实时定量PCR技术realtime PCR课件.pptx

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1、一、实时定量PCR技术原理1.1 技术发展史1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。第1页/共69页实时定量技术的优势污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定性灵活：既可多点测定，又可单点测定第2页/共69页1.2 什么是PCR第3页/共69页典型的P

2、CR四阶段第4页/共69页PCR的理论方程第5页/共69页理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。第6页/共69页扩增曲线第7页/共69页1.3 起点定量与终点定量第8页/共69页不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异。也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96

3、次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR中Ct值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理论依据。第9页/共69页1.4 基本概念CT值C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。第10页/共69页因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度

4、。第11页/共69页CT值与起始DNA浓度的关系第12页/共69页第13页/共69页阈值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。荧光本底信号，我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。第14页/共69页第15页/共69页基线调整规则如果CT值18，不需调整，使用自动分析结果。如果CT值2 ug，分成几管第39页/共69页标准品目的：生成标准曲线，建立CT值

5、与浓度之间的数学关系不要求：数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA,可以使用相同的DNA,也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段要求：5点以上浓度已知PCR效率一致，且接近100%仪器一致反应条件一致：循环参数、同一次实验试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液第40页/共69页标准品制作流程第41页/共69页梯度稀释选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii

6、+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v第42页/共69页PCR效率对定量结果的影响第43页/共69页第44页/共69页管家基因-IPCIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率IPC的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。第45页/共69页在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)的表达量都恒定不变注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高推荐使用Human Endogen

7、ous Control Plate(P/N 4309920)测试不同管家基因的效果常用的内对照有18S rRNA、-actin、GAPDH等第46页/共69页校准荧光ROXROX以固定的浓度配在Master Mix中ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关。校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性和精度。第47页/共69页第48页/共69页样品重复重复次数请遵循统计学的要求小样本统计，n6（n3）未知样品和标准品都要重复所有复管在同样条件下完成PCR第49页

8、/共69页2.2 技术方法及数据第50页/共69页绝对定量与相对定量第51页/共69页绝对定量：绝对标准曲线法第52页/共69页标准品拷贝数的计算待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014第53页/共69页相对定量管家基因校准(Normalization Gene)得出每个细胞中的目的基因目标基因vs.管家基因对照样品校准(Calibrator Sample)得出相对于某个样品的基因表达量,1X sample.处理的vs.未处理的，6hr vs.0 hr,病理vs.正常.第54页/共69页示

9、例第55页/共69页对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双标准曲线法、Ct、2-Ct、用参照基因的Ct法和Pfaffi法，应用每种方法都有适应条件。第56页/共69页目前相对定量普遍采用操作简便的2-Ct分析方法第57页/共69页第58页/共69页CT法计算示例第59页/共69页基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。第60页/共69页熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行，从60

10、升至95，每升高1仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在Tm值下降最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。第61页/共69页三、实时定量PCR技术的应用基因突变分析单基因遗传病诊断，如血友病、地贫SNP扫描疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异药物副反应的预防，如麻醉意外物种鉴定、菌株鉴定各种病毒，细菌，病毒病原体检测，如炭疽菌，E coli.O157第62页/共69页四、常见问题4.1无

11、Ct 值（信号）出现 1、反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号。2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72延伸时采集荧光，Taqman 方法则一 般在退火结束或延伸结束采集信号；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸。5、模板量少：对未知尝试的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。6、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。第63页/共69页4.2 CT值出现过晚1、反应条件不佳：重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加M

12、g离子浓度等。2、PCR各种反应成分的降解或加样量不够。3、扩增产物片段过长：一般采用100-200bp的扩增长度。4.3 标准曲线的线性关系不佳1、加样误差，标准品稀释不呈梯度。2、标准品降解：避免反复冻融。3、引物或探针不佳，重新设计。4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。第64页/共69页4.4 阴性对照也出现明显的扩增1、荧光PCR mix或水被污染。2、引物二聚体的出现：在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。3、反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。4.5 熔解曲线不止一个主峰1、引物设计不佳：二聚体和发夹结构。2、引物浓度不佳。3、退火温度过低

13、。4、Mg离子浓度过高。5、模板中有基因组的污染。第65页/共69页4.6 扩增效率低1、反应试剂中部分成分特别是染料降解。2、反应条件不佳：降低退火温度或三步法。3、反应体系有抑制物：大多为模板中引入，应先适当稀释模板，再加入到体系中，减少抑制物的影响。4.7 重复性不好1、加样不准确。2、仪器的温度均一性不好。3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。第66页/共69页4.8 扩增曲线不正常1、基线等设置不当。2、模板量过多：当扩增曲线在10个循环内起峰时，应稀释100-1000倍后使用。4.9 荧光定量PCR CT值一般在多少后认为模板没扩增？当进入对数期的循环数大于35时，一般认为检测无效，基因没有表达，当进入对数期的循环数在32-35个循环时，需要有至少的个重复才能判断是否能检测到基因的表达。第67页/共69页谢谢谢谢！第68页/共69页感谢您的观看！第69页/共69页