专题 2.3 分解纤维素的微生物的分离 .ppt

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1、 课题课题3 3 分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离纤维素：纤维素：棉花棉花是自然是自然界中纤维素界中纤维素含量最高的含量最高的天然产物天然产物 纤维素能被土壤中微生物分解利用，这是因纤维素能被土壤中微生物分解利用，这是因为他们能够产生为他们能够产生纤维素酶纤维素酶讨论：食草动物是怎样消化食物中纤维素的讨论：食草动物是怎样消化食物中纤维素的？在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素。素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素。纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油的能源最有希望

2、替代石油的能源 科学家正致力于研究，怎样科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物，木材及生长更将农业废弃物，木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是航类繁多的生物燃料（甚至是航空燃料）空燃料）阅读阅读P27,P27,小组讨论下面的问题：小组讨论下面的问题：纤维素酶分解纤维素，如何验证？如何纤维素酶分解纤维素，如何验证？如何构成对照？构成对照？取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：实验：纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入10mL0.1mol/L10mL0.1mol/L的醋酸的醋酸 醋酸钠

3、缓冲液醋酸钠缓冲液甲甲 乙乙在甲试管中加入在甲试管中加入1mL1mL醋酸醋酸钠醋酸醋酸钠缓冲液，乙试管加入缓冲液，乙试管加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶将试管放在将试管放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消结果：乙试管的滤纸条消失失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？【思考思考】实验分析：实验分析：P27对照组对照组实验组实验组实验说明：纤维素实验说明：纤维素酶可以分解纤维素酶可以分解纤维素阅读阅读P27-P28P27-P28，小组讨论下面的问题：，小组讨论下面的问题：1

4、.1.纤维素酶如何作用纤维素？（纤维素的组成、纤维素酶如何作用纤维素？（纤维素的组成、分布和纤维素酶的组分、作用）分布和纤维素酶的组分、作用）2.2.有什么方法可以筛选纤维素分解菌？有什么方法可以筛选纤维素分解菌？1.纤维素纤维素纤维素是以一种由纤维素是以一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的高分子首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质2.纤维素酶纤维素酶纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为至少包括三组，一般认为至少包括三组分，即分，即C1酶、酶、Cx酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡

5、萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素（一）纤维素和纤维素酶（一）纤维素和纤维素酶一、基础知识（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1.方法：方法：刚果红染色法刚果红染色法该方法通过该方法通过颜色反应颜色反应直接筛选直接筛选2.原理：原理：刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成_,当纤当纤维素被维素被_分解后，红色复合物无法形分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的成，出现以纤维素分解菌为中心的_,可可以通过以通过_来筛选纤维素分来筛选纤维素分解菌。解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈空白的刚果空白的刚果红培养基红

6、培养基纤维素分解菌在刚果红培养纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的基上形成的透明圈透明圈从功能上看，这是一种什么培养基从功能上看，这是一种什么培养基？鉴别培养基鉴别培养基11【典型例题典型例题】刚果红可以与纤维素形成红色复合物刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上研究人员在刚果红培养基平板上,筛到了几株有透明降解圈的菌落筛到了几株有透明降解圈的菌落(见下图见下图)。图中降解圈大小与纤图中降解圈大小与纤维素酶的维素酶的 有关。有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是图中降解纤

7、维素能力最强的菌株是 (填图中序号填图中序号)。【方法点拨方法点拨】有透明降解菌说明纤维素被纤维素酶有透明降解菌说明纤维素被纤维素酶催化降解，则降解圈大小与纤维素酶催化降解，则降解圈大小与纤维素酶的量与活性有关。降解圈越大，说明的量与活性有关。降解圈越大，说明降解纤维素能力最强降解纤维素能力最强。量与活性量与活性 土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落（一）实验流程（一）实验流程二、实验设计阅读阅读P28P28资料一资料一“土壤取样土壤取样”，小组讨论下，小组讨论下面的

8、问题：面的问题：1.1.取样的环境是怎样的，作出这种选择的理取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？由是什么？2.2.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？纸应该埋进土壤多深？取样环境取样环境1.1.土壤取样土壤取样富含纤维素富含纤维素的环境（树林中多年落叶形成的环境（树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）操作步骤：操作步骤：讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该

9、埋在土壤中多深？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于般应将滤纸埋于深约深约10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。阅读阅读P29P29资料二资料二“选择培养选择培养”，小组讨论下面，小组讨论下面的问题：的问题：1.1.为什么需要为什么需要“选择培养选择培养”这步骤？这步骤？2.2.旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？为什么？3.3.这个培养基对微生物是否具有选择

10、作用？如这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？果具有，是如何进行选择的？4.4.你能否设计一个对照实验，说明选择培养基你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。的作用。2 2、选择培养、选择培养 增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。目的：制备选择培养基操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。171、纤维素分解菌选择培养基属、纤维素分解菌选择培养基属于于_（固体、液体）培养（固体、液体）培养基，原因是基，原因是_【资料二资料二】选择培养选择培养阅

11、读资料二阅读资料二“选择培养基选择培养基”，回答以下几问题：，回答以下几问题：液体液体没有添加琼脂没有添加琼脂2、该培养基对微生物、该培养基对微生物_（具有，不具有）选（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择择作用。如果具有，其选择机制是机制是_ 具有 以纤维素粉为主要以纤维素粉为主要碳源，能分解纤碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖；维素的微生物可以大量繁殖；18若设置一个对照实验说明选择培养的作若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将用，应控制的变量是将_改为改为_。3、你能否设计一个对照实验，说明选择培、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？养基的作用？葡萄糖葡

12、萄糖纤维素粉纤维素粉提示：自变量为培养基的种类，即提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基普通培养基和和选择培养基选择培养基。可用。可用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基与之与之对照对照,或者将纤维素改为葡萄糖。或者将纤维素改为葡萄糖。19为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不适应不适应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作

13、用。203.3.梯度稀释梯度稀释按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养基上的培养基上（1 1）制备）制备鉴别培养基鉴别培养基P29P29（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养倒置培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养

14、物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基水溶性羧甲基纤维素钠纤维素钠)阅读阅读P29P29资料三资料三“刚果红染色法刚果红染色法”，小组讨论下面，小组讨论下面的问题：的问题：1.1.方法一中方法一中NaClNaCl溶液的作用？溶液的作用？2.2.刚果红染色法这两种方法各

15、有哪些优点与不足？刚果红染色法这两种方法各有哪些优点与不足？方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在 时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.5.刚果红染色法刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落即为分解纤维素的菌落。即为分解纤维素的菌落。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但

16、分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能力就强！当然分解纤维素的能力就强！3、鉴别纤维素分解菌的培养基、鉴别纤维素分解菌的培养基刚果红培养基刚果红培养基染色法染色法优点优点缺点缺点方法一方法一方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本是是纤维素分解纤维素分解菌的作用菌的作用操作繁琐，

17、刚果操作繁琐，刚果红可能会使菌落红可能会使菌落之间发生之间发生混乱混乱操作简便，操作简便，不存在菌落不存在菌落混杂问题混杂问题产生产生淀粉酶的微生物淀粉酶的微生物也也产生产生模糊透明圈模糊透明圈，有，有些些微生物能降解色素，形微生物能降解色素，形成明显的透明圈，成明显的透明圈，与纤与纤维素分解菌不易区分维素分解菌不易区分两种方法的比较两种方法的比较有可能有可能刚果红染液刚果红染液把一个菌把一个菌落的菌冲到另一个菌落里落的菌冲到另一个菌落里,这样的话菌落就可能不是单这样的话菌落就可能不是单菌种了菌种了,挑菌摇菌的时候有挑菌摇菌的时候有可能得到混合菌可能得到混合菌思考：本实验课题思考：本实验课题2

18、 2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？课题课题2 2将土样梯度将土样梯度稀释液直接涂布稀释液直接涂布在以尿素为在以尿素为唯一氮源的唯一氮源的选择培养基选择培养基上，上，分离并统计分离并统计菌落。菌落。本课题本课题先选择培养先选择培养，使使纤维素分解菌得到纤维素分解菌得到增殖增殖后，再后，再稀释涂布在鉴别培养基稀释涂布在鉴别培养基上，上，挑选挑选菌落。菌落。土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样?培养的培养的目的目的?选择培养基的选择培养基的特点特点?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌

19、落?鉴别培养基鉴别培养基特点特点?如何鉴别如何鉴别?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；增加纤维素分解菌增加纤维素分解菌浓度，浓度，确保能够从确保能够从样品中分离到纤维样品中分离到纤维素分解菌；素分解菌；液体培养基液体培养基是固体是固体培养基培养基刚果红刚果红染色法染色法实验回顾实验回顾挑选挑选有有透明圈透明圈的的菌落菌落 在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑的菌落，挑取并取并接种接种到纤维素分解菌的到纤维素分解菌的选择培选择培养基养基上，在上，在30300 0C C 37370 0C C培养，可获培养，可获得得纯化培养纯化

20、培养。纯化培养纯化培养31三、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。明可能获得了分解纤维素的微生物。2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土的数量，因此最容易分离得到

21、的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同的分离结果。阅读阅读P30 P30“课题延伸课题延伸”，小组讨论下面的问题：，小组讨论下面的问题：1.1.如何确定分离的是纤维素分解菌？如何确定分离的是纤维素分解菌？2.2.有什么方法可以筛选出纤维素分解酶？有什么方法可以筛选出纤维素分解酶？33 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤维发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 四、课题延伸分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌【课堂小结课堂小结】