细胞融合和单克隆抗体复习.ppt

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1、2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体 杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化过程过程植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁去去 壁壁人人工工诱诱导导方法？方法？植物细胞植物细胞B植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术纤维素酶、纤维素酶、果胶酶等果胶酶等物理法：物理法：离心、振动、电激等离心、振动、电激等化学法：化学法：聚乙二醇等试剂聚乙二醇等试剂筛选筛选回顾回顾有梦想，才有创造人鼠（想像图）如何实现人、动物之间细胞的融合呢？A细胞B细胞人工诱导1.动物

2、细胞融合的概念杂交细胞 动物细胞融合：是指两个或多个细胞融合形成一个单核细胞的过程。一、动物细胞融合技术2、诱导方法、诱导方法物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒举例：举例：仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核灭活的病毒颗粒黏附于灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成单核杂交细胞细胞融合，形成单核杂交细胞有丝分裂有丝分裂4

3、、过程：、过程：动物细胞A动物细胞B诱导，融合诱导，融合杂交细胞AB有丝分裂有丝分裂（膜融合、质融合、核融合）注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞。3、原理：、原理：细胞膜的流动性（AA、AB、BB）6、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。品种培育等的重要手段。特别是利用特别是利用杂交瘤技术杂交瘤技术制备制备单克隆抗体。单克隆抗体。（最主要的应用）5、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。为可能。植物体细胞杂交和动物细胞融

4、合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理细胞融合前细胞融合前的处理的处理诱导方法诱导方法结果结果用途用途意义意义细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞的全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合物理（离心、振动、物理（离心、振动、电刺激）化学电刺激）化学（PEG）物理、化学方法物理、化学方法灭活的病毒灭活的病毒培育新品种培育新品种制备单克隆抗体、病制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等毒疫苗、干扰素等形成杂种植株形成

5、杂种植株形成杂种细胞，形成杂种细胞，生产细胞产品生产细胞产品突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能1.1.什么是抗体？什么是抗体？2.2.主要分布在哪里？主要分布在哪里？3.3.由什么细胞产生由什么细胞产生提问提问？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有发生特异性结合的具有免疫免疫功能的功能的球蛋白球蛋白。二、制备单克隆抗体技术二、制备单克隆抗体技术主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。浆细胞浆细胞4.抗体的传统生产方法：从血清中

6、分离抗体 该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差。多种浆细胞动物体内多种抗体抗原 如何解决这个问题？如何解决这个问题？1 1、设计方案：、设计方案：一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖米尔斯坦和柯勒在在19841984年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖杂交细胞杂交细胞继承了双亲细胞的遗传物质：继承了双亲细胞的遗传物质：既能无限增殖，又能产生特异性抗体既能无限增殖，又能产生特异性抗体米米尔尔斯斯坦坦科科勒勒2.单克隆抗体的制备过程问题思考问题思考Q1Q2细胞两两融合后，有哪些类型？B-B;B-瘤;瘤-瘤哪种是需

7、要的类型，要筛选吗？一选问题思考问题思考Question经过选择培养基筛选的杂交瘤细胞群进行克隆是否就得到产生纯度高的抗体？还需怎么办？有限稀释法稀释多次稀释 对能产生特异性抗体的单个杂交瘤细胞进行克隆，即单细胞克隆。由它产生的抗体，即单克隆抗体。将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。多孔细胞培养板二选抗原（抗原（X）注射到小鼠体内）注射到小鼠体内获取获取经过免疫经过免疫的的B淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞融合融合灭活的病毒、灭活的病毒、PEG多种杂交细胞多种杂交细胞选择性培养基选择性培养基杂交瘤细胞杂交瘤细胞抗体阳性检测抗体阳性检测足够数量的、能产生特定抗体的杂交瘤细胞群足够数量

8、的、能产生特定抗体的杂交瘤细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔培养液培养液小鼠腹水小鼠腹水单克隆抗体单克隆抗体优点：特异性强，灵敏度高，产量大优点：特异性强，灵敏度高，产量大筛选筛选克隆化培养克隆化培养筛选筛选(动物细胞培养技术动物细胞培养技术)(动物细胞融合技术动物细胞融合技术)制备过程归纳如下：制备过程归纳如下：1.注意注意B淋巴细胞是一个系列。（淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）2.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）3.第一次筛选第一次筛选：在：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有B

9、G杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）4.第二次筛选第二次筛选：在：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列 ，每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一单一抗体检测抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤细胞。5.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注

10、射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。6.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。单抗的制备过程要点：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合特异性结合用于用于运载药物：制成运载药物：制成“生物导弹生物导弹”治疗疾病：主要用于癌症治疗治疗疾病：主要用于癌症治疗既不损伤细胞，又减少了用药剂量，既不损伤细胞，又减少了用药剂量，疗效高、毒副作用小的新型药物疗效高、毒副作用小的新型药物优点：准确、高效、简易、快速优点：准确、高效、简易、快速 “生物导弹”单克隆抗体药物 单抗导向，药物为弹头两个过程两个过程动物细胞融合过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体

11、制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势1 1、单克隆抗体是指（单克隆抗体是指（）A.A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B.B.单个单个B B淋巴细胞增殖产生的抗体淋巴细胞增殖产生的抗体 C.C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体 D.D.单个抗体通过克隆化，产生大量抗体单个抗体通过克隆化，产生大量抗体C2 2、“生物导弹生物导弹”是指是指 （）A.A

12、.单克隆抗体单克隆抗体 B.B.杂交瘤细胞杂交瘤细胞 C.C.产生特定抗体的产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞 D.D.在单克隆抗体上连接抗癌药物在单克隆抗体上连接抗癌药物 D练一练练一练3.3.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞 B B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞自身融合细胞骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂

13、交瘤细胞 A.BA.B C.C.D D C4.生产单克隆抗体时，在培养基中加入某种试剂能筛生产单克隆抗体时，在培养基中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞，该试剂的作用是选出杂交瘤细胞，该试剂的作用是A能选择性抑制骨髓瘤细胞的能选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制复制B能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活C能抑制淋巴细胞的能抑制淋巴细胞的DNA复制复制D能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成A作业：作业：完成练习册5在现代生物科技的应用中，需要进行检测与筛在现代生物科技的应用中，需要进行检测与筛选的是（双选）选的是（双选）()A对植物的离

14、体组织进行培养，大规模培育优对植物的离体组织进行培养，大规模培育优良品种良品种B将鼠的骨髓瘤细胞与将鼠的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，制备单淋巴细胞融合，制备单克隆抗体克隆抗体C利用人的皮肤细胞进行体外培养，解决自体利用人的皮肤细胞进行体外培养，解决自体移植皮肤不足的问题移植皮肤不足的问题D将抗虫基因导入植物细胞，培育具有抗虫特将抗虫基因导入植物细胞，培育具有抗虫特性的新植株性的新植株植物组织培养技术植物组织培养技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术基因工程基因工程BD下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产

15、破伤风杆菌抗体的实验方案抗体的实验方案2 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3 3、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5 5、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培培养和养和_培养两个阶段，其中培养两个阶段，其中_代以代以内的细胞可以保持正常的二倍体核型。内的细胞可以保持正常的二倍体核型。制

16、备单克隆抗体制备单克隆抗体B B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代10B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC因为没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生此种抗体的效应因为没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生此种抗体的效应B细胞细胞A A、B B细胞为动物细胞细胞为动物细胞,请据图回答问题请据图回答问题:A细胞细胞B细胞细胞C细细胞胞D细细胞胞(1)(1)若若A A细胞为骨髓瘤细胞，细胞为骨髓瘤细胞，B B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细

17、胞,那么那么D D细胞称为细胞称为 细胞细胞,由由D D细胞连续分裂产生细胞连续分裂产生大量细胞的过程，称为大量细胞的过程，称为 。杂交瘤杂交瘤克隆克隆练一练练一练(2)D(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是合成该物质的场所是 ,它是由它是由 控制合成的控制合成的,合成过程包括合成过程包括 和和 两个重要步骤两个重要步骤.球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转录转录翻译翻译(3)D(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用,与血清抗体相比其优越之处在于与血清抗体相比其优越之处在于 强强 高高.免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)(

18、4)若若A A为人细胞为人细胞,B,B为鼠细胞为鼠细胞,用同位素标记用同位素标记A A细胞膜上细胞膜上的蛋白质的蛋白质,B,B不标记不标记,在在C C细胞时细胞时,检测结果发现整个细检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有胞一半有放射性另一半没有.在在D D细胞时细胞时,检测结果发检测结果发现整个细胞都有放射性现整个细胞都有放射性,请解释原因请解释原因 .构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动 如果把如果把B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起，会有淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起，会有几种融合方式？几种融合方式？B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细

19、胞+B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B淋巴细胞淋巴细胞如下图所示细胞是经如下图所示细胞是经HAT培养基筛选出的能产培养基筛选出的能产生单克隆抗体生单克隆抗体A的杂交瘤细胞，关于该细胞中标的杂交瘤细胞，关于该细胞中标出的三个基因的开闭状态，下列说法正确的是出的三个基因的开闭状态，下列说法正确的是A其中有一个是打开的，其中有一个是打开的，即即A抗体基因抗体基因B其中有两个是打开的其中有两个是打开的C其中有一个是打开的，其中有一个是打开的，即即ATP合成酶基因合成酶基因D其中三个都是打开的其中三个都是打开的B如果不经过有丝分裂,两个来源不同的细胞核不会融合在一起.灭活病毒诱导动物细胞融合的直接产物是两个细胞质融合在一起的细胞,这时候该细胞内有两个细胞核,经过有丝分裂前期的核膜核仁解体,再到末期的核膜核仁重新组成,两个细胞核的染色体才组合在同一个细胞核内,基因才能正常表达返回