消除性可消除性经高温、吖啶橙或丝裂霉素经高温、吖啶橙或丝裂霉素C C等可以消除质粒，宿主等可以消除质粒，宿主细胞同时也失去质粒所携带的表型性状细胞同时也失去质粒所携带的表型性状；耐碱性耐碱性与染色体与染色体DNADNA相比，质粒有较高的耐碱性，调相比，质粒有较高的耐碱性，调pHpH至至12.4 12.4，可使染色体，可使染色体DNADNA变性，通过离心将其与质粒变性，通过离心将其与质粒分离分离2.2.质粒的复制和调节质粒的复制和调节2.1 2.1 质粒

7、的大小质粒的大小常见质粒大小的范围为常见质粒大小的范围为1 1200kb200kb，个别大质粒可达，个别大质粒可达8008001000 kb1000 kb质粒的大小常用分子量质粒的大小常用分子量MDMD或碱基对数或碱基对数kbkb来表示。来表示。1MD1MD的双链的双链DNA1.65kbDNA1.65kb。未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。最精确的测定需要对质粒最精确的测定需要对质粒DNADNA作序列分析，然后从所含碱基作序列分析，然后从所含碱基数目

8、来直接推算出其大小和分子量数目来直接推算出其大小和分子量。2.2 2.2 质粒的拷贝数质粒的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数(copy number)(copy number)不同质粒在细胞中的拷贝数各异。不同质粒在细胞中的拷贝数各异。一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量大的一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量大的拷贝数低，分子量小的拷贝数高。如拷贝数低，分子量小的拷贝数高。如F F因子这一类质粒，每个因子这一类质粒，每个细胞中只有细胞中只有1 12 2个拷贝的质粒，它们的复制受到严格控制，个拷贝的质粒，

9、它们的复制受到严格控制，称为严紧型质粒称为严紧型质粒(stringent plasmids)(stringent plasmids)或低拷贝质粒。或低拷贝质粒。分子量小的分子量小的(如如ColE1ColE1质粒质粒)拷贝数高，每个细胞中有拷贝数高，每个细胞中有1010100100个个拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒质粒(relaxed plasmids)(relaxed plasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大或高拷贝质粒。基因工程中为获得大量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。量的基因产物所用的载体

10、质粒便是这类松弛型质粒。2.3 2.3 质粒复制的模型质粒复制的模型复制子复制子(replicon)(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点至少需要有一个复制起点,即即oriori位点位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为大肠杆菌染色体的复制起点称为oriCoriC，质粒的复制起点叫做，质粒的复制起点叫做oriVoriV。质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过型复制和滚环

11、复制两种方式之一进行的，型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以其中以型复制为主。在型复制为主。在型复制中，有单向复制和双向复制两型复制中，有单向复制和双向复制两种类型，如种类型，如R1R1、R100R100等的复制是单向的，而等的复制是单向的，而F F和和R6kR6k是双向复制是双向复制类型。类型。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。而而复复制制所所需需要要的的其其它它蛋蛋白白，如如DNADNA聚聚合合酶酶、连连接接酶酶、引引物物酶酶、连连接接酶酶、RNA-HRNA-H酶酶、解解旋旋酶酶(gyrase)(gyrase)和和拓拓扑扑异异构构

12、酶酶I I、dnaBdnaB 和和dnaCdnaC基基因因产产物物(沿沿链链延延伸伸的的DNADNA合合成成酶酶)等等都都是是利利用用寄主的复制酶体系。寄主的复制酶体系。复制起点复制起点(ori)ori)区的功能区的功能 oriori位点周围的小范围位点周围的小范围DNADNA是质粒复制所必需的是质粒复制所必需的在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点位点-ori-ori序列附近序列附近将将oriori区克隆到一个不能自主复制的环状双链区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNADNA分子上并引分子上并引入原核细胞后入原核细胞后,

13、该重组该重组DNADNA具有自主复制能力。具有自主复制能力。pBR322pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来源的来源的DNADNA片段连接起来而构成的环状质粒片段连接起来而构成的环状质粒：来源于来源于ColE1ColE1的衍生质粒的衍生质粒pMB1 pMB1 的的DNADNA复制起点复制起点(oriori)及及roprop区；区；来源于质粒来源于质粒pSC101pSC101的四环素抗性基因的四环素抗性基因(tettetr r)；来源于转座子来源于转座子Tn3Tn3的氨卞青霉素抗性基因的氨卞青霉素抗性基因(ampampr r)

14、。oriori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒的拷贝数。质粒如质粒如ColE1ColE1类型的质粒，包括类型的质粒，包括pBR322pBR322、pETpET和和pUCpUC具具有较窄的寄主范围，这些质粒只在有较窄的寄主范围，这些质粒只在E.coliE.coli 及一些亲缘关系较及一些亲缘关系较近的如沙门氏菌近的如沙门氏菌(SalmonellaSalmonella)和克氏杆菌和克氏杆菌(KlebsiellaKlebsiella)中复制。中复制。RP4RP4、RK2RK2和和RSF1010RSF1010及从及从G+G+

15、细菌中分离的滚环复制的质粒都细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围属于广寄主范围(broad host range)(broad host range)质粒。广寄主范围的质粒质粒。广寄主范围的质粒一般是编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄一般是编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。主的功能。2.4 2.4 质粒复制的调控质粒复制的调控 质粒的复制机制同染色体基本相同质粒的复制机制同染色体基本相同 质粒的复制的调控主要是控制拷贝数质粒的复制的调控主要是控制拷贝数 质粒的复制质粒的复制复制调控机制一般采用直接或间接复制调控机制一般采用直接或间接 的负调控机制。的负调

16、控机制。负调控因子可以是蛋白质、负调控因子可以是蛋白质、RNARNA或或DNADNA重复序列重复序列。抑制物抑制物-靶位调控靶位调控(inhibitor-target regulation(inhibitor-target regulation)其特点是依赖一小段反向转录的其特点是依赖一小段反向转录的RNARNA作为抑制物，作为抑制物，通过它与目标通过它与目标RNARNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。的互补结合以阻止质粒复制的起始。目标目标RNARNA是质粒是质粒DNADNA复制的引物或是用于编码复复制的引物或是用于编码复制所需的制所需的RepRep蛋白的蛋白的mRNAmRNA。属于这一复制

17、调控类型的质粒包括属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1ColE1、pT181pT181、p15Ap15A、pMB1pMB1、RSF1010RSF1010、loDF13 loDF13、R1R1等等ColE1ColE1质粒质粒复制调控复制调控 ColE1ColE1质粒复制调控质粒复制调控 6.6kb6.6kb的小质粒，拷贝数的小质粒，拷贝数10-2010-20 复制不需要质粒编码蛋白质，而是依赖于宿主的复制酶体系复制不需要质粒编码蛋白质，而是依赖于宿主的复制酶体系 从一个固定原点从一个固定原点oriVoriV开始，进行单向复制开始，进行单向复制。ColE1ColE1的复制需要一个的复制需要一个

18、RNARNA引物。引物。RNARNA是质粒复制的引物前体是质粒复制的引物前体,P,PRNARNA是编码是编码RNARNA的启的启动子动子,RNA,RNA转录是在转录是在RNARNA聚合酶作用下，从复制原点上聚合酶作用下，从复制原点上游方向游方向555bp 555bp 处起始转录处起始转录(将将RNARNA与与DNADNA的转换处定为复的转换处定为复制原点制原点)。当这个。当这个RNARNA延伸至复制原点延伸至复制原点oriVoriV时，由时，由RNAase H RNAase H 将将RNARNA切断，从而产生切断，从而产生3-OH3-OH末端。然后末端。然后DNADNA聚合酶以此为引物合成聚合

19、酶以此为引物合成DNADNA，复制从起始点，复制从起始点oriVoriV开始向右开始向右进行。进行。3553oriVL or Light strandH or Heavy strandNew L Strand synthesised firstONLY 580 bps needed for plasmid to replicate in host cell-555RNAIIRNAI-445RNA PolymeraseRNAII starts at-555 on H strandColE1ColE1的复制的复制-445-5553-445Transcription beyond oriVHybri

20、disation at/near oriV-55533RNAaseH cleaves at oriV2/3 bp accuracy-445ONLY 580 bps needed and ONLY 13 after oriV质粒编码的两个负调控因子质粒编码的两个负调控因子RopRop蛋白质和反义蛋白质和反义RNARNA(RNA)(RNA)，控制了，控制了DNADNA复制过程中所必需的引物复制过程中所必需的引物的合成。的合成。在在ColE1ColE1复制原点上游方向复制原点上游方向445 bp445 bp处处(相当于相当于RNARNA的第的第111111个碱基的位置个碱基的位置)处起始转录另一个处

21、起始转录另一个RNARNA分子，分子，其转录方向与其转录方向与RNARNA相反，它是由双链相反，它是由双链DNADNA链上的链上的另一条链另一条链(C-(C-链链)为模板进行转录的，这个为模板进行转录的，这个RNARNA分子称分子称为为RNA IRNA I，属于反义，属于反义RNARNA。上节课的总结上节课的总结1.1.原核生物基因组的特点原核生物基因组的特点2.2.质粒及载体质粒及载体1 1）.质粒的概念及种类质粒的概念及种类2 2）.质粒复制模型质粒复制模型3 3）.质粒复制的调控质粒复制的调控抑制物抑制物-靶位调控靶位调控这个反义这个反义RNA I RNA I 有有111111个碱基与个

22、碱基与RNARNA的的55末端互补，末端互补，这样这样,RNA I,RNA I与与RNARNA互补形成双链互补形成双链RNARNA结构结构,使之不使之不能为能为RNAase HRNAase H所识别所识别(人们通常认为人们通常认为RNAase HRNAase H只识只识别别DNA-RNADNA-RNA杂合双链，而不识别双链杂合双链，而不识别双链RNARNA结构结构)。RNARNA的转录继续进行，不能在分子原点区域产生有的转录继续进行，不能在分子原点区域产生有活性的引物而对复制起负调控作用。因此，活性的引物而对复制起负调控作用。因此，RNA IRNA I控控制着质粒的拷贝数。制着质粒的拷贝数。这

23、个机理解释了这个机理解释了ColEColE质粒的拷贝数调控质粒的拷贝数调控,由于由于RNA IRNA I是由质粒编码合成的是由质粒编码合成的,当质粒的浓度高时当质粒的浓度高时,就会产生较就会产生较多的多的RNA IRNA I分子分子,而高浓度的而高浓度的RNA IRNA I就会来又干扰就会来又干扰RNARNA的加工的加工,从而抑制复制。从而抑制复制。一般当一个细胞中一般当一个细胞中ColEColE的拷贝数达到的拷贝数达到1616时时,就会几乎就会几乎完全抑制质粒的复制。完全抑制质粒的复制。调控蛋白调控蛋白,rop,rop基因位于基因位于 ColE1 ColE1复制原点下游方向不远复制原点下游方

24、向不远处。处。RopRop蛋白增强了蛋白增强了RNA1RNA1和和RNA2RNA2的相互作用，从的相互作用，从而加强了而加强了RNA IRNA I的抑制作用。的抑制作用。反义反义RNARNA对质粒复制的抑制作用，控制着质粒的拷对质粒复制的抑制作用，控制着质粒的拷贝数，反义基因发生突变将会增进引物的形成和质贝数，反义基因发生突变将会增进引物的形成和质粒的复制，即增加其拷贝数。野生型粒的复制，即增加其拷贝数。野生型ColE1ColE1的拷贝数的拷贝数约是约是2020个个/每个细胞，当反义基因发生缺陷时，其每个细胞，当反义基因发生缺陷时，其拷贝数超过拷贝数超过250250，+600 +400 -50

25、0 Rop/Rom Dimer5353RNAase cut3oriVSummary of ColE1 replication controlRNA IRNA IIR1R1质粒复制调控质粒复制调控R1R1质粒约质粒约90kb90kb，拷贝数为每个细胞，拷贝数为每个细胞1-21-2个。个。RepARepA蛋白是质粒复制起始必需的因子。由蛋白是质粒复制起始必需的因子。由repArepA基因编码，有基因编码，有两个转录启动子，两个转录启动子，P PcopBcopB和和P PrepArepA。从。从P PcopBcopB转录产生转录产生CopBCopB和和RepARepA两个产物。从两个产物。从P Pr

26、epArepA 转录仅产生转录仅产生RepARepA。CopBCopB为为PrepAPrepA的阻遏蛋白。的阻遏蛋白。R1R1质粒复制区还有质粒复制区还有copA copA 基因，转录产物为反义基因，转录产物为反义RNARNA，能与，能与repArepA基因产物基因产物RNARNA互补，形成双链互补，形成双链RNARNA，被，被RNaseIIIRNaseIII降解，降解，RepARepA无法合成，抑制质粒复制。无法合成，抑制质粒复制。复制区有复制区有taptap基因，其产物基因，其产物TapTap蛋白为转录活化蛋白，能促进蛋白为转录活化蛋白，能促进RepARepA的合成。的合成。copB co

27、pA tap repA oriV 5335RepressorRNA I antisenseRNA IIShine-Delgarno repARepA initiatesreplicationTap重复子重复子-竞争结合调控竞争结合调控(iteron-binding regulation)(iteron-binding regulation)最常见于质粒如：最常见于质粒如：F F、P1P1、R6k R6k、RK2RK2、RP4RP4和和pSC101pSC101等，是等，是通过蛋白质即通过蛋白质即RepARepA蛋白进行复制调控。蛋白进行复制调控。这些质粒在复制的起始位点这些质粒在复制的起始位点(

28、ori)(ori)和复制基因和复制基因(rep)(rep)附近存在着附近存在着多个长度为多个长度为17-22 bp17-22 bp的的DNADNA短片段短片段(叫做重复子叫做重复子,iteron),iteron)，它，它们能与复制必需的们能与复制必需的RepRep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。复制和拷贝数的增加。由于含有重复子序列，这些质粒也叫重复子质粒由于含有重复子序列，这些质粒也叫重复子质粒(Iteron plasmids)(Iteron plasmids)，通常在，通常在oriori区有区有3-73-7个重复子。除此之外个重复子。除此

29、之外,通常在不远处还有这些重复序列。通常在不远处还有这些重复序列。pSC101pSC101是最简单的重复子质粒。是最简单的重复子质粒。pSC101pSC101质质粒复制调控粒复制调控repArepA基因编码的基因编码的RepARepA蛋白是复制起始所必需的，在蛋白是复制起始所必需的，在oriori区有区有3 3个重复子序列，个重复子序列，R1R1、R2R2和和R3R3，RepARepA就是通过与它们的结合就是通过与它们的结合而控制质粒的拷贝数。而控制质粒的拷贝数。RepARepA蛋白是蛋白是pSC101pSC101和许多其它重复子质粒复制所需的唯一和许多其它重复子质粒复制所需的唯一由质粒编码的

30、蛋白质。寄主染色体编码的其它蛋白如由质粒编码的蛋白质。寄主染色体编码的其它蛋白如DnaA,DnaA,DnaB,DnaC DnaB,DnaC 和和DnaGDnaG与与oriori区结合后，质粒的复制才起始。区结合后，质粒的复制才起始。第二种调控机理是由于重复子序列间的相互作用使两个质第二种调控机理是由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起粒偶联在一起,从而抑制了质粒复制的起始从而抑制了质粒复制的起始,这种调控方式被这种调控方式被叫做偶联模型叫做偶联模型(coupling or handcuffing model(coupling or handcuffing model）。）。重复子质粒的

31、复制是通过两种机制进行调控的重复子质粒的复制是通过两种机制进行调控的第一第一,RepA,RepA蛋白通过与自身的启动子区的结合而抑制自身的蛋白通过与自身的启动子区的结合而抑制自身的合成合成,这种调控方式被叫做转录自体调控这种调控方式被叫做转录自体调控(transcriptional(transcriptional autoregulation)autoregulation)。质粒的浓度越高。质粒的浓度越高,合成的合成的RepARepA蛋白就约多蛋白就约多,相应地就越多的抑制自身的合成。因此相应地就越多的抑制自身的合成。因此,RepA,RepA蛋白的浓度总蛋白的浓度总是维持在一定的范围内是维持在

32、一定的范围内,复制的起始受到严格的调控复制的起始受到严格的调控3.3.质粒的稳定性质粒的稳定性(细胞分裂中的质粒分配细胞分裂中的质粒分配)在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配,是导致是导致质粒不稳定性的重要原因。质粒不稳定性的重要原因。要使质粒能够保持稳定的遗传要使质粒能够保持稳定的遗传,至少需要满足下面两至少需要满足下面两个方面的条件个方面的条件:第一是每个世代每个质粒平均都必须第一是每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；第二是当细胞分裂时至少发生一次复制；第二是当细胞分裂时,复制产生复制产生的质粒拷贝必须平均分配到两个子细胞中去。的质粒拷贝必须

33、平均分配到两个子细胞中去。质粒分配到子细胞的途径可分成随机分配质粒分配到子细胞的途径可分成随机分配(random distribution)(random distribution)和主动分配和主动分配(active distribution)(active distribution)两种不同方式。两种不同方式。主动分配的机理主动分配的机理对低拷贝质粒而言，则需要某种特定机制，将细胞分裂与质对低拷贝质粒而言，则需要某种特定机制，将细胞分裂与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。如：粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。如：FR1和和P1。这些质粒的稳定性这些质粒的稳定性：

34、(1)(1)质粒结构中还存在编码主动分配体系质粒结构中还存在编码主动分配体系的的parpar区区 。(2)(2)质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的分离子质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的分离子ParPar区区,又叫做分配区又叫做分配区(partition regions)(partition regions)或分配座位或分配座位(partition(partition locus)locus)是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子细胞中的质粒细胞中的质粒DNADNA序列。序列。在在F F质粒中质粒中parpar区是同复制起点紧密相邻的，而在

35、区是同复制起点紧密相邻的，而在R1R1质粒中则质粒中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进行的。是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进行的。在在F F质粒中，质粒中，parpar区由区由sopAsopA和和sopBsopB两个基因及两个基因及sopCsopC区组成区组成,这这三个因素是质粒分配的基本因素三个因素是质粒分配的基本因素,其中其中sopAsopA和和 sopBsopB 叫做反式叫做反式作用基因作用基因(trans-acting genes)(trans-acting genes)编码反式作用蛋白编码反式作用蛋白,sopCsopC叫做顺叫做顺式作用位点式作用位点(ci

36、s-acting site)(cis-acting site)。顺式作用位点顺式作用位点sopCsopC由由1212个个43 bp43 bp的正向重复序列组成的正向重复序列组成,在每个在每个43 bp43 bp的正向重复序列中的正向重复序列中,又有一对又有一对7 bp7 bp的反向重复序列。的反向重复序列。SopCSopC区的功能类似于真核染色体上的着丝粒区的功能类似于真核染色体上的着丝粒,所以所以 sopC sopC区也区也叫类着丝粒位点叫类着丝粒位点(centrmere-like site)(centrmere-like site)。反式作用蛋白反式作用蛋白SopBSopB与顺式作用位点与

37、顺式作用位点sopCsopC区结合区结合,形成蛋白形成蛋白-核酸核酸复合体复合体,称为分配复合体称为分配复合体(partition complex),(partition complex),参与质粒的分配。参与质粒的分配。质粒质粒DNADNA在位于细胞中央的复制体在位于细胞中央的复制体(replisome)(replisome)的作用下进的作用下进行复制。质粒复制后行复制。质粒复制后,分配蛋白与类着丝粒位点结合形成分分配蛋白与类着丝粒位点结合形成分配复合体。配复合体。然后然后,一种尚未知的结构很快地将质粒拷贝移向细胞的两一种尚未知的结构很快地将质粒拷贝移向细胞的两极极,使复制后的质粒使复制后的

38、质粒DNADNA均等的分配到两个子细胞中。接着均等的分配到两个子细胞中。接着可能是在分配蛋白的作用下可能是在分配蛋白的作用下,使分配后的质粒限定于细胞的使分配后的质粒限定于细胞的特定区域。特定区域。寄主致死体系寄主致死体系F F质粒基因组中控制寄主致死功能的基因质粒基因组中控制寄主致死功能的基因ccdAccdA 和和ccdBccdB,属于同属于同一个自我调节的操纵子一个自我调节的操纵子,分别编码分子量为分别编码分子量为8.3 kDa 8.3 kDa 和和11.7 kDa11.7 kDa的两种蛋白。在含质粒的细胞中的两种蛋白。在含质粒的细胞中,CcdA,CcdA蛋白作为解毒剂专门与蛋白作为解毒剂

39、专门与毒剂毒剂CcdBCcdB蛋白结合蛋白结合,并使之失效。并使之失效。在没有在没有CcdACcdA蛋白的情况下蛋白的情况下,CcdB,CcdB蛋白通过抑制蛋白通过抑制DNADNA解旋酶的解旋酶的活性活性,或是通过引发解旋酶诱导寄主染色体或是通过引发解旋酶诱导寄主染色体DNADNA发生双链断裂发生双链断裂从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分配。从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分配。在新产生的无质粒的子细胞中在新产生的无质粒的子细胞中,开始的时候是含有开始的时候是含有CcdACcdA和和CcdBCcdB这两种蛋白。但由于无这两种蛋白。但由于无ccdccd操纵子可发生进一步的转录

40、操纵子可发生进一步的转录,因此随后这两种蛋白质的浓度便逐渐下降稀释。因此随后这两种蛋白质的浓度便逐渐下降稀释。毒剂毒剂CcdBCcdB和解毒剂和解毒剂CcdACcdA具有不同的稳定性具有不同的稳定性,是导致分裂后细胞是导致分裂后细胞致死的关键因素。也就是说致死的关键因素。也就是说,CcdA,CcdA蛋白质不稳定蛋白质不稳定,易被蛋白水解易被蛋白水解酶酶 (protease)(protease)降解降解,于是较稳定的于是较稳定的 CcdB CcdB蛋白质便可行使其对寄蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。主细胞的致死作用。随机分配机制随机分配机制ColE1ColE1等多数高拷贝质粒一般没有专门的

41、等多数高拷贝质粒一般没有专门的parpar基因，它们可以基因，它们可以依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。4.4.质粒之间的不相容性质粒之间的不相容性不相容性通常是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选不相容性通常是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常常不能稳定地存在于同一个细胞中，经择性条件下常常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。而含有两种质粒的细胞相对减少。两个质粒如果不能同时稳定地共存于一种细菌细

42、胞中，两个质粒如果不能同时稳定地共存于一种细菌细胞中，则这两个质粒属于同一不相容群，即则这两个质粒属于同一不相容群，即Inc groups；如；如果能够稳定地存在于同一种细胞内，则它们属于不同果能够稳定地存在于同一种细胞内，则它们属于不同的的不相容群。不相容群。RP4和和RK2为为IncP质粒，不能稳定地共存于大肠杆质粒，不能稳定地共存于大肠杆菌细胞中，而菌细胞中，而RSF1010属于属于IncQ，因此能与，因此能与RK2共存共存大肠杆菌细胞中大肠杆菌细胞中 质粒的不相容性与质粒复制起始密切相关质粒的不相容性与质粒复制起始密切相关不同的不相容群的两质粒不同的不相容群的两质粒相同的不相容群的两质

43、粒相同的不相容群的两质粒 质粒的不相容性与质粒分配也有关系质粒的不相容性与质粒分配也有关系5.5.质粒的转移性质粒的转移性根据质粒的转移性，质粒可分为转移性和非转移性两类根据质粒的转移性，质粒可分为转移性和非转移性两类转移性质粒是指质粒能自动的从一个细胞转移到转移性质粒是指质粒能自动的从一个细胞转移到另一个细胞另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体甚至还能带动供体细胞的染色体DNADNA向向受体细胞转移受体细胞转移,这类质粒常常被叫做自主转移质粒这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissible plasmid)(self-transmissible plasmid)。如：

44、。如：F F质粒。质粒。有些质粒虽然不能自主转移有些质粒虽然不能自主转移,但能被其它一些自主转但能被其它一些自主转移质粒所转移移质粒所转移,这类质粒又被叫做可移动质粒这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmids)(mobilizable plasmids)。如。如ColE1ColE1质粒质粒自主转移质粒的特点自主转移质粒的特点大肠杆菌的大肠杆菌的F F质粒、质粒、R1R1、R100R100、ColVColV、ColIb-P9ColIb-P9、R6kR6k、RP4 RP4，天蓝色链霉菌的致育质粒天蓝色链霉菌的致育质粒SCP1SCP1和和SCP2SCP2，粪链球菌的致育质粒

45、，粪链球菌的致育质粒 pAD1 pAD1和豌豆根瘤菌的共生质粒和豌豆根瘤菌的共生质粒 pJB5JI pJB5JI等均属于自主转移质粒。等均属于自主转移质粒。G G细菌中的转移质粒多是低拷贝的大质粒，其中较小的细菌中的转移质粒多是低拷贝的大质粒，其中较小的R6kR6k质粒也有质粒也有38 kb38 kb。G G 细菌如链霉菌，除细菌如链霉菌，除SCP1SCP1是巨大质粒外，很多转移质粒是巨大质粒外，很多转移质粒都是都是10 kb10 kb左右的小质粒，而且真正参与质粒转移的区域只左右的小质粒，而且真正参与质粒转移的区域只有有2 kb2 kb。F F质粒为代表的质粒为代表的G-G-细菌的自主转移性

46、质粒特点细菌的自主转移性质粒特点F F质粒的转移操纵子（质粒的转移操纵子（tratra）含）含2323个基因，大小为个基因，大小为33kb33kb。tratra基因产物与性菌毛形成和杂交对形成有关；有些编码作用基因产物与性菌毛形成和杂交对形成有关；有些编码作用于于oriToriT位点的核酸内切酶；有些基因产物调控质粒转移。位点的核酸内切酶；有些基因产物调控质粒转移。oriT oriT 位点：质粒转移的起点，质粒必须有位点：质粒转移的起点，质粒必须有oriToriT位点才能自主位点才能自主转移。转移。可移动质粒的特点可移动质粒的特点可移动质粒的转移必须利用同一细胞中自主转移质粒编码合成可移动质粒

47、的转移必须利用同一细胞中自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。的性菌毛才能进行。可移动质粒的转移需要两种元件：可移动质粒的转移需要两种元件：bombom位点和位点和mobmob基因。基因。bombom位点位点 ：类似于：类似于F F质粒的质粒的oriToriT序列序列mobmob基因基因 ：功能类似于：功能类似于tratra基因，负责质粒转移。基因，负责质粒转移。momob b基因象许多基因象许多tratra基因一样，基因一样，mobmob基因也编码特异的核酸内基因也编码特异的核酸内切酶，在切酶，在oriToriT位点进行切割，还编码其它一些与位点进行切割，还编码其它一些与DNADNA转移有转

48、移有关的蛋白质关的蛋白质可移动质粒的转移不需要自主转移质粒的共转移可移动质粒的转移不需要自主转移质粒的共转移广寄主范围质粒的特点广寄主范围质粒的特点所谓广寄主范围质粒是指质粒能通过接合转作用转所谓广寄主范围质粒是指质粒能通过接合转作用转移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地移到很多不同种甚至不同属的寄主内，并能稳定地存在于这些寄主细胞内。存在于这些寄主细胞内。IncPIncP、IncNIncN、IncQIncQ、IncWIncW组的质粒寄主范围广泛，属于广组的质粒寄主范围广泛，属于广寄主范围质粒寄主范围质粒(broad host range plasmid)(broad host ran

49、ge plasmid)。F F质粒为窄寄主质粒为窄寄主范围质粒。范围质粒。IncPIncP组的质粒常见的有组的质粒常见的有RK2RK2、RP1RP1和和RP4RP4等等 IncPIncP组的质粒的寄主较广组的质粒的寄主较广,IncP,IncP质粒自身或带动其它质粒能质粒自身或带动其它质粒能从大肠杆菌转移到几乎所有的从大肠杆菌转移到几乎所有的G-G-细菌中。细菌中。IncP IncP质粒还能接质粒还能接合转移到合转移到G+G+细菌、酵母、植物中。细菌、酵母、植物中。IncPIncP质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄主质粒虽然能通过接合作用转移到酵母、植物等这些寄主中中,但质粒却不能在

50、这些寄主中复制但质粒却不能在这些寄主中复制,属于转移寄主。属于转移寄主。这类质粒的大小为这类质粒的大小为60kb,60kb,在大肠杆菌中的拷贝数为在大肠杆菌中的拷贝数为4 47 7个，个，oriVoriV是质粒的营养复制区是质粒的营养复制区,这类质粒也具有与接合转移有关这类质粒也具有与接合转移有关的的tra tra 基因和基因和oriToriT位点，含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗位点，含有氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性及四环素抗性。另外性及四环素抗性。另外,质粒上还携带有转座子质粒上还携带有转座子Tn1Tn1和插入和插入序列序列IS21IS21。6.6.克隆载体克隆载体载体：人工构建的负责将外源